FUZARIOTOKSINŲ PAPLITIMAS BALTIJOS REGIONE (LIETUVOJE, LATVIJOJE, ESTIJOJE)

LIETUVOS VETERINARIJOS AKADEMIJA

GYVULININKYSTöS TECHNOLOGIJOS FAKULTETAS

MAISTO SAUGOS IR GYVŪNŲ HIGIENOS KATEDRA

Jolita Straigyt÷

FUZARIOTOKSINŲ PAPLITIMAS BALTIJOS REGIONE

(LIETUVOJE, LATVIJOJE, ESTIJOJE)

Magistro darbas

Darbo vadovas:

Prof. dr. Bronius Bakutis

2 Magistro darbas atliktas 2007 – 2009 metais Lietuvos Veterinarijos Akademijoje, Maisto saugos ir gyvūnų higienos katedros, Gyvūnų gerov÷s tyrimų laboratorijoje.

Magistro darbą paruoš÷: Jolita Straigyt÷ ... (parašas)

Magistro darbo vadovas: Prof. dr. Bronius Bakutis ... (parašas)

Recenzentas: ...

3 TURINYS Psl. Santrumpų sąrašas ... 4 Įvadas ... 5 1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 7 1.1. Grūdų gedimo priežastys ... 7

1.2. Veiksniai, sąlygojantys mikroskopinių grybų augimą ir mikotoksinų produkavimą ... 9

1.3. Svarbiausios mikotoksinų grup÷s, jų charakteristika, paplitimas ... 12

1.4. Mikotoksinų paplitimas pašariniuose grūduose pasaulyje ir Lietuvoje ... 18

1.5. Mikotoksinų poveikis organizmui. ... 23

1.6. Mikotoksinų nustatymo metodai. ... 25

1.7. Dokumentai reglamentuojantys mikotoksinų leidžiamus lygius pašaruose. ... 27

2. TYRIMŲ ATLIKIMO VIETA IR METODIKA... 29

3. TYRIMŲ REZULTATAI ... 32

3.1. Grūdų užterštumas fuzariotoksinais Baltijos regione ... 32

3.2. Kombinuotųjų pašarų užterštumas fuzariotoksinais tiriamuoju laikotarpiu . 38 3.2. Tirtų grūdų ir kombinuotųjų pašarų pavojingumas gyvūnams ... 40

4. IŠVADOS IR PASIŪLYMAI... 43

5. SUMMARY ... 45

6. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 46

4 SANTRUMPŲ SĄRAŠAS

AESC - aukšto efektyvumo skystin÷s chromatografijos AFL - aflatoksinai (bendrai)

AFL B1 - aflatoksinas B1

KSV – kolonijas sudarantys vienetai CPR - ciklopiazonin÷ rūgštis

DAS - diacetoksiciprenolas DON - deoksinivalenolas

ELISA - imunofermentin÷s analiz÷s metodas FAO - Maisto ir Žem÷s ūkio organizacija GC - dujin÷s chromatografija

IFA - imunofermentin÷ analiz÷ NIV - nivalenolas

OT - ochratoksinai (bendrai) OTA - ochratoksinas A

ppm - milijonin÷ dalis (part per million) - mg/kg ppb - milijardin÷ dalis (part per bilion) - µg/kg PLCh - plonasluoksn÷s chromatografija T-2 - T-2 toksinas

WHO - Pasaulin÷ Sveikatos Organizacija ZEN - zearalenonas

5 ĮVADAS

Pastaruoju metu itin didelis d÷mesys skiriamas mikotoksinų problemai spręsti ne tik tod÷l, kad jie neša didžiulius nuostolius gyvulininkyst÷j ir paukštininkyst÷j, bet ir d÷l to, jog kenkia žmogaus sveikatai, pasižymi mutagenin÷mis savyb÷mis ir kancerogeniniu veikimu. Šeriant gyvulius ir paukščius mikotoksinais užterštais pašarais, užkrečiama ir produkcija: pienas, m÷sa, kiaušiniai. Ypač susirūpinta gyvuliams šeriamų pašarų kokybe. Sand÷liuojant pašarinius grūdus būtina laikytis veterinarinių sanitarinių reikalavimų, kadangi grūduose gausu įvairių maisto medžiagų, tod÷l susidaro palankios sąlygos vystytis daugeliui mikroorganizmų.

Jau subrendę varpinių javų grūdai neturi tvirto viršutinio sluoksnio ar tokių cheminių junginių, kurie apsaugotų grūdą nuo pažeidimo. Be to, d÷l specifinių savybių ir savitos morfologin÷s sandaros grūdai labai greitai absorbuoja aplinkos dr÷gmę. Tokie grūdų ypatumai sudaro palankias sąlygas mikroorganizmams santykinai greitai vystytis juose, naudodami juos kaip mitybini terpę. Dar lauko sąlygomis varpinių javų grūdai yra pažeidžiami mikroskopinių grybų. Užterštumo lygis priklauso nuo oro sąlygų brendimo metu, taip pat svarbus augalų jautrumas, kurį gali didinti stresas (skersv÷jai, pernelyg dažni lietūs, vabzdžių ir pesticidų poveikis). Mikroskopinių grybų spartų vystymąsi įtakoja aplinkos sąlygos, palanki temperatūra bei dr÷gm÷. Šie svarbiausi veiksniai lemia mikroorganizmų vystymąsi ir grūdų pažeidimo intensyvumą.

Vystydamiesi mikroskopiniai grybai naudoja grūduose esančias maisto medžiagas, o jų išskiriami mikotoksinai sutrikdo virškinamojo trakto funkcijas. D÷l to pablog÷ja maisto medžiagų pasisavinimas. Visų pirma sumaž÷ja energijos, riebalų ir vitaminų kiekis. Pašaruose labai keičiasi amino rūgščių ir vitaminų struktūra.

Lietuvos sąlygomis svarbiausi yra fuzariotoksinai, kuriuos gamina Fusarium genties mikromicetai. Fusarium genties grybai išskiria keletą dešimčių metabolitų, kurie pavadinti trichoteceniniais mikotoksinais. Tačiau didžiausią pavojų kelia keturi trichotecenų mikotoksinai: T-2 toksinas, deoksinivalenolas (DON), diacetoksiciprenolas (DAS) ir nivalenolas. Didel÷s žalos gyvulininkystei padaro mikotoksinas zearalenonas (ZEN). Sand÷liuojant pašarines žaliavas ar pašarus, labiausiai paplitę Penicillium ir Aspergillus gentys, kurios dažniausiai produkuoja ochratoksinus (Bakutis, 2004).

Įvairių rūšių mikromicetai gamina skirtingus mikotoksinus. Šie mikotoksinai pasižymi įvairiu poveikiu gyvulių, paukščių sveikatai. Taip pat yra skirtumai, kaip įvairių rūšių gyvuliai reaguoja į skirtingus mikotoksinus. Vienintelis patikimas būdas išvengti maistinių ir pašarinių grūdų užterštumo mikotoksinais – užkirsti kelią mikroskopinių grybų vystymuisi grūduose.

6 Specialistų patariama taikyti vis jautesnius, tikslesnius mikotoksinų kiekio nustatymo metodus. Šiuo tikslu naudojami skirtingi pašarinių grūdų užterštumo mikroskopiniais grybais ir mikotoksinų kiekio bei toksiškumo identifikavimo metodai.

Magistrinio darbo tikslas - Atlikti Baltijos regione išaugintų grūdų užterštumo fuzariotoksinais analizę.

Darbo uždaviniai:

• Nustatyti deoksinivalenolo, T-2 toksino, zearalenono koncentracijas grūduose išaugintuose Lietuvoje, Latvijoje, Estijoje.

• Palyginti nustatytus mikotoksinų kiekius trijose valstyb÷se.

• Įvertinti fuzariotoksinų kaupimąsi, Lietuvoje pagamintuose kombinuotuosiuose pašaruose.

7 1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1. Grūdų gedimo priežastys

Į gyvūnų racioną įeina daugiausia augalin÷s kilm÷s pašarai. Kaip pašarin÷s žaliavos plačiai vartojami grūdai. Javai yra auginami įvairiuose dirvožemiuose, taikant skirtingas agrotechnines ir agrochemines priemones. Tai sudaro skirtingas sąlygas įvairioms mikroorganizmų grup÷ms vystytis jų augimo aplinkoje ir kontaminuoti grūdus dar jų augimo, brendimo bei derliaus nu÷mimo metu. (Lugauskas et al., 2004; Yiannikouris et al., 2002; Santin, 2005).

Grūdai pradeda gesti d÷l daugelio priežasčių, iš kurių svarbiausios yra mikrobiologin÷s. Deguonis, temperatūra bei dr÷gm÷ - šie veiksniai yra pagrindin÷ varpinių ir ankštinių grūdų sugedimo priežastis. Gendant pašarams, kinta ir įvairių mikroorganizmų procentin÷ sud÷tis, tod÷l vertinant pašarų kokybę svarbu atsižvelgti į toksinių ir patogeninių mikroskopinių grybų bei bakterijų kiekį pašaruose (Bakutis, 2007).

Mikroorganizmų veiklos kryptys gendančiuose pašaruose yra šios: 1. Aktyvus mikroorganizmų dauginimasis

1.1. Endotoksinų gamyba (gramnegatyūs mikrobai).

1.2. Egzotoksinų gamyba (visi bakterijų gaminami toksinai - pašare arba žarnyne).

1.3. Bakterijų toksinų kiekio did÷jimas esant:

Cl. botulinum; Cl. perfingens; Staphylococcus aureus; Bacillus cereus. 1.4. Patogeninių ar sąlyginai patogeninių mikroorganizmų veiklos

suaktyv÷jimas:

leptospiros - sukelia infekcijas; salmonel÷s - dažniausiai viduriavimą; listerijos - nervinius reiškinius, mastitus.

1. Aktyvesnis mikroorganizmų, mikroskopinių grybų ir mielių dauginimasis Mikroskopinių grybų – mikoz÷s;

Mikroskopinių grybų sporų – alergijos;

Mielių - gūžio išpūtimas (vištoms), skrandžio (ožkoms, kiaul÷ms), viduriavimas. 3. Padid÷jęs mikroorganizmų produkuojamų medžiagų kiekis

3.1. Histaminas - žuvies produktuose, silose - bendra intoksikacija.

3.2. Tiaminaz÷ (produkuojama mikroskopinių grybų) - tiamino trūkumas (Placinta et al., 1999).

8 Grūdų kokyb÷ priklauso ne tik nuo nu÷mimo technologijos ir grūdų laikymo būdo, bet ir nuo mikrobiologinių procesų, kurie vyksta grūduose. Grūdų gedimą galima skirstyti į tris laipsnius:

1 pav. Grūdų gedimo laipsniai (Valter, 1998)

I laipsnio gedimas. Grūdų paviršiuje atsiranda saprofitiniai kokai ir sporin÷s bakterijos. Jų kiekis viename pašaro grame neviršija milijono. Mielių nerandama. Dažniausiai aptinkama Aspergillus ir Penicillium genčių mikroskopiniai grybai. Intensyviai did÷jant mikroskopinių grybų kiekiui, bakterijų skaičius maž÷ja, nes grybai veikia toksiškai.

