Istruzioni per l’Uso
Flughafenstraße 52 a D-22335 Hamburg Tel. +49 (0) 40 53 28 91-0 Fax +49 (0) 40 53 28 91-11 [email protected]
www.tecan.com/ibl
dsDNA-Ab RIA
Saggio radio-immunologico per la determinazione quantitativa di anticorpi contro il dsDNA in siero umano.
RE19011 100
2-8°C
IBL International GmbH Flughafenstrasse 52a D-22335 Hamburg, Germany
STORIA DELLA REVISIONE DELLE ISTRUZIONI PER L’USO
Modifiche rispetto alla versione precedente 2020-02 alla versione attuale 2020-06 Capitolo 4 Ulteriori informazioni
Capitolo 7 Imbottigliamento modificato (TRACER e AMMSULF)
1. USO PREVISTO
Saggio radio-immunologico per la determinazione quantitativa di anticorpi contro il DNA a catena doppia (dsDNA) in siero umano.
2. SOMMARIO E SPIEGAZIONI
La presenza di anticorpi per il DNA a catena doppia (ds DNA, native DNA) in siero è particolarmente caratteristica in pazienti affetti da SLE. Per differenziare SLE da altre malattie autoimmunitarie assai simili a tale patologia è importante determinare la quantità di anticorpi per il dsDNA. Anticorpi per il dsDNA mostrano una buona correlazione con l’attività della malattia.
Determinazioni in serie del quantitativo di anticorpi per dsDNA nel siero di singoli pazienti trattati per SLE è dunque di importante impiego clinico nell’evaluazione della terapia e per la pianificazione di ulteriori misure terapeutiche.
Anticorpi per dsDNA non appaiono normalmente nel siero di pazienti con SLE indotto da droghe. La determinazione di anticorpi dsDNA nel siero aiuta a decidere se il paziente è realmente affetto da SLE o una reazione lupoide causata da droghe.
3. PRINCIPIO DEL TEST
Il test dsDNA-Ab RIA fornisce uno strumento semplice, accurate e preciso per dosare gli anticorpi per il dsDNA nel siero misurando la capacità di legamento del dsDNA libero nel campione. Al campione viene aggiunto dsDNA marcato con 125I. Dopo l’incubazione si ottiene la separazione tramite l’aggiunta di una soluzione di ammonio solfato. Le provette vengono centrifugate e il supernatante decantato con cura.
Quindi le provette vengono poste nel contatore, essendo la radioattività legata direttamente proporzionale alla capacità di legamento del dsDNA.
4. AVVERTENZE E PRECAUZIONI
1. Solo per uso diagnostico in-vitro. Solo per uso professionale.
2. Leggere attentamente le istruzioni prima di iniziare il test. Utilizzare il manuale fornito nel kit. Assicurarsi di aver compreso tutte le indicazioni.
3. In caso di danneggiamento del kit contattare IBL o il Vostro fornitore entro 1 settimana dal ricevimento della merce. Non utilizzare i componenti danneggiati ma conservarli per fornire prove del danno assieme al reclamo che inoltrerete al produttore/fornitore.
4. Vetro rotto potrebbe causare lesioni. Maneggiare vasi di vetro con cautela.
5. Rispettare lotto e scadenze. Non scambiare o mescolare tra loro reagenti di lotti diversi. Non usare i reagenti scaduti.
6. Attenersi alle Buone Pratiche di Laboratorio e alle direttive di sicurezza. Indossare camici, guanti in lattice e occhiali protettivi se necessario.
7. Alcuni reagenti del kit contengono sostanze pericolose che potrebbero causare irritazioni a pelle ed occhi. Consultare la sezione MATERIALE FORNITO e le etichette per i dettagli precisi. Schede di sicurezza del prodotto sono disponibili sul sito web IBL o su richiesta specifica ad IBL/fornitore.
8. I reagenti preparati, usati, non utilizzati o scaduti e le sostanze chimiche del kit devono essere trattati come rifiuti pericolosi secondo le normative di sicurezza e la legislazione vigente nel Paese in cui il prodotto viene usato.
9. Il personale delle pulizie dev’essere informato dal personale specializzato sui possibili rischi e sulle procedure da adottare.
10. Questo kit contiene materiale radioattivo che deve essere ricevuto, acquistato, posseduto e utilizzato da medici, laboratori o ospedali in accordo con licenza specifica rilasciata da una regolare commissione per materiale nucleare e radioattivo del Paese in cui il prodotto viene inviato.
