Genetica dei Procarioti - 1
Dipartimento di Scienze della Vita CdS Biologia Molecolare e Cellulare (LM-6)
Prof. Laura Marri
ricevimento: previo appuntamento telefonico o e-mail A.A. 2015-16
Lezioni frontali
Esercitazioni pratiche
Discussione tema assegnato
Calendario delle Lezioni:
pagina web DSV
Organizzazione dell’insegnamento
Sebbene consigliata, la frequenza non è obbligatoria
Struttura e funzione degli acidi nuleici
Genomi batterici e analisi metagenomica Replicazione del cromosoma e divisione cellulare Riparazione del DNA: risposta SOS
Organizzazione genica
Mutazione e variazione Variazione ed evoluzione Tipi di mutazioni
Isolamento e identificazione dei mutanti
continua …
Contenuti dell’insegnamento
Regolazione dell’espressione genica Controllo trascrizionale Controllo traduzionale Quorum Sensing
Plasmidi
Tipi di plasmidi
Sistemi di classificazione
Trasferimento genico
meccanismi di trasferimento genico HGT in situ
Plasticità genomica Elementi trasponibili Variazione di Fase
continua …
Sfruttamento del potenziale microbico
Ingegneria genetica per l'ottimizzazione di espressione di proteine in batteri (plasmidi, promotori, fusioni, etc.)
Metodi di mutagenesi e protein engineering per l'ottimizzazione dell'attività catalitica di enzimi di interesse industriale
Dr. Immaculada Margarit Y Ros
Valutazione finale Il voto sarà determinato da:
discussione su un tema assegnato: ad ogni studente sarà assegnato un gene di Escherichia coli su cui dovrà redigere una scheda monografica che sarà oggetto di una breve presentazione (5 min) il 3 maggio p.v.
1-
2- Relazione di ogni esercitazione pratica completata in aula (obbligatoria per chi frequenta le attività ) . Le relazioni, ai fini del conseguimento del punteggio previsto, devono essere consegnate entro e non oltre giovedì 12 maggio p.v.
Valutazione finale Il voto finale sarà determinato da:
Il mancato adempimento comporterà una penalizzazione di -1,5 punti sul voto finale totale
Esame scritto di 60 minuti basato su domande 10/11 aperte che richiedono una risposta breve
16 giugno 8 luglio 26 luglio 9 settembre 29 settembre
Le date indicate possono essere suscettibili a modifiche
Appelli 2016
3-
Valutazione finale
Il voto finale sarà determinato da:
Voto finale:
N.B.:
E’ possibile sostenere esclusivamente il compito scritto.
In questo caso il voto massimo raggiungibile sarà di: 27/30
+ +
Testi consigliati per la consultazione
G. Dehò & e. Galli
BIOLOGIA DEI MICRORGANISMI 2aEd. CEA, 2014
Madigan, Martinko, Parker BROCK, BIOLOGIA DEI MICRORGANISMI voll.1, 2, 3 Pearson Italia Milano-Torino, 2012
J.W. Dale & S.F. Park MOLECULAR GENETICS OF BACTERIA 5th Ed. Wiley, 2010
Articoli scientifici
Testi consigliati per la consultazione
http://www.blackwellpublishing.com/trun/default.htm N. Trun &J. Trempy
Fundamental
BACTERIAL GENETICS Wiley-Blackwell, 2003
discussione su un tema assegnato: ad ogni studente sarà assegnato un gene di Escherichia coli su cui dovrà redigere una scheda monografica che sarà oggetto di una breve presentazione (5 min) il 3 maggio p.v.