II laipsnio gedimas. Bakterijų ir grybų labai daug, kartu su saprofitiniais kokais atsiranda anaerobinių mikrobų. Pašarai intensyviai pelija, tarp mikroskopinių grybų vyrauja Penicillium ir Aspergillus gentys. Jų kiekis viename pašaro grame priart÷ja prie milijono. Jei grybai smarkiai pažeidžia pašarus, jie tampa nuodingi. Tokiu pašaru šeriamiems gyvuliams pasireiškia anafilaksija ir medžiagų apykaitos sutrikimai, taip pat gali atsirasti hemoraginis sindromas. I laipsnio grūdų gedimas Bakterijų skaičius sumaž÷ja, daug÷ja mikroskopinių grybų Pablob÷ję organoleptin÷s savyb÷s. Maistinių medžiagų nuostoliai. Mikotoksinų ir bakterijų toksinų gamyba

Sumaž÷jusi grūdų pašarin÷ vert÷

II laipsnio gedimas

Ypač daug bakterijų ir grybų. Atsiranda anaerobinių mikrobų

Grūdai atsiskiria gumulais. Intensyvus baltymų ir angliavandenių skilimas. Toksiški pašarai Sumaž÷ja gyvulių produktyvumas, galimi susirgimai

III Laipsnio gedimas

Bakterijų kiekis maž÷ja, jas nukonkuruoja

mikroskopiniai grybai

Grūdai pelija, atsiskiria gabalais. Sumaž÷ja pašarin÷ vert÷. Randasi daug

mikotoksinų

Pašarai labai toksiški, netinkami naudoti

9 III laipsnio gedimas. Pašarų sugedimo laipsnis pasiekia maksimalią ribą. Bakterijų kiekis maž÷ja. Irstant grūdams susidaro H2S ir NH3 dujos. Tokie pašarai š÷rimui netinkami. (Bakutis, 2007).

Grūdų gedimui bei kokybei taip pat turi įtakos ir laikymo sąlygos. Nesilaikant sand÷liavimo reikalavimų grūdai gali prad÷ti gesti. Pagrindin÷s priežastys, sukeliančios grūdų gedimo protrūkius yra didelis pradinis saugyklų užterštumas ir nepakankamas grūdų paruošimas sand÷liavimui (Baliukonien÷ ir kt., 2002).

Tačiau, netgi sand÷liuojant tinkamai paruoštus grūdus, po ilgesnio sand÷liavimo laiko gali pakisti grūdų parametrai: padid÷ti dr÷gm÷ ir pakilti temperatūra. Šie parametrai gali kisti d÷l nepakankamos ventiliacijos, vandens kondensacijos ant saugyklos sienelių, biologinio grūdų kaitimo ir grūdų chemin÷s sud÷ties pokyčių. Susidarius kritiniams grūdų saugyklų veiksniams, pasireiškia taip vadinamas "ydingas" grūdų gedimo ratas, greitinantis grūdų pel÷jimą ir bakterinį pažeidimą. Šį procesą galima sustabdyti tiktai užtikrinant geras saugyklų sanitarines sąlygas, o taip pat tinkamai paruošiant grūdus sand÷liavimui. Europos Bendrijos paruoštose rekomendacijose nurodoma, kad didžiausia rizika grūdų gedimui sand÷liavimo metu atsiranda šalyse, kuriose aukšta santykin÷ oro dr÷gm÷ (Baliukonien÷ ir kt., 2002).

Galioja pagrindin÷ taisykl÷, kur n÷ra mikroskopinių grybų augimo, negali būti randama mikotoksinų. Ir atvirkščiai - mikotoksinų randama tokiame pašare, kur tam tikrą laiką auga ir dauginasi grybai (Chelkowski, 1997).

1.2. Veiksniai, sąlygojantys mikroskopinių grybų augimą ir mikotoksinų produkavimą

Dar lauko sąlygomis varpinių javų grūdai yra pažeidžiami mikroorganizmų. Užterštumo lygis priklauso nuo oro sąlygų brendimo metu, taip pat svarbus augalų jautrumas, kurį gali didinti stresas (skersv÷jai, pernelyg dažni lietūs, vabzdžių ir pesticidų poveikis). Mikroorganizmų spartų vystymąsi įtakoja aplinkos sąlygos, palanki temperatūra bei dr÷gm÷. Šie svarbiausi veiksniai lemia mikroorganizmų vystymąsi ir grūdų pažeidimo intensyvumą (Smith et al., 1994).

Gamtoje grybus - patogenus išplatina v÷jas, vanduo, vabzdžiai bei paukščiai (Harazim et al., 1998). Kai kurie mikroskopiniai grybai savo sporas didesniais kiekiais skleidžia dienos metu, kai v÷jas stipresnis ir oro temperatūra aukštesn÷, kiti patogeniniai grybai plinta su v÷jo nešamais lietaus lašeliais. V÷juotą, lietingą dieną sporos gali būti nuneštos apie 7 metrus (Jenkinson et al., 1994; Pederson et al., 1994). Italijos mokslininkai nustat÷, kad Fusarium genties nelytinių sporų (konidijų) kiekis augalų viduje ir išor÷je padid÷ja, esant didesniam

10 lietingų dienų skaičiui (Rossi et al.,2000). Kai javai apdulkinimo metu yra veikiami dr÷gm÷s ir kritulių, varpos užsikrečia Fusarium genties grybais dažniau (Henriksen et al., 2000).

Taip pat patogenai gali būti išnešiojami vabzdžių, erkių. Vabzdžiai gali išnešioti grybų sporas augalu, o taip pat nuo vieno augalo ant kito (Agrios, 1997). F. poae yra viena patogeninių grybų rūšių, kuri pirmiausia siejama su išplitusiais kenk÷jais, ypač erk÷mis (Kemp et al., 1996). Kanados mokslininkai aptiko F. sporotrichioides, F. culmorum, F. graminearum ir kitas Fusarium rūšių sporas ant vikšrų, rastų dirvožemyje, ant augalų šaknų (Diabotrica spp.), boružių (Epilachna spp.) ir spragių (Glisochrochlius ąuadrisignatus) (Miller et al., 1998).

Be to mikroskopinių grybų plitimo intensyvumui didelę įtaką daro dirvožemis (sud÷tis bei rūgštingumas), temperatūra, substrato savyb÷s, agrochemin÷s priemon÷s (s÷jomainų netaikymas, uždelsta s÷ja, šiaudų smulkinimas ir palikimas ražienoje, augimo reguliatorių naudojimas, per didelis azotinių trąšų kiekis, dirvos įdirbimo pakeitimas) (Dill-Macky et al., 2000; Henriksen et al., 2000).

Mikroskopiniais grybais labiau užsikečiama, kai dirvožemio rūgštingumas yra 5-6 pH, dirva - nederlinga, joje yra daugiau kalio (Hall et at., 1998). Kai nuo dirvos, mikroskopiniais grybais užkrečiamas augantis augalas, pirmiausia užsikrečia stiebas ir apatiniai lapai, v÷liau užkratas kyla aukštyn ir žyd÷jimo metu užkrečia varpą (Henriksen et al., 2000).

Daugeliu tyrimų įrodyta, kad mikromicetų augimui ir mikotoksinų produkavimui didel÷s įtakos turi substrato savyb÷s: dr÷gnis, temperatūra, chemin÷ sud÷tis (C, N santykis). Dauguma mikromicetų gerai auga, kai substrato vandens aktyvumas yra 0,8-0,9. Fusarium genties mikromicetai augimo maksimumą pasiekia, kai substrato dr÷gnis yra 0,98-1,0 (Sweeney et al., 1998).

Kai nuo dirvos, mikroskopiniais grybais užkrečiamas augantis augalas, pirmiausia užsikrečia stiebas ir apatiniai lapai, v÷liau užkratas kyla aukštyn ir žyd÷jimo metu užkrečia varpą (Henriksen et al., 2000).

Piktžolių kontrol÷ bei s÷jomainų vykdymas, sumažina javų užterštumą mikroskopiniais grybais. Plačiai paplitusios piktžol÷s ir dobilai yra kaip alternatyva, daugyb÷s Fusarium rūšių išplitimui, kuris sukelia javų šaknų puvinį, varpų fuzariozę (Hörberg et al., 2000).

Sand÷liuojant grūdus pradeda vystytis taip vadinami "sand÷lių" grybai. Pradeda vyrauti Aspergillus, Penicillium, Rhizopus, Mucor genčių mikromicetai (Langstech et al., 1996). Jų kiekis grūduose priklauso nuo pradinio aruodų užterštumo, deguonies ir anglies dvideginio santykio aruode, konservavimo, džiovinimo, temperatūros, santykin÷s dr÷gm÷s, saugojimo laiko, grūdų ventiliacijos, saugyklos higienos bei grūdų kokyb÷s (2 pav.) (Bakutis ir kt., 2000).

11 2 pav. Veiksniai įtakojantys mikroskopinių grybų augimą

Mikroskopinių grybų augimo temperatūra labai įvairi, ji priklauso nuo grybų rūšies. Yra rūšių, kurios gali augti žemesn÷je negu 0ºC temperatūroje. Kitoms mikroskopinių grybų rūšims žemiausia aplinkos temperatūra - 10ºC. Daugumai Penicillium mikromicetų rūšių augti ir mikotoksinams gamintis optimali temperatūra yra 25-30ºC, o palankiausia Aspergillus genties mikromicetams temperatūra yra 30-40ºC. Įvairūs Fusarium genties mikromicetai bei jų produkuojami mikotoksinai dažniausiai randami v÷saus ir vidutinio klimato zonose, kur jiems augti ir mikotoksinams gamintis optimali temperatūra yra 8-15ºC (Bakutis, 2007). Javuose bei kukurūzuose aptiktos termotolerantin÷s (vystosi iki 50ºC) Aspergillus candidus, A. flavus, A. fumigatus, Paecilomyces variotii ir termofilin÷s (vystosi iki 55ºC ir virš 60ºC) Thermomyces languinosus, Rhizomucor pusillus, Thermoascus aurantiacus mikromicetų paderm÷s (Wareing, 1997). GRŪDŲ UŽKRöTIMAS PAŽEISTI GRŪDAI LAIKAS O2 ERGOSTEROLIS KVAPAS H2O TEMPERATŪRA KENKöJAI

12 3 pav. Pagrindiniai veiksniai, įtakojantys toksinių grūdų susiformavimą

Anksčiau buvo manyta, kad grybai yra tik aerobai. Tačiau paskutiniu metu nustatyta, kad grybai gali augti net anaerobin÷mis sąlygomis. Būdami aerobai ir anaerobai gali vystytis plačiame temperatūrų diapazone, kas išplečia jų galimybes infekuoti pašarines žaliavas ir pašarus įvairiose stadijose (Prickett et al., 2000).

