29/04/20161

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Genetica dei Procarioti - 9

Dipartimento di Scienze della Vita CdS Biologia Molecolare e Cellulare (LM-6)

Prof. Laura Marri

ricevimento: previo appuntamento telefonico o e-mail

A.A. 2015-16 The modular and hierarchical composition of MGEs.

Anders Norman et al. Phil. Trans. R. Soc. B 2009;364:2275-2289

MGEs: segmenti di DNA codficanti enzimi o altre proteine che consentono lo spostamento di questi elementi nel genoma (mobilità intracellulare) o tra cellule batteriche (mobilità intercellulare)

Bacteriophages are viruses that infect prokaryotes.

They can function as vehicles for the lateral transmission of genetic information, can genetically modify their host by insertion into the genome (prophages) and can carry genes that encode new functions or modify existing ones.

BACTERIOPHAGES

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MGEs: segmenti di DNA codficanti enzimi o altre proteine che consentono lo spostamento di questi elementi nel genoma (mobilità intracellulare) o tra cellule batteriche (mobilità intercellulare)

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TRASPOSONI

discovered by Barbara McClintock in maize (1940's)

Nobel Prize 1983

Elementi trasponibili

Sequenze che hanno la capacità di muoversi da un sito all’altro del cromosoma

Diversamente dagli altri processi coinvolti nella ristrutturazione genomica, per la trasposizione non c’è nessuna omologia tra le sequenze del sito donatore e accettore

sito donatore sito accettore

1 2

IS elements are pieces of DNA that are thought of as “jumping genes” and usually encode only the transposase that catalyses the transposition event

Elementi IS

Le IS sono unità autonome e codificano solo per le proteine necessarie alla propria trasposizione.

Sono costituenti comuni di cromosomi e plasmidi

Trasposasi

IR IR

IS2, IS3, IS4, IS5 IS1

Escherichia coli 3-12 Shigella 30-40 Serratia 2

{

lunghezza media sequenze IS: 1000-1500 bp lunghezza media IR: 10-25 bp

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 Transposons are pieces of DNA that are thought of as JUMPING GENES as they can frequently change their chromosomal localization.

 They usually encode theTRANSPOSASE that catalyses transposition event and can carry determinants for ANTIBIOTIC RESISTANCE and other properties.

 They are flanked by inverted repeat DNA sequences and have the capability to move within or between replicons.

Elementi trasponibili

Sequenze che hanno la capacità di muoversi da un sito all’altro del cromosoma

Diversamente dagli altri processi coinvolti nella ristrutturazione genomica, per la trasposizione non c’è omologia tra le sequenze del sito donatore e accettore

sito donatore sito accettore

Trasposoni

complessi/composti

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Il processo della trasposizione richiede 3 substrati di DNA:

le due sequenze ripetute alle estremità il DNA bersaglio

hotspots

trasposasi

ogni trasposasi riconosce SOLO le sequenze terminali del proprio trasposone

G GGTTTCCAA GGTTTCCAA A C CCAAAGGTT CCAAAGGTT T

inserzione del trasposone

riempimento delle interruzioni

GGGTTTCCAA A C CCAAAGGTTT

GATCA CTAGT

sito bersaglio

ripetizioni dirette del sito bersaglio GATCA

CTAGT

GATCA CTAGT 3’-OH libero sito bersaglio: sequenza priva di specificità

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6

10

^-6

-10

^-3

/Tn/

generazione

Modalità di spostamento

excisive mechanism (cut-and-paste) es.: Tn5, Tn10

replicative mechanism es.: Tn3, batteriofago Mu

Trasposizione NON replicativa

Tn5, Tn10

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T r a s p o s iz io n e r e p li c a ti v a

Tn3, Mu

transposase makes single-stranded breaks at the ends of the transposon (2) staggered double-stranded breaks are made in the target DNA (1)

target DNA

Tn

the 3’ ends of the transposon are ligated to the 5’ ends of the target DNA (3) the 3’ ends of the transposon are ligated to the 5’ ends of the target DNA (3)

Trasposizone intermolecolare

transposase makes single-stranded breaks at the ends of the transposon staggered double-stranded breaks are made in the target DNA

3’-OH

5’-P

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the 3’ ends of the transposon are ligated to the 5’ ends of the target DNA the 3’ ends of the transposon are ligated to the 5’ ends of the target DNA

Le estremità 3’-OH del ricevente fungono da innesco per la replicazione

3’-OH

At this stage, a single DNA molecule called a cointegrate is present that represents the donor and target DNA separated by two copies of the transposon.

Resolution is catalyzed by a resolvase encoded by the transposon.

The result is one copy of the transposon in both the donor and the target DNA.

Risoluzione dei cointegrati

RESOLVASI

risolve co-integrati, riconosce e ricombina due sequenze res sulla stessa elica di DNA

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Risoluzione dei cointegrati

Conjugative transposons are normally integrated into the chromosome.

They can excise in a precise manner to be subsequently transferred to recipient cells by conjugation and they carry genes required for mating-pair formation and conjugative DNA metabolism that are related to plasmid-encoded conjugation systems

Conjugative transposons

Rappresentazione schematica di Tn916

18032 bp

Enterococcus faecalis

ICE: integrative and conjugative elements

Plasmids, phages or transposons?

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Gli ICE sono normalmente integrati nel cromosoma della cellula ospite e sono replicati e trasmessi alle cellule figlie allo stato integrato come fossero regioni del cromosoma del batterico.