Esempio:
Protein Name: LacZ, beta-D-galactosidase Pathway: lactose degradation
Gene Name: lacZ
Gene Local Context Regulation Summary
POSITIVE REGULATION NEGATIVE
REGULATION
1866 Mendel scopre I geni 1943 il DNA è il materiale genetico
1951 prima sequenza di una proteina (insulina) 1953 struttura del DNA
1959 struttura della mioglobina
1960s delucidazione del codice genetico 1977 sequenziamento del DNA 1975-79 primi clonaggi di geni umani
1986 sviluppo di un sistema di seq. aut. del DNA 1995 primo genoma completo (Haemophilus influenzae) 1997 Genoma di Escherichia coli
1999 primo cromosoma umano (Chr #22) 2000 Drosophila / Arabidopsis genomi 2001 genomi dell’uomo e di topo
Mice injected with live R cells plus heat-killed S cells die. Live S cells in their blood.
R S
Mice injected with live cells of harmless strain R do not die.
Live R cells in their blood.
Mice injected with live cells of killer strain S die. Live S cells in their blood.
Mice injected with heat- killed S cells do not die.
No live S cells in their blood.
R
Griffith’s Experiments, 1929
Carbohydrates Lipids Proteins RNA DNA
To the Heat-Killed Smooth Type, added enzymes that destroyed…
Avery, McCarty, and MacLeod’s experiments, 1943
S-Type Carbohydrates Destroyed
S-Type Lipids Destroyed
S-Type Proteins Destroyed
S-Type RNA Destroyed
S-Type DNA Destroyed
Conclusion:
DNA was the transforming factor!
Prova biochimica che il fattore trasformante di Griffith era il DNA.
32P remains inside cells Virus particle
coat proteins labeled with 35S DNA being injected into bacterium
Virus DNA labeled with 32P
Labeled DNA being injected into bacterium
35S remains outside cells
Hershey and Chase’s Experiments, 1952
La conferma che il DNA è la sede dell’informazione genetica.
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insieme delle informazioni genetiche che sono costituite dai geni, dalle loro sequenze regolative e dalle sequenze di DNA non codificanti
Genoma
INFORMAZIONE GENETICA NEI PROCARIOTI.
L’informazione genetica della cellula procariotica è costituita dal DNA cromosomale (uno o più cromosomi) e dal DNA extracromosomale (plasmidi).
Cromosomi e plasmidi possono essere sotto forma di molecole sia circolari sia lineari.
I due tipi di DNA possono essere portatori di diverse classi di elementi genetici (genomi virali, plasmidi e trasposoni).
La lisi della cellula batterica, con trattamenti delicati, libera il cromosoma sotto forma di molecola continua di DNA di dimensioni molto superiori alla lunghezza del batterio.
Prokaryotic Chromosomes Eukaryotic Chromosomes
Many prokaryotes contain a single circular chromosome
Eukaryotes contain multiple linear chromosomes
P. chromosomes are condensed in the nucleoid via DNA supercoiling and the binding of various architectural proteins
E. chromosomes are condensed in a membrane-bound nucleus via histones
Transcription and translation occur simultaneously
Transcription occurs in the nucleus, and translation occurs in the cytoplasm
Most prokaryotes contain only one copy of each gene (i.e., they are haploid).
Most eukaryotes contain two copies of each gene (i.e., they are diploid).
Nonessential prokaryotic genes are commonly encoded on
extrachromosomal plasmids
Extrachromosomal plasmids are not commonly present in eukaryotes.
P. genomes are efficient and compact, containing little repetitive DNA.
E. contain large amounts of noncoding and repetitive DNA.
La figura illustra in modo approssimativo le dimensioni del DNA non compattato rispetto alle dimensioni della cellula.
LE PRINCIPALI PROTEINE ASSOCIATE AL NUCLEOIDE
How many base pairs are there in the E. coli chromosome?
kb (= kbp) = kilo base pairs = 1,000 bp
Mb = mega base pairs = 1,000,000 bp
Science, 1995, Vol 269:496-512
Mar. 2014: 3654 citazioni Mar. 2015: 3769 citazioni Mar. 2016: 3909 citazioni
1.83 Mbp
La figura riporta l’estensione delle dimensioni dei genomi (in pb) nei tre domini e le dimensioni del genoma in alcune specie di riferimento.