Mikroskopinių grybų augimas grūdin÷se žaliavose intensyvus tiek lauko tiek sand÷liavimo metu. Augdami grybai gamina mikotoksinus, kurie gali būti labai toksiški tiek žmon÷ms tiek gyvuliams (3 pav.). D÷l to, mikroskopinių grybų augimo ir vystimosi kontrol÷ yra būtina, norint išvengti maistinių žaliavų bei pašarų užkr÷timo mikotoksinais.

1.3. Svarbiausios mikotoksinų grup÷s, jų charakteristika, paplitimas

Mikotoksinai yra chemiškai įvairialyp÷s medžiagų grup÷s, kurios yra antriniai siūlinių mikromicetų medžiagų apykaitos produktai (Bakutis, 2007).

1 lentel÷. Svarbiausios mikotoksinų grup÷s ir jų producentai

Mikotoksinai Pagrindiniai producentai

Aflatoksinai (B1, B2,G1, G2, M1, M2) Aspergilllus flavus A. parasiticus Ochratoksinai (A, B, C, D) Penicillium verrucosum Aspergillus ochraceus Fuzariotoksinai Trichotecenai Zearalenonai Fuzarinai Fumonizinai Butenolidai Fusarium sporotrichioides F. poae, F. avenaceum F. equiseti, F. moniliforme F. roseum, F. graminearum ir kt.

Aflatoksinai yra mikroskopinių grybų Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus ir kitų metabolitai, sukeliantys ūmius ir l÷tinius gyvulių, paukščių ir žuvų susirgimus. Aflatoksinai

PAŽEISTI

GRŪDAI

TOKSIŠKI

GRŪDAI

13 yra plataus poveikio spektro toksiniai junginiai. Geriausiai išaiškintos tos rūšys, kurios dažniausiai randamos augalin÷s kilm÷s pašaruose ir sukelia aflatoksikozes - aflatoksinai B1, B2, G1, G2. Svarbiausias šios grup÷s mikotoksinas yra aflatoksinas B1 - pašaruose labiausiai paplitęs ir toksiškiausias (Massey, 1995). Jautriausi jiems yra kiaul÷s, triušiai, ančiukai ir up÷takiai, mažiausiai jautrios yra pel÷s, žiurk÷s ir vištos, tod÷l ir patologiniai procesai atskiroms gyvūnų rūšims vystosi skirtingai (Radostitis et al., 1994; Pasteyner, 1994: FAO, 2004). Jie gali sukelti patologinius pakitimus daugelyje organizmo sistemų. Ūmai apsinuodijus, aflatoksinai pirmiausia sukelia depresiją, sumaž÷ja apetitas, pagaus÷ja seil÷tekis, pakyla temperatūra, saus÷ja nosies veidrod÷lis (Romer TM Labs, 2000). Tam tikros aflatoksinų koncentracijos nustatomos kukurūzuose, kviečiuose, miežiuose, žirniuose avižose (Rodestitis et al., 1994).

Ochratoksinai yra gaminami Penicillium genties, pirmiausia Penicillium verrucosum , Aspergillus ochraceus genties mikromicetų. Jie gali pažeisti grūdines kultūras tiek joms augant, tiek sand÷liavimo metu. Iki šiol geriausiai ištirti ochratoksinai A, B, C, ir D. Pavojingiausias yra ochratoksinas A (Mills et al., 1995).

Nustatyta, kad ochratoksinai sukelia nefrotoksinį, kancerogeninį, teratogeninį ir imunosupresinį poveikį (WHO, 2001). Iškart, kai ochratoksinai patenka į kraujo apytakos sistemą, su serumo albuminais jie jungiasi prie iki šiol neidentifikuotos serumo molekul÷s. Susijungimas su kraujo baltymais labai sul÷tina ochratoksino pašalinimą. 50% patekusio ochratoksino išskiriama su šlapimu, 13% - su tulžimi į išmatas. Susijungę su kraujo makromolekul÷mis, ochratoksinai yra mobilus mikotoksinų rezervas, ilgą laiką galintis veikti įvairius audinius. Nustatyta, kad ochratoksinų kiekis pasiskirsto audiniuose taip: inkstai > kepenys > raumenys > riebalai. Pasteb÷ta, kad ochratoksinai gali pereiti placentos barjerą ir apnuodyti vaisių (Hoehler, 1998).

Net ir nedidelis ochratoksinų kiekis sukelia toksinį efektą. Jei į organizmą patenka doz÷, viršijanti 5 mg/kg kūno mas÷s, pastebimi klinikiniai intoksikacijos požymiai (Egmond et at., 1994).

Mikotoksinai dažniausiai išprovokuoja inkstų ir kepenų piktybinius bei gerybinius auglius. Medicininių steb÷jimų duomenimis, vietov÷se, kur žmon÷ms su maistu patenka 0,6 ng/kg kūno mas÷s ochratoksino A, pasteb÷tas didesnis vyrų sergamumas, o vietov÷se, kur ochratoksino su maistu vidutiniškai patenka 11 ng/kg, padažn÷ję susirgimai nustatyti ir vyrams, ir moterims (Paraica et al., 1999).

Aprašomieji toksinai veikia ir imunotoksiškai. Daugelis tyrimų įrod÷, kad ochratoksinas A veikia ląstelinio ir humoralinio imuniteto sistemas (Bakutis, 2007).

14 Ochratoksinai dažniau ir didesne koncentracija randamas Šiaurin÷je ir Rytin÷je Europoje (Danijoje, Vokietijoje, Lenkijoje), v÷saus ir vidutinio klimato zonose (Godin et al., 1998).

Fuzariotoksinai - tai didžiul÷ mikotoksinų „šeima", apimanti penkias toksinų metabolitų grupes: • trichotecenus, • zearalenoną ir jo derivatus, • fuzarinus, • fumonizinus • butenolidus

Trichotecenai yra didžiausia fuzariotoksinų grup÷. Šiuo metu chemiškai identifikuota daugiau kaip 60 skirtingų trichotecenų. Kai kurie mokslininkai priskaičiuoja dar daugiau (Danicke, 2000). Fuzariotoksinai, kuriuos dažniausiai produkuoja Fusarium genties mikro-micetai, labai paplitę Europoje. Jų atsiradimui yra palankios klimato sąlygos: daug dr÷gm÷s, dažnai besikeičiantys orai, vidutin÷ temperatūra. To pakanka, kad Fusarium genties mikromicetai, kurių pastaruoju laiku ypač gausu aplinkoje, patekę jau ant lauko augalų prad÷tų intensyviai daugintis ir produkuoti mikotoksinus (Bakutis, 2007).

Trichotecenai dar skirstomi į keturias grupes:

• A (T-2 toksinas, HT-2, DAS, neozolaniolas, ir kt.), • B (DON, nivalenolas, fuzarenonas X),

• C (krotocinas),

• D (verukarinas) (Pasteiner, 1994).

Iš visų fuzariotoksinų svarbiausi mūsų klimato sąlygomis yra trichotecenai ir zearalenonas. D÷l trichotecenų gausos pastaruoju metu dažnai kalbama apie bendrą jų poveikį gyvūnams, nors A grup÷s trichotecenai žymiai toksiškesni už B grup÷s (Petterson et al., 1995). Trichotecenai yra labai citotoksiški, veikia aminorūgščių ir baltymų sintezę. Ūmi jų intoksikacija dažniausiai pasireiškia šiais požymiais :

• hemoragijomis, edemomis, odos nekroz÷mis; • v÷mimu, viduriavimu;

• pakraujavimais skrandžio, plonųjų žarnų epitelyje; • hematopoetin÷s sistemos pažeidimu;

• sumaž÷jusių leukocitų ir trombocitų skaičiumi kraujyje; • hemoragijomis meninginiuose dangaluose;

• nerviniais sutrikimais; apetito stoka (Perlusky et al., 1994; Eriksen et al., 1998). L÷tinių trichotecenų toksikozių klinikiniai požymiai sunkiai identifikuojami ir atpažįstami. Jie pirmiausiai veikia gyvulių produktyvumą, pašarų konversiją (Brake et al.,

15 2000). Darydami įtaką ląstelių medžiagų apykaitai, slopina proteinų sintezę, mažina atsparumą infekcin÷ms ligoms. Net maža trichotecenų koncentracija veikia imunosupresyviai (Scudamore, 2005). Trichotecenai sumažina vištų dedeklių d÷slumą, suplon÷ja kiaušinio lukštas (Bakutis, 2007).

T-2 toksinas, patekęs į gyvulio organizmą, labai greitai transformuojamas ir pradedami detoksikuoti dar nepasiekę kepenų ir pašalinamas su tulžimi bei šlapimu (Bakutis, 2004). T-2 toksinas slopina proteinų sintezę, DNR ir RNR sintezę, lipidų peroksidaciją, veikia ląstelių membranas, stabdo mitochondrijų elektroninę transportavimo sistemą miel÷se. T-2 ir kiti trichotecenai didina interleukinų gamybą makrofaguose ir leukocituose (Pestka et al., 1994). T-2 toksinui patekus į organizmą, gyvūnai su÷da mažiau pašarų, sumaž÷jo jų paros priesvoris, pablog÷ja reprodukcin÷s savyb÷s. Didelis T-2 toksino kiekis pašaruose gali suformuoti trombus kepenyse, plaučiuose bei širdyje, o kai kuriais atvejais gyvulys gali nugaišti (Brake et al., 2000). Mikotoksinas T-2, patekęs į organizmą vieną kartą, grynas išskiriamas jau per 6 valandas. V÷liau iš organizmo išskiriami tik jo metabolitai: HT-2 toksinas, kuris organizme išsilaiko iki 33 valandų, T-2 triolis toksinas, kuris, vienkartiniai toksinui T-2 per burną patekus į organizmą, išsilaiko iki 48 valandų. Toksinas koncentruojasi virškinamajame trakte ir kepenyse. Kituose organuose ir kraujo plazmoje jo yra apie 4 proc. viso aplikuoto kiekio (Wu et al., 1997). Patekęs su pašaru į galvijų organizmą, T-2 toksinas pirmiausia pradedamas detoksikuoti prieskrandžiuose ir jo toksiškumas labai ženkliai sumaž÷ja. Organizme toksinas skaldomas. Paukščių organizme šis mikotoksinas labai greitai metabolizuojamas ir išskiriamas su išmatomis per 48 valandas. Tada organizme randami tik šio mikotoksino metabolitai, kurie sudaro 0,006-1,13 proc. viso aplikuoto toksino kiekio (Bakutis, 2004).

