Dipartimento Ostetrico Ginecologico e Pediatrico Laboratorio di Genetica
Dott.ssa Fabrizia Franchi – Direttore f.f.
Test genetici nella Sindrome di Turner
Reggio Emilia, 25.10.16
Fabrizia Franchi
Cariotipi associati alla Sindrome di Turner
Monosomia totale o parziale del cromosoma X Mancanza totale o parziale del secondo
cromosoma sessuale
45,X
46,X,der(X) 46,X,der(Y)
45,X/46,X….
Origine cromosomica
•Non-disgiunzione meiotica – 45,X
•Non-disgiunzione mitotica postzigotica durante le prime fasi dell’embriogenesi
– mosaicismo: 45,X/46,XX - 45,X/47,XXX – 45,X/46,XX/47,XXX - 45,X/46,XY
•Frammentazione di un cromosoma durante la meiosi – 46,X,i(Xq) - 46,X,del(Xp) - 46,X,del(Y)
Bondy 2013, Hook & Warburton 2014
Origine cromosomica
Non-disgiunzione meiotica durante la gametogenesi
22,(-X o –Y) + 23,X = 45,X
23,X + 22,-X = 45,X
45,X
m
45,X
p
X
Origine cromosomica
• Non-disgiunzione meiotica 45,X
• Non-disgiunzione mitotica postzigotica durante le prime fasi dell’embriogenesi
mosaicismo: 45,X/46,XX - 45,X/47,XXX – 45,X/46,XX/47,XXX - 45,X/46,XY
• Frammentazione di un cromosoma durante la meiosi 46,X,i(Xq) - 46,X,del(Xp) - 46,X,del(Y)
Bondy 2013, Hook & Warburton 2014
Origine cromosomica
Non-disgiunzione mitotica postzigotica durante le prime fasi dell’embriogenesi
Origine cromosomica
• Non-disgiunzione meiotica 45,X
• Non-disgiunzione mitotica postzigotica durante le prime fasi dell’embriogenesi
mosaicismo: 45,X/46,XX - 45,X/47,XXX – 45,X/46,XX/47,XXX - 45,X/46,XY
• Frammentazione di un cromosoma durante la meiosi 46,X,i(Xq) - 46,X,del(Xp) - 46,X,del(Y)
Bondy 2013, Hook & Warburton 2014
Origine cromosomica
La perdita del cromosoma riarrangiato (X o Y)
in alcune cellule durante lo sviluppo embrionale
→ linee cellulari a mosaico:
45,X/46,X,i(Xq) etc.
Caratteristiche genetiche
•Unica monosomia apparentemente‘ completa’ compatibile con la vita
•Circa il 3% delle gravidanze clinicamente accertate 45,X
•Severa mortalità intrauterina (circa il 99% dei concepiti con assetto
cromosomico 45,X viene abortito spontaneamente durante il primo trimestre)
•Solo l’1% dei concepiti 45,X arrivano alla nascita
•Necessità della presenza di una seconda linea cellulare per assicurare la sopravvivenza dell’embrione (‘rescue line’)
Held 1992, Ogata & Matsuo 1995, Fernandez 1996, Hassold 2007, Oliveira 2009, Hook & Warburton 2014
Tutti i soggetti con fenotipo turneriano e cariotipo 45,X dovrebbero ‘portare’ una linea cellulare con un secondo
cromosoma sessuale anche solo
in alcuni distretti...
Table 1 Turner syndrome karyotypes
Karyotype percentage of TS case(%)
45,X
45 46,X,i(X)q10)w/ or w/O 45,X
15-18 46,X,+mar or +r w/or w/o 45X
7-16 45,X/46,XX or 45,X/47,XXX
7-16 46,X,del(Xp) w/ or w/o 45,X
2-5
46,XY or 46,X,del(Y) or 46,X,r(Y) w/ 45,X 6-11
Others 2-8
Incidenza delle anomalie cromosomiche
MOSAICISMO COME INDIVIDUARLO?
Vanno controllati i cariotipi omogenei?
Con quali tecniche?
Su quali tessuti?
Che esclusione fare?