Bacterial chromosomes ranges from 0.6 Mbp to over 10 Mbp Archael chromosomes range from 0.5 Mbp to 5.8 Mbp Bacterial chromosomes ranges from 0.6 Mbp to over 10 Mbp Archael chromosomes range from 0.5 Mbp to 5.8 Mbp
I due ceppi di E. coli, non patogeno (MG1665) e patogeno (EDL933), hanno 4,1 x 106 pb in comune e differiscono per sequenze specifiche (5 x 105per il primo e 1,3 x 106 per il secondo).
ESEMPIO DI POLIMORFISMO ALL’INTERNO DI UNA STESSA SPECIE
Brook, Biologia dei microrganismi – 1 Microbiologia generale
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project disease strain genome
size
plasmid(s)* status updated
E. coli K-12 non- pathogen;
reference strain
MG1655 4.6 Mb (none) published (1997) June 10, 2004
E. coli O157:H7 (EHEC)
haemorrhagic colitis, haemolytic uremic syndrome
EDL933 5.4 Mb 2 published (2001) Feb 13, 2001
uropathogenic E. coli (UPEC)
cystitis, pylonephritis
CFT073 5.2 Mb (none) published (2002) Dec 5, 2002
E. coli K1 (NMEC)
septicemia, neonatal meningitis
RS218 5.2 Mb 1 finishing (assembly in 3 contigs)
May 17, 2006
I genomi procarioti sequenziati hanno dimensioni che vanno da 0,16 Mbp a 13 Mbp, e sono noti genomi anche di dimensioni maggiori.
Il più piccolo genoma procariote ha dimensioni minori di quelle del genoma virale più grande.
I genomi procarioti più grandi hanno più geni di alcuni genomi eucarioti.
Molti geni possono essere identificati attraverso la loro similitudine di sequenza con i geni che si trovano in altri organismi.
Il contenuto genico nei procarioti è caratteristicamente proporzionale alle dimensioni del genoma.
PERCENTUALE DI DNA NON CODIFICANTE IN ALCUNE SPECIE DI RIFERIMENTO.
Notare il notevole incremento di DNA non codificante per proteine negli eucarioti.
Brook, Biologia dei microrganismi – 1 Microbiologia generale 39
Genes with unknown function: ~60%
Genes with known function: ~ 40%
In ogni genoma esaminato circa
¼
“ipotetico”
Una significativa percentuale di geni sequenziati, però, è ancora a funzione sconosciuta.
Summary of the shifts in gene content with genome size in prokaryotic genomes.
Konstantinidis K T , and Tiedje J M PNAS 2004;101:3160- 3165
Pelagibacter ubique
1,308,759 bp, 30% of the cell volume R.F. DOOLITTLE Nature 416, 697 - 700 (2002)
Stages of genome reduction in host-restricted bacteria for which small population sizes and an asexual life cycle result in mutation fixation.
Note that some symbionts and pathogens (such as Rhizobium spp. and Vibrio fischeri) that can persist in the outside environment and that re-infect hosts frequently do not undergo these genomic changes
Genes involved in informational processing are in blue, those involved in vitamin or amino acid biosynthesis are in maroon, ribosomal RNA genes are in green, other genes are light grey and breaks are non-coding regions.
A minimal genome was defined in 1999 by A. Mushegian as a genome containing the smallest number of genetic elements sufficient to build a modern-type free-living cellular organism. Consequently, the concept of minimal genome is fundamentally related with the definition of a minimal cell.
How Simple Can Life Get? . . . It’s complicated
A minimal cell is a hypothetical biological system that posses only the necessary and sufficient attributes to be considered alive. Therefore, it must be able to maintain its own structures (homeostasis); self-reproduce; and evolve in a supportive, protected, and stable environment.
(R. Gil, 2011)
The total number of prokaryotic cells on earth has been estimated to be approximately 4-6 × 1030
In a particular environment, the sum of all microbial genes corresponds to the METAGENOME.
Metagenomica
Metagenomica (detta anche genomica ambientale) è lo studio dei genomi recuperati da ambienti piuttosto che da singoli organismi
Comunità intestinali, comunità marine (es. i batteri del mar dei Sargassi), biofilm …..