Deoksinivalenolis (DON) - dažniausiai aptinkamas mikotoksinas pasaulyje. Juo užteršti grūdai (apie 50 proc.) randami Europoje, Šiaur÷s ir Pietų Amerikoje, Pietų Afrikoje, Azijoje ir Naujojoje Zelandijoje. Mikotoksino kiekis siekia 1-67000 µg/kg. DON jautriausios yra kiaul÷s, mažiau - paukščiai, galvijai. Kiaulių organizme deoksinivalenolis labai greitai transformuojamas ir pašalinamas. Pra÷jus 24 valandoms po toksino aplikacijos, jo likučiai gali būti randami tiktai inkstuose. Ilgą laiką šeriant kiaules pašaru, kuriame yra 1,2-3,6 mg/kg DON, kepenyse, širdyje, inkstuose ir blužnyje randamas didesnis negu 23 mg/kg jo kiekis (Perlusky et al., 1994). Mikotoksinas patekęs į didžiuosius galvijų prieskrandžius, yra skaldomas mikrofloros, ir 54-75 proc. šio mikotoksino bei jo metabolitų su išmatomis pašalinami organizmo nepasisavinti. Patekęs į organizmą, DON susijungia su gliukuronine rūgštimi ir išskiriamas per inkstus. Melžiamas karves šeriant pašarais, kuriuose buvo 66 mg/kg DON, piene buvo aptiktas deepoksi-DON, kurio koncentracija buvo 26 ng/kg (Kollarczik et al., 1994). Paukščių organizme DON yra greitai metabolizuojamas ir per pirmas

16 72 valandas iš organizmo pasišalina. Lesinant paukščius lesalais, kuriuose DON buvo 4 mg/kg, broilerių audiniuose jo pasteb÷ta, tačiau, lesinant vištas dedekles, kiaušiniuose nustatytos DON metabolitų liekanos (Perlusky et al., 1994). Net maža tichotecenų koncentracija veikia imunosupresyviai. Lesinant viščiukus DON kontaminuotais lesalais, sukeliami kraujodaros ir imunin÷s sistemos pažeidimai (Kinser et al., 2004; Pestka et al., 2004).

Didžiausios zearalenono (ZEN) koncentracijos randamos kviečiuose ir kukurūzuose. Zearalenonas pagal cheminę struktūrą artimas estrogenams. Įvairūs tyrin÷tojai pažymi, kad zearalenonas neišsiskiria ūmiu toksiniu poveikiu. Pagrindinis jo biologinis poveikis sutrikdo reprodukcinę organizmo sistemą. Zearalenono poveikiui jautriausios yra kiaul÷s, ypač paršaved÷s ir jaunos kiaulait÷s (Miller et al., 1998). Įvairūs mokslininkai skirtingai nurodo ki aul i ų jautrumą. Šeriant kiaulaites pašarais, kuriuose zearalenono koncentracija buvo 0,05 mg/kg (atitinka 0,002 mg/kg kūno mas÷s), pasteb÷ta, kad kiaušid÷se dažniau iškyla pūsleliniai folikulai. Šie pakitimai daro įtaką reprodukcin÷ms savyb÷ms, nors klinikiniai simptomai nepasireiškia (Leibetseder, 1994). Pasteb÷ta, kad paskutiniais n÷štumo m÷nesiais paršaved÷s, šeriamos užterštais zearalenonu pašarais, atsiveda silpnus jauniklius, padažn÷ja apsigimimų. Zearalenonas veikia specifinius estrogeninius receptorius, sutrinka organizmo reprodukcin÷s savyb÷s, vystosi lytinių organų augliai (Arora et al., 1992).

ZEN sukelia panašų į estrogenus sindromą, kuris pasireiškia abiejų lyčių pieno liaukų padid÷jimu, vulvos pabrinkimu bei vulvovaginitu, progresuojančiu iki kiaulaičių makšties iškritimo. Suaugusiems gyvuliams sutrinka vaisingumas (auga kiaušidžių cistos). Šie intoksikacijos požymiai daugiausia pasireiškia kiaul÷ms - jautriausiai šiam mikotoksinui gyvulių rūšiai (Bakutis, 2004).

Šalutiniai reiškiniai pasteb÷ti, kai ZEN koncentracija pašaruose buvo mažesn÷ nei 0,05 mg/kg. Jauniems kuiliukams pabrinksta speneliai ir apyvarp÷, d÷l to sunkiau šlapintis. Gali atrofuotis s÷klid÷s, pablog÷ti spermos kokyb÷ ir kiekis (Drochner, 1998). D÷l ZEN poveikio pakitimai genitaliniame trakte sukelia kiaul÷ms vadinamąją netikrą rują. Nuo tikrosios ji skiriasi tuo, kad trunka neįprastai ilgai, tol, kol kiaul÷s šeriamos ZEN turinčiu pašaru. Net ir pakeitus racioną, netikros rujos požymiai nyksta l÷tai. Dažnai normalus lytinis ciklas taip ir neatsistato. Be to, rujojančiomis atrodančios kiaul÷s neprisileidžia kuilio, n÷ra vadinamojo tolerancijos reflekso Nustatyta, kad d÷l ZEN poveikio sumaž÷ja paršelių skaičius vadoje, paršeliai gimsta mažesnio svorio nei įprasta, galimi abortai (Leibetseder, 1994; Drochner, 1998).

Tiriant ZEN įtaką galvijams nustatyta, kad karves dirbtinai s÷klinant sumaž÷ja jų apvaisinimas (Leibetseder, 1994; Krogh et al., 1995). Paukščiai ZEN mažiau jautrūs. Lesinant

17 lesalais, turinčiais 300-800 mg/kg mikotoksino, po 4 dienų pasteb÷tas kiaušintakių, kloakos pabrinkimas (Malekinejad et al., 2003).

Zearalenono poveikis organizmui yra aktuali problema, nes Europoje užauginamuose pašaruose jo koncentracija dažnai viršija leistinas normas. Šiam mikotoksinui palankios visos klimatin÷s sąlygos: žema ir kintanti temperatūra (Bakutis, 2007).

Fumonizinai - plačiai paplitę mikotoksinai, kuriuos produkuoja Fusarium moniliforme, F. proliferatum, F. anthophilum ir kt. mikroskopinių grybų rūšys. Iki šiol dažniausiai minimi šeši fumonizinai (FB1 , FB2, FB3, FB4, FA1, FA2), kurių chemin÷ sandara skiriasi nežymiai. Šie mikotoksinai dažniausiai aptinkami kukurūzuose ir jų produktuose. Fumonizinams labai jautrūs yra arkliai, galvijai bei paukščiai. Fumonizino atradimas siejamas su sunkia arklių liga (neretai su letaline išeitimi), aprašyta T. Butler. Ji buvo vadinama „arklių apsinuodijimas supel÷jusiais kukurūzais". Arkliams apsinuodijus fumonizinais - būdingi nerviniai reiškiniai: stiprus susijaudinimas, apakimas, orientacijos praradimas, judesių koordinacijos sutrikimas. Kai kada lūpų ir liežuvio paralyžiai, v÷liau depresija, ataksija ir, pra÷jus 12-24 val. nuo klinikinių simptomų pasirodymo, arklys gali kristi (Bakutis, 2007).

Galvijams apsinuodijimas fumonizinais pasireiškia apetito stoka, sumaž÷jusiu produktyvumu, diar÷ja, viduriavimu. Paukščiams pagrindiniai simptomai – tamsios išmatos, labai sumaž÷jęs d÷slumas, apetitas, atsiradęs šlubavimas ir padid÷jęs kritimų skaičius (Bakutis, 2004).

Fumonizinai dažniausiai paplitę šilto ir vidutinio klimato juostose (JAV, Kanadoje, Ispanijoje, Italijoje, Kinijoje, Pietų Afrikoje) (Bakutis, 2007).

Patulinas yra ypač toksiškas, mutageniškas ir koncerogeniškas mikotoksinas. Tai nefrotoksinio veikimo mikotoksinas. Šiam mikotoksinui jautriausios yra kiaul÷s. Joms apsinuodijus pašarais, kuriuose yra patulino, pasireiškia susijaudinimas, odos cianotiškumas, v÷mimas, salivacija, apetito stoka, sul÷t÷jęs augimas, kv÷pavimo padažn÷jimas, karkalai. Ligai užsitęsus, kiaul÷s pradeda kos÷ti, pasireiškia plaučių edema, virškinamojo trakto sutrikimai. Sunkiais atvejai pasireiškia koordinacijos sutrikimai, užpakalinių galūnių paralyžius, konvulsijos, atsiranda nekroz÷s židinukai širdies raumenyje, kepenyse - hiperemija su nekroz÷s ploteliais (Bereta et al., 2000).

Patulinas dažnai aptinkamas sultinguose ir stambiuose pašaruose: runkeliuose, silose, šiene, šieno miltuose. Optimali patulino produkavimo temperatūra yra 21-30°C (Bereta et al., 2000).

Visi mikotoksinai toksiškai, o daugelis koncerogeniškai veikia gyvūnų organizmą, vienaip ar kitaip paveikdami jų normalią fiziologinę būklę. Mikotoksinų problema aktuali visam pasauliui. Jie paplitę šaltose- v÷siose, šiltose - dr÷gnose bei vidutin÷se klimatin÷se

18 sąlygose. Tai aktuali šiandienos ir rytdienos problema, kurią būtina spręsti stengiantis užkirsti kelią jų atsiradimo bei plitimo sąlygoms.

1.4. Mikotoksinų paplitimas pašariniuose grūduose pasaulyje ir Lietuvoje

Net ir šiuolaikiniai mokslo laim÷jimai, taikomi gaminant ir laikant maisto produktus, pašarus neužtikrina apsaugos nuo mikotoksinų, kuriuos išskiria mikroskopiniai grybai. Maisto ir žem÷s ūkio organizacijos duomenimis net iki 25 procentų pasaulyje gaminamų maisto produktų yra užteršti mikotoksinais. Mikotoksinais gali būti užteršti ne tik grūdai, bet ir riešutai, kava, kakava, džiovinti tropiniai vaisiai. Pienas užteršiamas, kai karv÷s šeriamos pašarais, užterštais toksinais. Iš tokio pieno pagaminti produktai, taip pat tampa užkr÷sti toksinais.(Fazekas et al., 2002; Schollenberger et al., 2005; Lugauskas ir kt, 2006).

Grūdų užterštumas mikotoksinais priklauso nuo aplinkos sąlygų, kurios yra palankios arba nepalankios atskiroms mikromicetų rūšims. Daugeliu atvejų mikotoksinų gamybą prasideda augalams augant, taip pat did÷ja jų kiekis derliaus nu÷mimo metu, džiovinant ir sand÷liuojant (Yiannikouris et al., 2002; Santin, 2005).

Išaugintuose grūduose d÷l skirtingų klimatinių sąlygų vyrauja skirtingų tipų grybai ir jų mikotoksinai. Pietų ir Vidurio Europoje išaugintuose javų grūduose vyrauja Fusarium genties mikromicetai ir jų toksinai. Ochratoksinai labiausiai išplitę Šiaur÷s Europos kraštuose (Scot, 1994).

Trichotecenai nustatyti kaip plačiausiai pasaulyje vyraujantys grūduose: kviečiuose, miežiuose, avižose, kukurūzuose. Trichotecenai yra gaminami nedideliais kiekiais Myrothecium, Stachybotrys, Trichothecium grybų rūšių, nors didžiausia dalis skiriama Fusarium genties mikromicetams (Placinta et al., 1999; EC, 2003).