Tecniche di indagine
Citogenetica standard
Analisi di metafasi su SP
L’analisi di 30 metafasi (identifica mos. al 10% con lo 0.95 di conf.) Risoluz. 500 bande
Citogenetica molecolare (FISH)
Sonde painting (X) per caratterizzare anomalie strutturali Sonde telomeriche per evidenziare delezioni terminali
Sonde alfoidi (CEP X/CEPY) per ricerca mosaicismi
a-CGH/MLPA
Analisi del Cariotipo
•«La raccomandazione di esaminare 16 metafasi si basa sulla possibilità di escludere un mosaicismo con una linea cellulare rappresentata al 14% (con limite di confidenza del 90%) o al 26% (con limite di confidenza del 99%) (Hook, 1977).
•Qualora esista il sospetto clinico di un possibile mosaicismo oppure
dall’analisi delle prime 16 metafasi venga rilevata una aneuploidia (esclusa la monosomia di un autosoma) o un riarrangiamento di struttura, è opportuno estendere il conteggio fino a un massimo di 100 metafasi.
•E’ opportuno segnalare i mosaicismi con bassa frequenza nei soggetti con fenotipo sindromico. L’estensione dell’indagine citogenetica ai fibroblasti da biopsia cutanea va eseguita solo se espressamente richiesta dal clinico e nell’interesse del paziente.
•La FISH può essere adatta a confermare un sospetto mosaicismo, se è
disponibile la sonda opportuna.»
Hook EB, Am J Hum Genet 1977.
Un mosaicismo può essere
escluso solo in termini di
probabilità...
Mosaico ‘criptico’
< 10%
(Schad 1996)
Possibili tessuti da utilizzare per le indagini FISH:
Cellule da colture di fibroblasti (derivazione ectodermica-invasivo)
Cellule non coltivate da mucosa buccale (derivazione ectodermica-non invasivo) Cellule da sedimento urinario (derivazione endodermica-non invasivo)
Cellule da sangue periferico (derivazione mesoderma-poco invasivo)
MOSAICISMO COME INDIVIDUARLO?
Vanno sempre controllati i cariotipi omogenei?
Con quali tecniche?
Su quali tessuti?
Che esclusione fare?
Mucosa buccale Sedimento urinario
FISH su cellule interfasiche non coltivate
n° paz. Età diagnosi Cariotipo prenatale
Cariotipo postnatale
Sequenze Y Eco pelvica Altri dati clinici
3 4a4m 45,X negative
ovaio dx omog <0,5cm sx non evidenziato
7 16a2m 45,X
Ecocardiogramma: valvola mitralica con insufficienza di grado lieve. Valvola aortica tricuspide con traccia di insufficienza. Lieve
insuficcienza tricuspidale, cubito valgo;
scoliosi dorsale
8 6a9m 45,X
ovaio dx:omogeneo11X5X5mm, ovaio sx 8x4x4mm
15 5a11m 45,X negative
Utero in asse di dimensioni inferiori per l’eta (DL 3,5cm) e morfologia regolare.