In alcune condizioni gli ICE si possono staccare dal cromosoma batterico, formando un intermedio circolare.

L’intermedio circolare si replica ed un filamento viene trasferito alle cellula ricevente tramite coniugazione. I componenti del sistema di trasferimento sono codificati dall’ICE.

ICE, fiancheggiato da sequenze specifiche, attLe attR, è integrato nel cromosoma dell’ospite in un sito specifico (attB) in corrispondenza del proprio sitoattP.

La ricombinazione sito specifica tra le sequenzeattLe attRcausa l’escissione di ICE circolare una singola elica di ICE è trasferita in una cellula ICE-free tramite il meccanismo del cerchio rotante la DNA polimerasi del ricevente ricostituisce la doppia elica ricombinazione sito specifica tra i sitiattPdi ICE e attBdel cromosoma ricevente.

in verità ….

ICEs have complex regulatory networks to control integration, excision and transfer

Key characteristics of experimentally described ICEs

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The great diversity among ICEs for each functional module suggests that ICEs are unlikely to share one common ancestor. Instead, it seems more likely that different ICE groups arose independently.

Plasmids, phages or transposons?

Vibrio cholerae

I geni essenziali sono distribuiti su due cromosomi

trasporto di zuccheri, ioni metallici e anioni, metabolismo degli zuccheri e la produzione di energia, sistemi a due componenti per la trasduzione del segnale, riparazione del DNA, proteine ribosomali

replicazione, divisione cellulare, trascrizione, traduzione, biogenesi dell’involucro, loci associati con la virulenza

VPI: Vibrio pathogenicity island CTX: cholera-toxin phage

"gene capture system"

sono caratterizzati da:

• un gene (intI)che codifica per l’integrasi;

• una sequenza specifica (attI) utilizzata per l’integrazione integrasi- mediata;

• un promotore orientato verso l’esterno che permette l’espressione del gene integrato.

Gli integroni non sono elementi mobili di per sé come le sequenze IS o i Tn ma sono associati ad elementi trasponibili o a plasmidi coniugativi che li possono veicolare all’interno della stessa specie o tra specie diverse.

Integrase Integration site Sulfonamide resistance Gene cassette

Promotor

Aminoglycoside resistance

INTEGRASI

• Riconosce due sequenze di DNA su due diverse eliche e media la ricombinazione tra loro (ricombinazione sito specifica)

Struttura degli integroni

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Le cassette geniche:

• generalmente contengono un singolo gene fiancheggiato da sequenze specifiche di DNA riconosciute dall’integrasi;

• geni «promoterless» che non si esprimono finchè non vengono integrati nell’integrone e possono essere trascritti dal promotore dell’integrone

recombination site: 59 bp located downstream of a promoterless resistance gene

Genomic islands are large chromosomal regions that are part of the flexible gene pool.

GENOMIC ISLANDS

They represent DNA regions that have been previously transferred by other mobile genetic elements and are present in certain bacteria but are absent in most closely related variants.

They carry one or more genes that can increase the adaptability and versatility of the bacterium.

They contain mobility genes coding for integrases or transposases that are required for chromosomal integration and excision.

Le isole genomiche che hanno in qualche modo aumentato l’adattabilità dell’organismo ricevente sono dette isole di fitness

ISOLE ECOLOGICHE (ecological islands, ECI): codificano per enzimi degradativi e/o resistenza agli antibiotici

ISOLE DI SAPROFITISMO (saprophytic islands, SAI): codificano per adesine e sistemi di cattura del rame

ISOLE DI SIMBIOSI (symbiosis islands, SYI): codificano enzimi per la fissazione dell’azoto

ISOLE DI PATOGENICITÀ (pathogenicity islands, PAI): codificano per fattori di virulenza

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General characteristics of genomic islands (GEIs)

10-100 Kb, GC

int: integrase gene

abc, def, ghi: genes encoding specific functions IS: insertion sequence element

General features of GEIs. GEIs are relatively large segments of DNA whose nucleotide characteristics often differ from the rest of the chromosome.

Mario Juhas et al. FEMS Microbiol Rev 2009;33:376-393

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Various functions encoded by GEIs of the same family.

Mario Juhas et al. FEMS Microbiol Rev 2009;33:376-393

Fattori di virulenza codificati dalle PAI

sistemi di secrezione

interferenza con il sistema immune adesività e colonizzazione

modulatori di funzioni della cellula ospite internalizzazione

sopravvivenza/moltiplicazione intracellulare sottrazione di nutrienti ( es: ferro)

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IslandViewer 3 results page for Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi str.

Bhavjinder K. Dhillon et al. Nucl. Acids Res. 2015;43:W104-W108

• Esempio:

- Salmonella:

proteine flagellari H1, H2

L‘inversione di segmenti di DNA mediante ricombinazione sito- specifica è usata nel controllo dell‘espressione genica

FASE 2

IRL

IRR

• The Hin invertase binds to the 14 bp inverted repeat sequences and flips the fragment.

FASE 1

IRR IRL

• frequency of switching: 10^-4/generation

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FASE 2

FASE 1

PLASTICITÀ GENOMICA

 Trasferimento genico orizzontale (HGT)

 Ricombinazione omologa

 Ricombinazione non omologa

- ricombinazione sito-specifica

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The dynamic view of the prokaryotic world