Švedijoje, Norvegijoje, Danijoje, ir Vokietijoje atliktų tyrimų duomenimis, T-2 toksinas yra HT-2 toksino diacetilin÷ forma ir dažnai aptinkami kartu, dažniausiai šiais mikotoksinais buvo užterštos avižos 21%, o kitų grūdų rūšyse šių mikotoksinų nustatyta žymiai mažiau, rasta 1-7 proc. tirtų m÷ginių. Dideli kiekiai T-2 ir HT-2 nustatyti Norvegijoje karštų ir sausų vasarų metu (Langseth et al., 1999).

Įvairūs zearalenono kiekiai yra randami beveik kiekviename žem÷s ūkio produkte, pašarų žaliavose ir paruoštuose pašaruose. Zearalenonas (ZEN) labai dažnai nustatomas ir silose, 25-30 proc. paimtų m÷ginių. Užterštame kukurūzų silose šio mikotoksino koncentracija siek÷ 0,005 mg/kg, žol÷s silose - 0,009 mg/kg, šiauduose ir šiene - 0,0015 mg/kg (Schollenberger, 2005). ZEN dažnai randamas ir šiauduose. Švedijoje tirtuose šiaudų m÷giniuose ZEN koncentracija nustatyta 92-2840 µg/kg. ZEN tam tikros koncentracijos

19 nustatomos žol÷se. Lenkijoje žolių m÷giniai paimti iš trijų skirtingų vietovių buvo užteršti ZEN 2-12 µg/kg sausos medžiagos (Golinski, 2003).

Zearalenono didžiausios koncentracijos ir dažniausiai randamos Vidurio Europos šalyse kaip Austrijoje, Vokietijoje, Prancūzijoje. ZEN nustatomas apie 90 proc. paimtų m÷ginių, siekia 2-27580 µg/kg. Didžiausios šio mikotoksino koncentracijos nustatomos kviečiuose ir kukurūzuose (EC, 2003).

Deoksinivalenolu užteršti grūdai (apie 50 proc.) randami Europoje, Šiaur÷s ir Pietų Amerikoje, Pietų Afrikoje, Azijoje ir Naujojoje Zelandijoje, šio mikotoksino kiekiai siekia 1-67000 µg/kg (Placinta et al., 1999). 1999-2002 metais labiausiai deoksinivalenolu (DON) buvo užteršti kukurūzai ir kviečiai Europoje (2 lentel÷). Sumalus sausus kukurūzus, daugiausiai DON aptinkama kukurūzų gemalų miltuose, sumalus dr÷gnus kukurūzus, daugiausiai DON aptinkama kukurūzų glitimo ir gemalų frakcijose, skaidulose ir kukurūzų stiebuose (Lauren et al., 1997). DON daugiausiai aptinkama pažeistuose, mažuose grūduose, kurie dažniausiai naudojami pašarui. Dažnai kukurūzų silosas yra užterštas DON.

2 lentel÷. Fusarium sp. gaminamų mikotoksinų kiekiai Europos Sąjungoje 1999-2002 (EC, 2003)

Deoksinivalenolis T-2 toksinas Zearalenonas Grūdai _Teigiamų m÷ginių skaičius DON koncentracija µg/kg Teigiamų m÷ginių skaičius T-2 koncentracija µg/kg Teigiamų m÷ginių skaičius ZEN koncentracija µg/kg -Kviečiai 61 70-1560 21 15-28 30 0,083 Miežiai 47 50-1200 3 0,8-280 4,9 0,083 Avižos 33 2-253 16 4,2-68,3 20 1,4-640,4 Kukurūzai 89 20-870 28 5,7-65 79 5,2-627

2000 m. Vokietijoje išaugintuose kukurūzų 59 proc. m÷giniuose DON kiekis buvo didesnis negu 300 µg/kg ir 9,2 proc. - 2000 µg/kg, 2,6 proc. – 5000 µg/kg.

Atlikti tyrimai Olandijoje ir Švedijoje parod÷, kad nuimtų javų šiaudai buvo užteršti DON didel÷mis koncentracijomis - 6600 µg/kg (kai kuriais atvejais ir ZEN), kai dažniausiai šiaudai naudojami kaip kraikas paršavedžių garduose (Hörberg, 2001).

Nivalenolas randamas tuos pačiuose kraštuose, kaip ir DON, siekia 2-37900 µg/kg (Placinta et al., 1999). Nivalenolas (NIV) aptinkamas javuose, užaugintuose Europoje, Azijoje ir Australijoje, rečiau – JAV ir Kanadoje. F. poae yra pagrindinis NIV producentas Švedijoje (Pettersson et al., 1995). Priešingai DON, NIV aptinkamas, esant kritulių trūkumui ir aukštai aplinkos temperatūrai (Pettersson, 1995). Vidutiniai kiekiai NIV aptinkami mažesni, negu DON, net Šiaur÷s šalyse ir Europoje (Keblys, 2000). NIV dažnai sutinkamas kartu su fusarenonu – NIV derivatu ir kitais fuzariotoksinais.

20 Fumonizinai (FUM) dažnai aptinkami kartu su ZEN kukurūzuose. Iš 140 importuotų kukurūzų m÷ginių į Angliją, 42 proc. jų buvo užteršti didesne nei 100 µg/kg ZEN koncentracija ir 48 proc. – 1000 µg/kg FUM (Scudamore et al., 2000).

Ochratoksinai (OT) pirmą kartą aptikti kukurūzuose, v÷liau - įvairiose grūdų rūšyse (kukurūzų, kviečių, miežių, rugių, avižų) daugelyje pasaulio šalių (Anonymousb, 2004). OT dažniau ir didesn÷mis koncentracijomis yra randami Šiaurin÷je ir Rytin÷je Europos dalyse (Danijoje, Vokietijoje, Lenkijoje). Dažniausiai iš ochratoksinų minimas ochratoksinas A (OTA), kuris yra toksiškiausias. Ypač palankios sąlygos šio mikotoksino gamybai susidaro lietingų vasarų metu, netinkamai sand÷liuojant grūdus. Daugiau negu pus÷je grūdų, kuriuose buvo rasti OT, jų koncentracija buvo didesn÷ negu 0,2 mg/kg (Prickett et al., 2000). Austrijoje ilgalaikių tyrimų metu buvo nustatyta, kad pašarui skirtuose grūduose OT buvo rasta vidutiniškai 44 proc. (Krogh et al., 1995). 1997 metais atlikti tyrimai Anglijoje parod÷, kad iš 306 pašarinių grūdų m÷ginių 15 proc. m÷ginių buvo užteršti OTA, kurio koncentracija svyravo nuo 1 µg/kg iki 17,8 µg/kg. Nustatyta koreliacija tarp OTA koncentracijos ir dr÷gm÷s kiekio, saugojimo laiko, vietov÷s (Schudamore et al., 1999). Tęsiant tyrimus 1999 metais, MacDonald ir kiti (2004) nurod÷, kad 11 proc. tirtų pašarinių kviečių buvo užteršti nuo 1 µg/ kg iki 231 µg/kg OTA. Ochratoksinu A buvo užterštos pašarin÷s žaliavos: palmių s÷klos, ryžių s÷lenos, sausi žirniai, pupos, saul÷grąžos (Juric et al., 1999). 1999 metais Europos šalyse ištyrus 1500 kviečių, avižų, rugių, miežių ir kukurūzų m÷ginių, tik 4 proc. nustatyta nuo 1 µg/kg iki 27 µg/kg OTA. Šie tyrimų rezultatai parod÷, kad maistui naudojami grūdai yra geros kokyb÷s (EC, 2003). Didesni OT kiekiai buvo nustatyti ekologiniuose ūkiuose, nenaudojančiuose cheminių preparatų augalų apsaugai ir produktų konservavimui. Ištyrus šiuose ūkiuose išaugintus produktus, buvo nustatyta, kad OT buvo užteršta apie 80 proc. paimtų m÷ginių ir maksimalus mikotoksinų kiekis buvo didesnis kaip 100 µg/kg (Fazek et al., 2002).

Aflatoksinai (AFL) paplitę visame pasaulyje šilto bei dr÷gno klimato zonose. Dažniausiai nustatoma pašarin÷se žaliavose iš Indijos, Azijos ir Pietų Amerikos (Anonymousa, 2004). AFL producentai dažniausiai aptinkami žem÷s riešutuose, saul÷grąžose. Taip pat paplitę grūduose (sorgo, kukurūzų) ir jų produktuose, graikiškuose riešutuose, migdoluose, medviln÷s s÷klose, lazdyno riešutuose, pistacijose (Anonymousa, 2004). Mažesn÷s AFL koncentracijos nustatomos ir kviečiuose, miežiuose, žirniuose, avižose. Aflatoksinas M1 išsiskiria su karvių ir kitų žinduolių pienu, kurie šeriami užterštais AFL pašarais. 2000 m. Vokietijoje atlikti pašarų tyrimai parod÷, kad karv÷ms skirtos pašarin÷s žaliavos buvo užterštos < 0,3-04 µg/kg ir pašarų mišiniai karv÷ms - 0,1-1,4 µg/kg aflatoksinas

21 B1 (AFL B1). Italų mokslininkai nustat÷, kad kukurūzų silosas taip pat gali būti užterštas AFL B1 25-40 µg/kg ir kai silosavimo metu panaudojama skruzdžių rūgštis (Vallone et al., 1997).

Lietuvoje, prieš dešimtį metų, buvo paskelbta “Fusarium epidemija”. Tuomet, surinktuose iš skirtingų regionų ūkių žieminių kviečių, rugių bei vasarinių miežių 16 proc. m÷ginių DON koncentracija viršijo 100 µg/kg. NIV buvo aptiktas 13 proc. m÷ginių. HT-2 toksinas ir T-2 toksinas buvo rasti atitinkamai 27 proc. ir 8 proc. m÷ginių. Nedideli kiekiai 3-aceti-DON buvo aptikta tik keliuose bandiniuose drauge su DON. Bandiniuose, kuriuose buvo nustatyta didžiausia NIV koncentracija, rasta ir A grup÷s trichotecenų MAS, scirpenolio ir DAS. Šiais mikotoksinais labiausiai buvo užteršti miežiai iki 87 proc. (Keblys ir kt., 2000).

Lietuvoje, atlikus ochratoksinų grūduose tyrimus VICAM fluorimetru, OT koncentracija 1997-1999 metais svyravo nežymiai. 1997 m. OT nustatyta grūduose - 0,01 mg/kg, 1998 m. – 0,021 mg/kg, 1999 m. – 0,015 mg/kg (Bakutis, 2002).

Aflatoksinų (AFL) taip pat randama ir Lietuvoje išaugintuose grūduose. Pagal 1997-1999 m. tyrimus AFL nustatyta 0,0011-0,0054 mg/kg grūdų Lietuvoje (Bakutis, 2002).