Rima endometriale sottile e lineate;
Ovaie entrambe visualizzate di piccole dimensioni (1x1,5cm) a struttura
omogenea e morfologia regolare
24 17a9m 45,X
25 19a11m 45,X negative
aorta bicuspide, unghie iperconvesse, facies triangolare, malocclusione,padiglioni auric
impianto basso
Altezza 146,7cm (<3° +1+2SD per le curve specifiche,Esame audiometrico: ipoacusia trasmissiva,Teletelia; cubito valgo; molto lieve
brachimetacarpia IV-V raggio; unghie lievemente iperconvesse
Altezza 149cm (90-97°).Facies triangolare.Unghie
iperconvesse.Brachimetacarpia del IV e V raggio bilaterale
Altezza 143,3cm (media -1SD per le curve specifiche).Toracica compatibile con la
condizione. Nevi multipli
Monosomia X omogenea
n° Età diagnosi
Cariotipo
prenatale Cariotipo sangue
Sequenze Y Eco pelvica Altri dati clinici
1 10m 45,X/46,XX
Lieve brachimetacarpia del IV e V raggio bilaterale
2
2a5m 45,X/47,XXX 45,X (39%)/ 47,XXX(61%)
Ovaio Dx volume <0,4cm3, con follicolo 3mm; Ovaio
Sx volume <0,5cm3 con follicolo di 2,6cm
Eco renale: modesta ectasia della pelvi renale sin con diametro massimo di 0,5cm, unghie lievemente ipoplasiche a livello delle mani e non significativam iperconvesse a livello mani
4 6a2m 45,X/46,XX 45,X(39%)/46,XX(60,4%)
altezza 108,9cm (25°+1+2SD per le curve specifiche) lieve teletelia
6 5a10m 45,X(21,5%)/46,XX(78,5%)
altezza 101cm lieve brachimetacarpia V raggio
9
9m 45,X/46,XX 45,X(16%)/46,XX(84%)
ovaio dx disomogeneo 0,272cm3, ovaio sx disomog 0,247cm3
10 5m 45,X/46,XX 45,X(4,9%)/46,XX(95,1%) lunghezza 68cm (97°)
11 2a 45,X/46,XX
12
4a 45,X/46,XX 45,X(41%)/46,XX(59%) negative
ovaio dx vol 0,32cm3 con micro foll, ovaio sx vol 0,32cm3 con foll 4mm
altezza 102cm (75°) cubito valgo lieve bilaterale
13
8a4m 45,X(80%)/46,XX(20%) negative ovaie non visibili
altezza 108cm, ritardo cognitivo di grado medio, ritardo linguaggio importante, microcrania, epicanto sx,
micrognatia,teletelia,cute un po’ lassa,pectus liev excavatum,brachimetacarpia, mani:solco palmare unico a sx.
14
6a8m 45,X/46,XX
utero reg proporz transazi;
ovaio dx vol 1,36 con follicoli di 2-4mm, ovaio sx con follicolo 4mm
17
12a 45,X/46,XX 45,X(2%)/46,XX(98%)
Pervieta della fossa ovale di 2,5mm con shunt sin-dx.Unghie: lievemente iperconvesse livello dei piedi
18
5m 45,X/47,XXX 45,X(50,3%)/47,XXX(49,7%) negative
Lunghezza 65cm (75-90° per le curve specifiche) Solco palmare unico
bilaterale.Unghie: un po’ iperconvesse a livello del 5° dito delle mani
Aneuploidie a mosaico
n° Età diagnosi
Cariotipo prenatale Cariotipo sangue Sequenze Y Eco pelvica Altri dati clinici
19 11a9m 45,X/47,XXX 45,X(6%)/47,XXX(94%)
Altezza:143cm (25°).Ecocardiograma: piccolo DIA tipo OS con Sin-dx shunt. asimmetria degli arti inferiori
21 45,X/46,XX/47,XXX/48,XXXX
22 14a 45,X/46,XX 45,X(2,6%)/46,XX(97,4%) altezza 159,5(25°-50°)no evidenze turneriane
23 9a4m 45,X/46,XX
Altezza 124cm (90-97°).Unghie
iperconvesse.Brachimetacarpia del IV e V raggio bilaterale
27 21a6m 45,X(39%)/46,XX(61%) negative
Altezza 145,5cm (<3°).Lievisima brachimetacarpia del IV e V raggio bilaterale.Menarca spontaneo e cicli regolari
28 13a 45,X(58%)/46,XY(42%) positivo (FISH)
Utero abteversi ed ipoplastico (2,2x1,2x0,7cm) di volume con circa 1cc e rapporto C/c=1
29 15 gg 45,X/46,XX 45,X(2%)/46,XX(98%) segni clinici non disponibili