11. Il materiale radioattivo deve essere immagazzinato in aree del laboratorio vigilate appositamente designate a tale scopo, a cui abbia accesso personale specifico. Utilizzare abbigliamento da laboratorio e attrezzature di protezione. Indossare sempre camice e guanti protettivi. Asciugare immediatamente il materiale fuoriuscito accidentalmente, lavando l’area contaminata con un decontaminante e gettare nei rifiuti radioattivi il materiale contaminato.
12. Il kit contiene 125I (emivita: 60 giorni) emettente raggi X (28 keV) e γ (35.5 keV) ionizzanti.
13. Alcuni reagenti contengono thimerosal come conservante. In caso di contatto con occhi e pelle risciacquare subito abbondantemente.
14. Tutti i reagenti del kit contenenti siero umano o plasma sono risultati negativi rispetto a HIV I/II, HBsAg e HCV. Si raccomanda tuttavia di trattarli come potenzialmente pericolosi poiché non si può escludere in maniera assoluta la presenza di questi o di altri agenti infettivi.
5. CONSERVAZIONE E STABILITÀ
Il kit è spedito e trasportato a temperatura ambiente e deve essere conservato a 2-8°C. Non esporre a luce solare diretta e ad alte temperature. Le informazioni relative a conservazione e stabilità di tutti i reagenti e dei campioni sono riportate nel capitolo corrispondente.
6. PRELIEVO E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI
SieroOsservare le classiche precauzioni durante il prelievo venoso. Conservare l’integrità del campione di sangue dal momento del prelievo al momento dell’esecuzione del test. Non usare campioni emolizzati, itterici o lipemici. I campioni torbidi devono essere centrifugati per rimuovere il materiale particolato al loro interno.
Conservazione: 2-8°C ≤ -20°C
(Aliquote) Non esporre alla luce solare diretta e al calore.
Evitare la ripetizione di cicli di congelamento/scongelamento.
Stabilità: 48 h 6 mesi
7. MATERIALE FORNITO
Quantità Simbolo Componente
1 x 15 mL TRACER
dsDNA 125I-Tracciante
Pronto/a all’uso. Attività: < 74 kBq (1 µCi).
Contiene: 125I-dsDNA, 0.01% Thimerosal.
1 x 6 x 0.25 mL CAL A-F LYO
Standard A-F, liofilizzato
Contiene: dsDNA anticorpi, Siero umano, 0.01 % Thimerosal.
Per le concentrazioni esatte vedere le etichette sulle provette o il certificato di Controllo Qualità.
1 x 2 x 0.25 mL CONTROL 1+2 LYO
Controllo 1+2, liofilizzato
Contiene: dsDNA anticorpi, Siero umano.
Per le concentrazioni /gli intervalli accettabili vedere le etichette sulle provette.
1 x 2.5 mL SAMPLEDIL LYO Diluente dei Campioni, liofilizzato
Contiene: Siero umano, 0.01% Thimerosal.
1 x 100 mL AMMSULF Solfato di Ammonio
Pronto/a all’uso. Contiene: Solfato di Ammonio, 0.01% Thimerosal.
8. MATERIALI NECESSARI MA NON FORNITI
1. Micropipette (Multipette Eppendorf o similari, < 3 % CV). Volumi: 25; 150; 250; 1000 µL.
2. Provette in polistirene a fondo arritondato (12 x 75 mm) 3. Rastrelliera per provette per decantare i supernatanti 4. Vortex mixer
5. Bagno termostatato ad acqua, 37 °C
6. Centrifuga (preferibilmente refrigerata); ≥ 1500 x g 7. Contatore Gamma
8. Acqua bidistillata o deionizzata
9. Carta assorbente, puntali per pipette e timer
9. NOTE PER LA PROCEDURA
1. Qualsiasi manipolazione impropria dei campioni o modifica alla procedura può compromettere i risultati.
Rispettare rigorosamente i volumi, i tempi e le temperature di incubazione e i passaggi di pretrattamento dei campioni indicati in metodica. Utilizzare pipette calibrate.
2. Una volta iniziato il test completare tutti i passaggi senza interruzioni. Assicurarsi che tutti i reagenti siano stati precedentemente preparati in tempo utile. Far raggiungere la temperatura ambiente ai campioni e ai componenti del kit (18-25°C) e mescolare delicatamente ciascun reattivo liquido e campione prima dell’uso. Non creare schiuma durante il mescolamento.