2000-2002 metais Lietuvoje tirti mikotoksinų (deoksinivalenolo (DON), zearalenono (ZEN), aflatoksinų (AFL)) kiekiai žieminių ir vasarinių kultūrų grūduose. 2000 metais žieminių kultūrų grūduose vidutin÷ DON koncentracija buvo 0,39 mg/kg, ZEN-0,70 mg/kg, a f l a t o k s i n ų - 0,0030 mg/kg. Vasarinių kultūrų grūduose vidutin÷ DON koncentracija buvo 0,51 mg/kg, ZEN -0,10 mg/kg, A F L buvo mažiau nustatytos leistinos normos. 2001 metais žieminių kultūrų grūduose vidutin÷ DON koncentracija buvo 0,24 mg/kg, ZEN - 0,17 mg/kg, aflatoksinų - 0,0091 mg/kg. Vasarinių kultūrų grūduose vidutin÷ DON koncentracija buvo 0,37 mg/kg, ZEN - 0,14 mg/kg, AFL - 0,0039 mg/kg. 2002 metais žieminių kultūrų grūduose vidutin÷ DON koncentracija buvo 0,25 mg/kg, ZEN - 0,12 mg/kg, aflatoksinų - 0,0022 mg/kg. Vasarinių kultūrų grūduose vidutin÷ DON koncentracija buvo 0,46 mg/kg, ZEN - 0,09 mg/kg, AFL - 0,0021 mg/kg ( Bakutis, 2007).

Jei maksimali aflatoksinų koncentracija 2000-2002 metais neviršijo leistinos normos, tai gana dažnai ypač ZEN ir DON kiekis viršijo nacionaliniame standarte numatytas ribas. Maksimali ZEN koncentracija atskirais metais svyravo nuo 1,50 iki 4,90 mg/kg. Maksimalus DON kiekis svyravo nuo 1,50 iki 3,50 mg/kg (Bakutis, 2007).

2003–2005 m. Lietuvos žemdirbyst÷s institute vasariniuose ir žieminiuose javų grūdų m÷giniuose imunofermentiniu metodu buvo ištirta mikotoksinų deoksinivalenolo, zearalenono, T-2 toksino, ochratoksino A, aflatoksinų gausa. Nustatyta, kad Lietuvoje išaugintuose javų grūduose dažniausiai aptinkamas Fusarium genties grybų produkuojamas mikotoksinas DON. Juo užteršta 84,0–98,0% analizuotų grūdų m÷ginių. Vasarinių javų grūdai buvo gausiau užteršti šiuo toksinu nei žieminių. Vasarinių kviečių, miežių ir avižų

22 grūdai ZEN buvo užteršti labiau nei žieminių kviečių, rugių ir kvietrugių. Lietuvoje išaugintuose javų grūduose vyravo Fusarium poae, F. sporotrichioides – T-2 toksino producentai. T-2 toksino analiz÷s avižų grūduose parod÷ šio toksino tyrimo aktualumą, nes 2003–2005 m. tirti grūdai 100% buvo užteršti T-2 toksinu. Didesn÷s T-2 toksino koncentracijos buvo nustatytos ir vasarinių miežių bei žieminių rugių grūdų m÷giniuose. Vasarinių miežių grūdų m÷giniai 80,0% buvo užteršti ochratoksinu ir 42,0% iš jų nustatytos koncentracijos buvo didesn÷s nei 3,0 µg/kg, tuo tarpu jų užterštumas aflatoksinai (bendrai) siek÷ 67,9%, tačiau nustatyti kiekiai neviršijo ES reglamento nustatytų ribų (Mankevičien÷ ir kt., 2006).

Javų ir pašarinių žaliavų užteršimo gausa mikotoksinais skirtingo klimato zonose yra nevienoda. Tod÷l svarbu analizuoti mikotoksinų paplitimą ir pašarų užterštumą mikotoksinais įvairiose šalyse, kadangi šiuo metu daug pašarinių žaliavų ir grūdų importuojama iš kitų pasaulio šalių.

1.5. Mikotoksinų poveikis organizmui

Dabartiniu metu pabr÷žiama mikotoksinų svarba tiek žmonių, tiek gyvūnų mityboje (Hussein, 2001). Toksiškas jų poveikis laikomas, vienu iš etiologinių veiksnių gyvūnams, pasireiškiančių produktyvumo sumaž÷jimu, mažesniais priesvoriais, pašarų vartojimo efektyvumo sumaž÷jimu, reprodukcinių savybių sutrikimais, imunin÷s sistemos susilpn÷jimu, infekcinių susirgimų paūm÷jimais (CAST, 2003). Paprastai pašaruose esama keleto toksinų ir organizme pažeidžiama keletas organų-taikininių sistemų, tai sudaro papildomų sunkumų, diagnozuojant mikotoksikozes. Labai dažnai grūduose, pašaruose randama kartu DON, NIV, DAS, T-2, HT-2 ir kiti trichotecenai, OTA ir AFL, AFL B1 ir FUM B1, ZEN, DON, NIV (Sedmikova et al., 2001; Speijers, 2004).

Daugelis iš žinomų mikotoksinų pasižymi pirminiu poveikiu atskiroms organizmo sistemoms ar organams - taikiniams ir pagal šį poveikį yra klasifikuojami mikromicetų antriniai metabolitai. Mikotoksinai gali pasižym÷ti imunotoksiniu, hematopoetiniu, hepatotoksiniu, nefrotoksiniu, neurotoksiniu, teratogeniniu, mutageniniu, kancerogeniniu, dermatotoksiniu ir jų poveikiu reprodukcin÷ms organizmo sistemoms. Didžiausias d÷mesys skiriamas mikotoksinų imunosupresiniam poveikiui (CAST 2003; Fink-Gremmels, 2005).

Mikotoksinų poveikio diagnozavimas yra sud÷tingas ir sunkus, vertingi duomenys gaunami, atlikus pašarų ir sergančių gyvulių kraujo, šlapimo, išmatų kiekybinę mikotoksikologinę analizę (Dänicke, 2000).

Atrajotojai zearalenoną greitai paverčia α- ir ß-zearalenolį. Abu metabolitai turi estrogeninių savybių. Galvijams pasireiškia nevaisingumas, vaginitas, pablog÷ja

23 reprodukciniai rodikliai. Esant dideliems ZEN kiekiams apie 1-1,5 mg/kg galimi galvijų abortai. Esant galvijų racionuose apie 750 µg/kg ir 500 µg/kg DON pablog÷ja pašaro įsisavinimas, sumaž÷ja priesvoriai, pasireiškia diar÷ja ir sutrinka reprodukcin÷s funkcijos (Fink-Gremmels, 1999). Pašarai ZEN užteršti visame pasaulyje 44℅ iš 500 ÷minių. Įvairūs ZEN kiekiai yra randami beveik kiekviename žem÷s ūkio produkte, pašarų žaliavose ir paruoštuose pašaruose. ZEN labai dažnai nustatomas ir silose, 25-30 % paimtų m÷ginių. Užterštame kukurūzų silose šio mikotoksino koncentracija siekia 0,005 mg/kg, žol÷s silose -0,009 mg/kg (Dänicke, 2000).

Esant melžiamų galvijų pašaruose T-2 toksino, galvijams pasireiškia gastroenteritas, žarnyno hemoragija, didžojo prieskrandžio, žarnyno opos (Yiannikouris et al., 2003).

Dažniausiai iš ochratoksinų minimas ochratoksinas A, kuris yra toksiškiausias. Ypač palankios sąlygos šio mikotoksino gamybai susidaro dr÷gnų vasarų metu, netinkamai sand÷liuojant pašarus. Net ir nedideli ochratoksinų kiekiai sukelia toksinius efektus: galvijams (ypač jautrūs veršeliai) (Yiannikouris et al., 2003).

Aflatoksinas B1 aptinkamas pašaruose, užterštuose Aspergillus flavus ir A. parasiticus mikromicetais. Aflatoksinui B1 su pašaru patekus į melžiamų karvių organizmą, ten vyksta jo hidroksilinimo reakcija į medžiagų apykaitos produktą aflatoksiną M1. Šis toksinas pereina į pieną. Aflatoksinas M1 laikomas kancerogenu, tod÷l jo kiekis piene turi būti kontroliuojamas. Aflatoksino M1 koncentracija piene gali siekti 0,33 µg/l ir tokia gali išlikti 3-4 dienas po pašaro su÷dimo. (Food Standarts Agency, 2001).

Mažas toksinų kiekis pašaruose sukelia medžiagų apykaitos sutrikimus, kuriuos lydi patologiniai organizmo pakitimai, produkcijos maž÷jimas Didesni mikotoksinų kiekiai per virškinimo trakto gleivinę skverbiasi į giliau esančius audinius, pažeidžia nervus, kraujagysles, limfagysles ir patekę į kraujo apytakos ratą, išnešiojami po įvairius organus. (Fink-Gremmels, 1999; Garalevičien÷, 2005).

Parenchiminiams organams (kepenims, inkstams, blužniai) labai kenksmingas aflatoksinas, ochrotoksinas B, fomopsinas A bei citrininas, kurių poveikyje vystosi ląstelių nekroz÷, ciroz÷. Fusarium genties produkuojami mikotoksinai priskiriami prie neurotropinių ir kraujo gamybą trikdančių toksinų. Ligos pradžioje jie dirgina kaulų čiulpus, kurie degeneruoja. Šie mikotoksinai ardo kraujo kūnelius ir pačiame kraujo apytakos rate. Moniliforminas pažeidžia centrinę nervų sistemą: gyvuliai iš pradžių š÷lsta, v÷liau - koma ir galiausiai letali baigtis. Neurotropiškai organizmą veikia trichotecinai, skalsių alkaloidai. Jaunoms kiaulait÷ms šie mikotoksinai sukelia netikrą rują. Mikotoksinai T-2, skalsių alkaloidai sukelia odos uždegimą, nekrozę. Angliavandenių, riebalų ir baltymų apykaitą trikdo aflatoksinai, ochratoksinas B, T-2 toksinas (CAST, 2003).

24 Analizuojant mikotoksikozių priežastis ir pasireiškimo sąlygas pasteb÷ta, kad mikotoksinai nevienodai pavojingi skirtingoms gyvūnų rūšims. Gyvūnų rūšių ir organų geb÷jimas asimiliuoti, aktyvuoti ir deaktyvuoti AFL B1, paaiškina organų specifinius simptomus ir skirtingų rūšių jautrumą aflatoksinams (Fink-Gremmels, 2005). Jautresni šiam mikotoksinui yra kiaul÷s, triušiai, ančiukai, kalakučiukai, up÷takai. Mažiau jautrios žiurk÷s, vištos (Devegowda et al., 1998).

Pasteb÷ta, kad ochratoksinai gali pereiti placentos barjerą ir apnuodyti vaisių. Net ir nedidelis ochratoksinų kiekis veikia kancerogeniškai, sukeldamas pastebimus klinikinius intoksikacijos požymius. D÷l ochratoksinų poveikio atsiranda inkstų ir kepenų piktybinių navikų. Patekę su pašaru mikotoksinai kaupiasi kraujo serume. Galvijai ochratoksinams žymiai atsparesni d÷l prieskrandžių mikrofloros veiklos (CAST, 2003).