32 38anni
45,X(8%)/46,XX(88,7%)/
47,XXX(3,3%)
35 28anni 45,X(53%)/46,XX(47%)
riscontro accidentale cariotipo su midollo
Aneuploidie a mosaico
n°
Età diagnosi Cariotipo prenatale
Cariotipo postnatale
Sequenze Y Eco pelvica Altri dati clinici
5 14a4m 45,X(77%)/46,X,i(X)(q10)(23%) ne gative
rene ferro cavallo, pervietà foss a ovale, altezza150,5cm ipotiroidis m o, celiachia
20 20a 45,X/46,X,i(X)(q10)
annessi non vis ibili fenotipo com patibile con la condizione di base; unghie ipe rconvesse
26 10a4m 45,X/46,X,i(X)(q10) ne gative
Utero della lunghezza di circa 3cm ; Ovaia scarsam ente visualizzabili, appare nte m ente di dim e nsioni ridotte
Alte zza 122cm (<<3°).Viso vagam ente triangolare, rim e palpe brali lievem enta dow n-slanting, palato ogivale.Unghie iperconvesse.Brachim etacarpia del IV e V raggio bilaterale
30 12anni 45,X(70%)/46,X,del(X)(p11.4)(30%) ne gative
Ritardo m entale lieve , obes ità, bassa statura, asim m e tria, dism orfism i,
clinodattilia 4-5dito, genu recurvatum , piedi piatti,brachidattilia m ani/pie di
31 45,X(31%)/46,X,i(X)(q10)(69%)
utero infantile, ovaie piccole, ass enza follicoli
infertilità
33 9anni 45,X(94,8%)/46,X,i(X)(q10)(5,2%)
bassa statura, scarso accres cim ento, brachidattilia
34 31anni 45,X(36%)/46,X,del(X)(q22.3)(64%) ne gative
utero re troverso ipolasico, diam ant-post m m 18, endom etrio m m 3,ovaio sx m m 16x9, no ovaio dx
ipogonadism o ipogonadotropo
36 14anni 45,X(88%)/46,X,del(X)(p11.4p22.3)(12%)
bassa statura, dism orfism i m inori suggestivi, brachim e tacarpia V raggio bilat
38 12anni 46,X,dup(X)(q12q23)
ritardo psicom otorio e linguaggio,difficoltà apprendim ento,epilessia,dis m orfism i facies,m icroce falia, deficit accre scitivo,
39 23anni 46,X,de r(X)(Xpter->Xq21.3::Xp21.1~21,2->Xpter)
utero antervers ofless o piccolo, ovasio sx 2,3x1,1, ovaio dx 1,73x1,44
infertilità
Anomalie strutturali a mosaico
QUALI DEI CARIOTIPI PRESENTATI MERITANO UN
APPROFONDIMENTO PER LA RICERCA DELLE
SEQUENZE Y LEGATE AL GONADOBLASTOMA?
Sequenze Y nei fenotipi Turneriani
N ° Totale + Y %
781 60 7,6
Dati di 14 studi (1995 - 2007)
Sonde per analisi FISH
Sonde alfoidi:
DXZ1 (centromero X) DYZ3 (centromero Y)
Sequenze locus specifiche:
XIST (Xq13)
SHOX (PAR1 Xp e Yp)
SRY (Yp11.31)
TSPY (Testis Specific Protein Y-linked)
This figure was originally modified published in Schubert and Schmidtke (2010)
Gene multicopia in parte localizzato nella regione
critica per il gonadoblastoma
TSPY (Testis Specific Protein Y-linked)
o Alcune sequenze cadono nella regione pericentromerica del cromosoma Y sonda DYZ3 (cen Y)
o Presenza/assenza di piccole quantità di DNA mitoticamente funzionante
o L’identificazione di sequenze Y su sangue periferico non necessariamente riflette la presenza di materiale Y nelle gonadi
o Rischio del 12-25% di sviluppare gonadoblastoma
Tsuchiya 1995; Wictor 2004; Ackerman 2014, Knauer-Fischer et al 2015
•SRY
•AMGLX/Y
•DYZ3
•DYZ1
Il test molecolare per sequenze Y
applicato nel nostro laboratorio
Cr. X (SHOX)
Bassa statura Xp(p11.2-p22)
Regione critica per lo sviluppo delle ovaie
Xq(q24) p
q
Regioni coinvolte
46,X,del(Xp)dup(Xq )
Femmina (35a)
fenotipo: ipostaturale, utero e ovaie di piccole
dimensioni, menopausa precoce
MOSAICISMO COME INDIVIDUARLO?