"whole-genome shotgun sequencing"
Sargasso Sea, Bermuda
J. C. Venter et al., Science 304, 66 -74 (2004)
Fig. 1. MODIS-Aqua satellite image of ocean chlorophyll in the Sargasso Sea grid about the BATS site from 22 February 2003
1700 litri filtri:0.1-3.0 micron
"whole-genome shotgun sequencing"
Sargasso Sea, Bermuda
1.045 miliardi bp di sequenze non ridondanti analizzate
1800 specie, di cui 148 sconosciute
1.2 milioni di geni
L’analisi metagenomica del terzo segmento dell’intestino posteriore delle termiti ha rivelato la presenza di 12 Phyla e 216 filotipi (nessuno collocabile nel dominio Archaea)
Metagenomi: 637 Complete Genome Projects
Of the 395 bacterial phylotypes, 244 (62%) were novel and 80%
represented sequences from species that have not been cultivated
MetaHIT (Metagenomics of the Human Intestinal Tract)
January 1, 2008 - June 30, 2012
March 4 2010
project financed by the European Commission under the 7th FP program. The consortium gathers 13 partners from academia and industry, a total of 8 countries.
Its total cost has been evaluated at more than 21,2 million €
Why bacteria matter in animal development and evolution
BioEssays
Volume 32, Issue 7, pages 571-580, 11 JUN 2010 DOI: 10.1002/bies.200900192 http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/bies.200900192/full#fig2
Trends in Biotechnology
Volume 28, Issue 12, December 2010, Pages 611-618
Number of publicly available genome sequences for selected bacterial pathogens
Species N. of draft (or “in
progress”) genomes
N. of finished genomes
Bacillus anthracis 20 6
Bacillus cereus 43 9
Borrelia burgdorferi 12 5
Chlamidia trachomatis 23 20
Clostridium botulinum 8 11
Escherichia coli 270 38
Haemophilus influenzae 25 4
Listeria monocytogenes 24 6
Mycobacterium tuberculosis 71 5
Salmonella enterica 62 18
Staphylococcus aureus 69 21
Streptococcus pneumoniae 186 12
Yersinia pestis è considerato un clone di Y. pseudotuberculosis (batterio del suolo) comparso negli ultimi 1.500 – 20.000 anni
Three biovars (Antiqua, Medievalis, and Orientalis) have been distinguished within the Y. pestis clone
.
The formation of each pathogenic lineage in the Yersinia genus is marked by key gene gain and gene loss events.
3 PANDEMIE
6
thsec., Africa/Asia
14
thsec., Europa (1/3 popolazione europea) 19
th/20
thsec., Asia
~ 200 milioni di morti
Negli ultimi 20 anni ci sono stati da 1000 a 5000 casi di peste e da 100 a 200 decessi all’anno (WHO)
(A) Map showing countries with known presence of plague in wild reservoir species (B) Annual number of human plague cases over different continents, reported to WHO
1954–2005.
(C) Cumulative number of countries that reported plague to WHO since 1954.
East Smithfield
(fossa comune scavata tra il 1348 e il 1349 per seppellire le vittime della pandemia)
The ancient sequence is surprisingly similar to modern Y. pestis strains.
It differed from modern strains at only 97 positions all of which matched the ancestral genes from Yersinia psuedotuberculosis.
tight genetic conservation in this organism over the last 660 years
The genes of the Black Death clones do not have significant genetic differences that would make the ancient clone(s) more virulent than modern strains.
“genomics era” ‘population genomics era’
collection of multiple genomes of a bacterial species
(or another discrete taxonomic unit)
PAN-GENOME
A pan-genome is the sum of all genomes of similar strains; each having similar (core genome) or distinct (cenomes) sets of nonpersistent genes.
∼500 persistent genes form the paleome.
1 MEGABASE PROKARYOTIC DNA = 1000 ORFs
Phenotype
Ensable of observable characteristics of an organism
Mutation
process by which genes undergo a structural change Genotype
Organism’s genetic material
Gene
discret unit of genetic information