1.6. Mikotoksinų nustatymo metodai

Mikotoksinų tyrimams naudojami įvairūs analitiniai metodai: imunoanaliz÷, imunochemin÷ analiz÷, plonasluoksn÷ ir skysčių chromatografija (Wilkes et al., 1998).

Mikotoksinų analiz÷ maisto produktuose, pašaruose ir grūduose susideda iš penkių pagrindinių nustatymo etapų:

• m÷ginių atrinkimo; • m÷ginių paruošimo; • ekstrakcijos; • valymo;

• mikotoksinų kiekio nustatymo.

Nustatant mikotoksinų kiekį grūduose m÷ginių, yra būtinas m÷ginių pa÷mimas pagal aiškiai apibr÷žtą m÷ginių atrinkimo planą. Nuo m÷ginio pa÷mimo priklauso analiz÷s rezultatai (Whitaker et al., 1994). Be to, DON nustatymas kviečiuose ir miežiuose rodo santykiškai vienarūšį aptikimą DON-užterštuose grūduose (Freese et al., 2000; Whitaker et al., 2000).

Paruošiant standartinį m÷ginį analizei, tiriamasis m÷ginys yra sumalamas, sumaišomas taip, kad toksino koncentracija paskutin÷je tiriamojoje porcijoje būtų tokia pati kaip ir visuose grūduose. Dažniausiai naudojama kietafaz÷ ekstrakcija su acetonitrilo-vandenio mišiniu, valymas imunin÷je ar silikagelio kolon÷le (Malone et al., 2000). Paskutiniais metais pagamintos valymo kolon÷l÷s atskiriems toksinams DON ir T-2, išsaugojančios toksinų savybes po valymo. Be to, kolon÷l÷s yra tik pritaikytos atskiriems toksinams ir išgavimas yra dar nepakankamas (Scott et al., 1997).

25 D÷l metodų jautrumo, specifiškumo ir tikslumo, chromatografiniai metodai taikomi plačiausiai. Plonasluoksn÷ chromatografija (PLCh) buvo pirmas analitinis metodas naudojamas vienkartiniu nustatymui atskirų trichotecenų javuose. Be to, PLCh metodai pasižymi jautrumo ir specifiškumo stoka. PLCh dažniausiai naudojamas trichotecenų išplitimo užterštuose javuose analizei (Fernandez et al., 1994).

Aukšto sl÷gio skysčių chromatografijos metodas (AESC) su UV detekcija naudojamas B tipo trichotecenų nustatymui javų m÷giniuose, net jei nustatymo ribos yra žymiai aukštesn÷s (Langseth et al., 1998; Trucksess et al., 1998). A trichotecenų nustatymui n÷ra tinkama UV detekcija, kadangi ši grup÷ trichotecenų parodoma tik absorbcijos pabaigoje. Paskutiniais metais, skystin÷ chromatografija su masių spektrometru (MS) s÷kmingai taikoma A ir B trichotecenų kiekio nustatymui javų m÷giniuose (Berger et al., 1999; Razzazi-Fazeli et al., 1999).

Dabar yra dažniausiai taikoma kapiliarin÷ dujin÷ chromatografija (GC) su vienu iš dviejų: elektroniniu detektoriumi (ECD) ar masių spektrometru (MS) išskyrimui ir nustatymui trichotecenų (Langseth et al., 1998). Hidroksil grup÷s trichotecenų išgauti reikiamą lakumą ir padidinti jautrumą, yra pirma nustatoma GC, nors šis etapas gali būti praleistas (Onji et al., 1998). B trichotecenų nustatymui ir išgavimui su GC-ECD, naudojama trimetilsilio (TMS) reagentas, fluorino turintis reagentas, toks kaip pentafluoropropionilas (PFP) ar heptafluorobutirilas (HFB), padidinantys jautrumą A trichotecenams (Langseth et al., 1998). Naudojant GC- MS abiejų tipų A ir B trichotecenams nustatyti, išgavimas su PFP ar HFP reagentais yra taikomas pagal Langseth (1998).

Nors chromatografin÷s analiz÷s metodai dažniausiai taikomi nustatymui ir įvertinimui trichotecenų užkr÷timo lygio, šie analiz÷s metodai reikalauja specialaus kruopštumo pasiruošimo ir įrangos.

Imunocheminiai metodai

D÷l ypatingo m÷ginio išgryninimo ir brangios įrangos reikalaujančių cheminių metodų, pastaruoju metu paplito alternatyvūs metodai, tokie kaip imunoheminiai ir biologiniai. Imunofermentinio (ELISA) metodo pagrindas antikūno-antigeno reakcija, antikūnų panaudojimas prieš beveik visus pagrindinius mikotoksinus (4 pav.) (Chu, 1996).

ELISA metodas naudojamas mikotoksinų paplitimo analizei. Imunin÷ analiz÷ paremta jautrumu, greitumu ir tikslumu mikotoksinų monitoringe ir taikoma esant dideliems m÷ginių kiekiams vienu metu (Trucksess et al., 1995; Park et al., 1996).

Be to, pilnas m÷ginio išgryninimas paprastai n÷ra būtinas, nors jautrumas padidinamas naudojant valymą (filtravimą). Be to, metodo specifiškumą lemia antikūnų panaudojimas,

26 būtent prieš tam tikrą mikotoksiną ar specifinę grupę ir kitas toksines medžiagas m÷ginyje. Be to komerciniai ELISA testai yra brangūs.

4 pav. Mikotoksinų kiekio nustatymas ELISA metodu grūduose

Biologiniai metodai

Greitų, jautrių ir nebrangių analitinių metodų reikm÷ žinomų ir nežinomų toksinių medžiagų kiekio nustatymui pašaruose, leido per paskutinius 30 metų vystytis biologin÷s analiz÷s metodams (Yates, 1986). Šie metodai ar bioanaliz÷ gali būti panaudojami prieš cheminę analizę, esant dideliam m÷ginių skaičiui ir nustatant toksinį m÷ginio aktyvumą. Mikotoksinų toksiškumui nustatyti naudojamos jūrinių krevečių lervos, miel÷s (Engler et al., 1999), bakterijos ir viščiukų embrionai (Ali-Vehmas et al., 1998). Be to, paprasčiausias mikotoksinų nustatymas biologiniais metodais yra panaudojimas in vitro ląstelių kultūrų (Visconti et al, 1991; Rotter et al., 1993; Hanelt et al., 1994; Winderstrand et al., 2001). Trichotcenų citotoksiškumas nustatomas skirtingomis taškų reikšm÷mis, kaip baltymų ar DNR sintez÷s slopinimu, ląstelių membranos funkcijų pakitimo ir metabolitinio aktyvumo mažinimu. Literatūros duomenimis daugelis ląstelių kultūrų, naudojamų toksiškumo analizei, turi pasižym÷ti dideliu jautrumu mikotoksinų koncentracijoms ng/ml. Čia yra didel÷ tyrimo svarba tarp grynų toksinų ir jų junginių nustatymo m÷giniuose. Išvengiant paklaidų teigiamuose rezultatuose, būtina atsižvelgti į ekstraktų išvalymo kokyb÷, citotoksinius komponentus m÷giniuose (Norred et al., 1990; Langseth et al, 1997).

GRŪDAI EKSTRAKCIJA MILTAI ELISA TESTAS ELISA SKAITYTUVAS DUOMENYS

27 1.7. Dokumentai reglamentuojantys mikotoksinų leidžiamus lygius pašaruose

Daugelyje šalių maisto produktų užterštumas mikotoksinais yra reglamentuojamas ir kontroliuojamas. Lietuvoje išsamūs maisto produktų ir žaliavos tyrimai neatliekami, daugiausiai tiriami pašarai. Vadovaujantis ES komisijos rekomendacija (2006m. rugpjūčio 17d. Nr. 2006/576/EB) išleistas Lietuvos Respublikos žem÷s ūkio ministro įsakymas (2006m. gruodžio 27d. Nr. 3D-507) (3 lentel÷) d÷l žem÷s ūkio ministro 2003m. birželio 4d. įsakymo ,,D÷l produktų, skirtų gyvūnų mitybai, privalomųjų saugos reikalavimų“ techninio reglamento patvirtinimo ir žem÷s ūkio ministro 2001m. birželio 21d. įsakymo Nr.206 ,, D÷l privalomųjų prekinių pašarų saugos reikalavimų techninio reglamento“ patvirtinimo ‚,Pripažinimo netekusiu galios“ pakeitimo, kuris reglamentuoja mikotoksinų leidžiamus kiekius pašarin÷se žaliavose, visaverčiuose pašaruose.

3 lentel÷. Veterinariniai mikotoksinų atitikimo reikalavimai pašarams.

Mikotoksinai Pašarai Maksimalus kiekis, mg/kg(ppm), 12% dr÷gnio pašaruose Pašarin÷s medžiagos: -grūdai ir gūdų produktai 0,25 Ochratoksinas A

Papildomos pašarin÷s medžiagos ir visaverčiai pašarai:

- papildomos pašarin÷s medžiagos ir visaverčiai pašarai kiaul÷ms;

- papildomos pašarin÷s medžiagos ir visaverčiai pašarai naminiams paukščiams

0,05 0,1

Pašarin÷s medžiagos:

- grūdai ir grūdų produktai, išskyrus šalutinius kukurūzų produktus;

- šalutiniai kukurūzų produktai

8 12

Deoksinivalenolis (DON)

Papildomos pašarin÷s medžiagos ir visaverčiai pašarai, išskyrus:

- papildomas pašarines medžiagas ir visaverčius pašarus kiaul÷ms;

- papildomas pašarines medžiagas ir visaverčius pašarus veršeliams (<4 m÷nesių), ÷riukams ir ožiukams

0,9 2

Zearalenonas (ZEN)

Pašarin÷s medžiagos:

- grūdai ir grūdų produktai, išskyrus šalutinius kukurūzų produktus;

- šalutiniai kukurūzų produktai

2 3

28

Papildomos pašarin÷s medžiagos ir visaverčiai pašarai: - papildomos pašarin÷s medžiagos ir visaverčiai pašarai paršeliams ir kiaulait÷ms (jaunoms paršaved÷ms);

- papildomos pašarin÷s medžiagos ir visaverčiai pašarai paršaved÷ms ir penimoms kiaul÷ms; - papildomos pašarin÷s medžiagos ir visaverčiai pašarai veršeliams, penimoms karv÷ms, avims, ožkoms (įskaitant ožiukus).