Vanno sempre controllati i cariotipi omogenei?
Con quali tecniche?
Su quali tessuti?
Che esclusione fare?
Analisi del cariotipo su liquido amniotico
per età materna (35 a); terza gravidanza, 2 figli sani
46,X,del(Xq) omogeneo
46,X,del(X)(q27.1)
(X alterato inattivo nel 100%)
FISH: painting X FISH: assenza del segnale tel(Xq) (giallo
)
Follow-up
2a 8/12: fenotipo e sviluppo psicomotorio nella norma 7a 8/12: altezza nella norma, basso peso, difficoltà di
concentrazione
MOSAICISMO COME INDIVIDUARLO?
Vanno sempre controllati i cariotipi omogenei?
Con quali tecniche?
Su quali tessuti?
Che esclusione fare?
ChrX:105,277,223-155,232,907 ; del(X)(q22.3-qter) di 50 Mb
Femmina (31 a)
Quadro clinico: amenorrea, utero iposviluppato e ovaie di dimensioni ridotte
45,X[36%]/46,X,del(X)(q22.3)[64%]
MOSAICISMO COME INDIVIDUARLO?
Vanno sempre controllati i cariotipi omogenei?
Con quali tecniche?
Su quali tessuti?
Che esclusione fare?
45,X[80%]/46,X,ring(X)[20%]
45,X/46,X,ring(X)(p22.3q26.3)
FISH: assenza del segnale tel(Xp)(verde
)
assenza del segnale tel(Xq) (rosso)RBA: (ring late) X alterato inattivo nel 100%)
Femmina (10anni e 4/12 al follow-up)
fenotipo: dismorfismi del viso, ipostaturale, disabilità intellettiva con notevoli difficoltà comportamentali
45,X[40]/46,X,r(X)(pterq27?)[10].ish r(X)(DXZ1+,DXYS129-,SYBL1-)
delezione di ~ 3Mb in Xp e di 18 Mb in Xq
Ricerca sequenze
(Y) negative
nelle femmine normali (XX) l’inattivazione (gene XIST) è random dimensioni ridotte di un ring(X) attivo, che non contiene XIST,
può correlare con disabilità intellettiva
dimensioni grandi di un ring(X) inattivo, che contiene XIST, raramente correla con disabilità intellettiva
nel nostro caso il ring(X), di grandi dimensioni, presenta disabilità intellettiva, ipotesi?
mosaico con percentuale diversa della linea ring(X) in altri tessuti
se l’inattivazione del ring(X) fosse random, quando questo risulti attivo il soggetto presenta una percentuale di monosomia del segmento Xq26.3→qter ( segmento coinvolto nel RM ) come pure il segmento Xp22.3 →pter ( contenente il gene ARSE , coinvolto nei disordini dello sviluppo )
studiare il cariotipo dei genitori (madre)
si potrebbero fare ulteriori studi sull’inattivazione (X)
ricercare il mosaico su altri tessuti (mucosa buccale e fibroblasti)
CLINICA MOLTO SIGNIFICATIVA
ANORMALE
45,X
45,X/46,del(X) 45,X/46,X,r(X) 45,X/46,X,der(X) 45,X/46,XX
45,X/47,XXX 45,X/46,XX/47,XXX 46,XX/47,XXX
46,X,del(X) 46,X,r(X) 46,X,der(X) 46,X,+mar
46,X,i(Xq) 46,X,t(X;A)
STOP Array-CGH ?
NO
NORMALE
SI
MOSAICO
ANEUPLOIDIA
RIARRANGIAMENTO STRUTTURALE
45,X/46,X,i(Xq)
45,X/46,X,i(Xq)/47,Xi(Xq),i(Xq) 45,X/46,X,idic(X)
45,X/46,X,idic(X)/47,X,idic(X),idic(X)
FENOTIPO TURNERIANO
CARIOTIPO STANDARD QFQ: 400/500 bande - 30 cells
NORMALE
ANALISI SEQUENZE Y ?
45,X/46,X,+mar
45,X/46,X,+mar/47,X,+mar,+mar 45,X/47,XX,+mar
46,XX/46,X,+mar