0,1

0,25 0,5

Fumonizinas B1+B2

Pašarin÷s medžiagos:

- kukurūzai ir kukurūzų produktai. Kombinuotieji pašarai:

- kiaul÷ms, arkliams, triušiams ir naminiams gyvūn÷liams;

- žuvims;

- naminiams paukščiams, veršeliams(<4 m÷nesių) ÷riukams ir ožiukams;

- suaugusiems atrajotojams (>4 m÷nesių) ir audin÷ms

60 5 10 20 50 Aflatoksinas B1

Pašarin÷s žaliavos, išskyrus:

-žem÷s riešutus, koprą, palmių branduolius, medviln÷s s÷klas,babasų, kukurūzus ir perdirbimo produktus. Visaverčiai pašarai galvijams, avims ir ožkoms, išskyrus:

- melžiamus gyvūnus; - veršelius ir ÷riukus

Visaverčiai pašarai kiaul÷ms ir paukščiams, išskyrus jauniklius

Kiti visaverčiai pašarai

Pašarų papildai galvijams, avims ir ožkoms, išskyrus pašarų papildus melžiamiems gyvūnams, veršeliams ir ÷riukams

Pašarų papildai kiaul÷ms ir naminiams paukščiams paukščiams, išskyrus jauniklius

Kiti pašarų papildai

0,05 0,02 0.05 0.005 0,01 0,02 0,01 0,02 0,01 0.005

Šiame įstatyme reglamentuotos aflatoksino normos atitinka daugelyje Europos šalių priimtus įstatymus. Europoje aflatoksinų normos yra grieštai reglamentuojamos ir skirtingos įvairiose šalyse. Priklausomai nuo šalies, šios normos pašaruose svyruoja tarp 5-25 µg/kg (ppb).

29 2. TYRIMŲ ATLIKIMO VIETA IR METODIKA

Mokslinis tiriamasis darbas atliktas – LVA Maisto saugos ir gyvūnų higienos katedros, Gyvūnų gerov÷s tyrimų laboratorijoje.

Tiriamasis darbas prad÷tas 2007 metų spalio m÷nesį, siekiant identifikuoti, grūduose bei kombinuotuosiuose pašaruose, esamas fuzariotoksinų (deoksinivalenolo, T-2 - toksino, zearalenono) koncentracijas, rudens laikotarpiu.

Tyrimui naudoti atsitiktinai atrinkti kviečių, miežių, avižų, kvietrugių bei kombinuotojo pašaro m÷giniai iš Lietuvos apskričių, Estijos bei Latvijos vietovių. 2007 m. rudens laikotarpyje (spalio-lapkričio m÷n.) surinkta n=63 grūdų ir n=32 kombinuotojo pašaro m÷giniai. Surinktuose m÷giniuose buvo nustatytos mikotoksinų (DON, T-2, ZEN) koncentracijos. 2008 metų pavasarį (kovo-balandžio m÷n.), iš tų pačių žem÷s ūkio bendrovių buvo pakartotinai surinkti grūdų m÷giniai ir paimti kombinuotųjų pašarų m÷giniai. Per pastarąjį laikotarpį surinkti n=57 grūdų ir n=9 kombinuotojo pašaro m÷giniai bei juose nustatyti min÷ti mikotoksinai.

Fuzariotoksinų (DON, T-2, ZEN) nustatymui m÷giniai imti pagal aiškiai apibr÷žtą m÷ginių atrinkimo planą, atsižvelgiant į esančios situacijos sąlygas, aplinkybes. M÷giniai buvo supilami į švarų indą, išmaišomi ir galutinis m÷ginys, nemažesnio kaip 1 kg svorio, supilamas į švarų maišelį tolimesniam tyrimui. Mikotoksinų nustatymui turimi m÷ginai buvo išdžiovinami 40oC temperatūroje ir užšaldomi -20oC temperatūroje iki tyrimo.

Mikotoksinų deoksinivalenolio, T-2 toksino bei zearalenono kiekiams m÷giniuose nustatyti, buvo naudojama imunofermentin÷ analiz÷ (ELISA). Siekiant nustatyti grūdų ir pašarų užterštumą mikotoksinais, išaiškinti galimus mikotoksinų kiekio kitimo d÷sningumus, DON, T-2, ZEN, koncentracijos pašarinių grūdų ir pašarų m÷giniuose buvo nustatytos panaudojus komercinius AgraQuant® Deoxinivalenol, AgraQuant® T-2, AgraQuant® Zearalenone (ROMER LABS®, JAV) rinkinius.

Imunin÷ fermentin÷ analiz÷ paremta antigeno ir antikūno sąveika. Mikrokiuvečių sienel÷s padengtos toksino antikūnais. Įd÷jus toksino standarto ar m÷ginio ekstrakto tirpalo ir fermento – toksino komplekso, laisvas ir su fermentu surištas toksinas konkuruoja d÷l antikūno rišančiųjų saitų. Nesureagavę fermento kompleksai pašalinami plaunant. Įpylus fermento substrato ir chromogeno, surišto fermento kompleksas keičia chromogeno spalvą. Fermentin÷ reakcija sustabdoma prid÷jus specifinio reagento, kuris pakeičia chromageno spalvą. Absorbcija matuojama fotometriškai ir remiantis teigiamų kontrolių pagalba sudaroma kreiv÷ apskaičiuoti tikslią toksino koncentraciją (Wilkinson, 1991; Bennett, 1994; Chu, 1996). Toksinų koncentracijos buvo nustatytos pagal gamintojo (ROMER LABS®, JAV) metodikas.

30 Deoksinivalenolo (DON) nustatymo metodika. 0,5 kg pašarinių grūdų ar pašarų m÷ginys sumalamas Romer Series II malūnu ir sumaišomas.

20 g sumalto m÷ginio dedama į užsukamą indą su 100 ml distiliuotu vandeniu, kratoma kratykl÷je 3 min. (max. greičiu), filtruojama per Whatman No. 1 filtrą. Pagaminti ekstraktai praskiedžiami 1:4 distiliuotu vandeniu. Į sumaišymo kiuvetes įnešama po 200 µl deoksinivalenolo – konjugato ir po 100 µl kontrolei standartinių tirpalų (0 ppm, 0,250 ppm, 1,000 ppm, 2,000 ppm, 5,000 ppm) ir m÷ginio ekstrakto sumaišoma. Po 100 µl sumaišyto tirpalo pernešama į antikūnais padengtas akutes. Atsargiai judinant laikiklį pirmyn ir atgal, sumaišoma. Inkubuojama kambario temperatūroje 15 min. Apvertus laikiklį iš kiuvečių išpilamas tirpalas, kad visas tirpalas susigertų į absorbuojantį popierių. Tokiu būdu kiuvet÷s praplaunamos 5 kartus po 250 µl distiliuoto vandens. Į kiuvetes pilama po 100 µl „K-blue“ substrato tirpalo ir atsargiai judinant laikiklį pirmyn ir atgal, sumaišoma. Inkubuojama 5 min. kambario temperatūroje. Reakcija sustabdoma įpilant po 100 µl „Red Stop“ reagento. Absorbcija matuojama ir mikotoksinų koncentracijos nuskaitomos optinio tankio nuskaitymo prietaisu Stat Fax 303 Plus (Neogen, JAV), panaudojant 450 nm filtrą. Mikotoksino DON aptikimo riba - 0,200 ppm.

T-2 toksino nustatymo metodika. 0,5 kg pašarinių grūdų ar pašarų m÷ginys sumalamas Romer Series II malūnu ir sumaišomas. 20 g sumalto m÷ginio dedama į užsukamą indą su 100 ml 70% metanolo tirpalu, kratoma kratykl÷je 3 min. (max. greičiu), filtruojama per Whatman No. 1 filtrą. Pagaminti ekstraktai praskiedžiami 1:10 distiliuotu vandeniu. Į sumaišymo kiuvetes įnešama po 200 µl T-2 toksino – konjugato ir po 100 µl kontrolei standartinių tirpalų (0 ppb, 75 ppb, 150 ppb, 300 ppb, 500 ppb) ir m÷ginio ekstrakto sumaišoma. Po 100 µl sumaišyto tirpalo pernešama į antikūnais padengtas akutes. Atsargiai judinant laikiklį pirmyn ir atgal, sumaišoma. Inkubuojama kambario temperatūroje 10 min. Apvertus laikiklį iš kiuvečių išpilamas tirpalas, kad visas tirpalas susigertų į absorbuojantį popierių. Tokiu būdu kiuvet÷s praplaunamos 5 kartus po 250 µl distiliuoto vandens. Į kiuvetes pilama po 100 µl „K-blue“ substrato tirpalo ir atsargiai judinant laikiklį pirmyn ir atgal, sumaišoma. Inkubuojama 5 min. kambario temperatūroje. Reakcija sustabdoma įpilant po 100 µl „Red Stop“ reagento. Absorbcija matuojama ir mikotoksinų koncentracijos nuskaitomos optinio tankio nuskaitymo prietaisu Stat Fax 303 Plus (Neogen, JAV), panaudojant 450 nm filtrą. Mikotoksino T-2 toksino aptikimo riba – 35 ppb.

Zearalenono (ZEN) nustatymo metodika. 0,5 kg pašarinių grūdų ar pašarų m÷ginys sumalamas Romer Series II malūnu ir sumaišomas. 20 g sumalto m÷ginio dedama į užsukamą indą su 100 ml 70% metanolo tirpalu, kratoma kratykl÷je 3 min. (max. greičiu), filtruojama per Whatman No. 1 filtrą. Pagaminti ekstraktai praskiedžiami 1:5 70% metanolo tirpalu. Į

31 sumaišymo kiuvetes įnešama po 200 µl zearalenono – konjugato ir po 100 µl kontrolei standartinių tirpalų (0 ppb, 40 ppb, 100 ppb, 300 ppb, 1000 ppb) ir m÷ginio ekstrakto sumaišoma. Po 100 µl sumaišyto tirpalo pernešama į antikūnais padengtas akutes. Atsargiai judinant laikiklį pirmyn ir atgal, sumaišoma. Inkubuojama kambario temperatūroje 10 min. Apvertus laikiklį iš kiuvečių išpilamas tirpalas, kad visas tirpalas susigertų į absorbuojantį popierių. Tokiu būdu kiuvet÷s praplaunamos 5 kartus po 250 µl distiliuoto vandens. Į kiuvetes pilama po 100 µl „K-blue“ substrato tirpalo ir atsargiai judinant laikiklį pirmyn ir atgal, sumaišoma. Inkubuojama 5 min. kambario temperatūroje. Reakcija sustabdoma įpilant po 100 µl „Red Stop“ reagento. Absorbcija matuojama ir mikotoksinų koncentracijos nuskaitomos optinio tankio nuskaitymo prietaisu Stat Fax 303 Plus (Neogen, JAV), panaudojant 450 nm filtrą. Mikotoksino ZEN aptikimo riba – 20 ppb.

Mikotoksinų koncentracijos buvo apskaičiuotos pagal absorbciją, panaudojus kalibracinę kreivę.

Statistinis duomenų apdorojimas. Tyrimo duomenys įvertinti, skaičiavimai atlikti statistiniu paketu SPSS 13.0 for Windows. Buvo apskaičiuoti gautų duomenų aritmetiniai vidurkiai (Vid.), vidurkių paklaidos (mx), įvairavimo koeficientai (Cv).

Skirtumo tarp grupių patikimumo kriterijui (p) nustatyti taikytas Stjudento daugybinio palyginimo metodas. Duomenys laikomi patikimais pagal Stjudentą, kai p<0,05 (Juozaitien÷, 2001). Duomenims grafiškai pateikti panaudota Microsoft Excel 7,0 programa.