3. Evitare la contaminazione di reagenti, pipette, pozzetti o provette. Usare puntali di plastica nuovi per ogni reagente, standard e campione. Non scambiare i tappi tra loro. Tappare sempre i flaconi non utilizzati. Non riutilizzare pozzetti/provette o reagenti.
4. Si consiglia di saggiare i campioni in doppio per poter identificare eventuali errori di pipettamento.
5. Si consiglia di contrassegnare tutti i tubi.
6. La forza di centrifugazione relativa (g) non è equivalente ai giri per minuto (rpm) ma deve essere calcolata sulla base del raggio della centrifuga.
10. ISTRUZIONI PRE-TEST
10.1. Preparazione di componenti liofilizzati o concentrati Diluire / dissolvere
Componente con Diluente Note Conservazione Stabilità
CAL A-F LYO 250 µL acqua bidist. Tappare e mescolare delicatamente per sciogliere.
Lasciare a riposo per 10 min.
Mescolare senza formare schiuma.
≤ -20°C (Aliquote) 9 settimane CONTROL 1+2 LYO 250 µL acqua bidist.
SAMPLEDIL LYO 2.5 mL acqua bidist.
10.2. Diluizione dei Campioni
I campioni sospettati di avere una concentrazione superiore a quella dello standard con concentrazione più alta devono essere diluiti con il diluente dei campioni.
11. PROCEDURA DEL TEST
La soluzione di Ammonio Solfato dev’essere tenuta ad una temperatura di 2-8°C fino al momento dell’uso.
1. Pipettare 25 µL di Standard, Controllo, campione e/o campione diluito nelle rispettive fiale.
Lasciare due fiale vuote per Total Activity (T).
2. Pipettare 150 µL di 125I-Tracer dsDNA in ciascuna fiala. Mescolare sul Vortex.
3. Incubare per 60 min a 37°C a bagnomaria.
4. Pipettare 1000 µL di Solfato di Ammonio freddo in ciascuna fiala. (eccetto T.) Mescolare sul Vortex.
5. Centrifugare tutte le fiale per 15 min a 1500 x g. (eccetto T.)
6. Decantare le fiale delicatamente. Asciugare per 10 min su carta assorbente (eccetto T).
7. Contare le fiale in un contatore Gamma per 1 min (compresa T).
12. CONTROLLO DI QUALITA’
I risultati del test sono validi solo se il test è stato eseguito seguendo le istruzioni per l’uso. L’utente deve inoltre attenersi rigorosamente ai principi della BPL (Buona Pratica di Laboratorio) o a norme equivalenti. Gli utenti e il laboratorio devono avere un sistema di formulazione della diagnosi conforme alle Buone Pratiche di Laboratorio. Tutti i controlli devono risultare compresi entro gli intervalli accettabili indicati sulle etichette e il Certificato QC. Se i criteri non sono soddisfatti il test non è valido e dovrebbe essere ripetuto. Ogni laboratorio dovrebbe usare campioni noti come ulteriori controlli. Si consiglia la partecipazione a programmi di controllo qualità periodici.
In caso di deviazioni devono essere forniti i seguenti dati: Scadenza dei reagenti (preparati), condizioni di conservazione, pipette, strumenti, condizioni d’incubazione e metodi di lavaggio.
13. CALCOLO DEI RISULTATI
Tracciare una curva su carta semi-log con il conteggio (cpm) corretto degli standard sull’asse y (lineare) contro le corrispondenti concentrazioni sull’asse x (logaritmico). Le concentrazioni dei campioni si possono leggere direttamente da questa curva standard.
Alternativamente i valori percentuale dei conteggi (cpm) degli standard e dei campioni possono essere comparati ai conteggi (cpm) dello standard più alto.
100 zero) x (standard cpm
- ) elevato più (standard cpm
zero) (standard cpm
- standard)
o (campione
= cpm B/B
% max
Tracciare una curva di % B/Bmax degli standard per gli standard (asse y, lineare) contro la concentrazione degli standard (asse x, logaritmico) su carta semi-log.
Buoni risultati sono garantiti da metodi automatici come cubic spline, 4 Parameter Logistics o Logit-Log.
Per il calcolo della curva standard, applicare ogni segnale degli standard (valori chiaramente errati vanno omessi e sostituiti con valori più plausibili).
In caso di campioni diluiti i valori devono essere moltiplicati per il corrispondente fattore di diluizione.
I campioni con concentrazioni superiori al più alto degli standards devono essere diluiti come descritto nel paragrafo ISTRUZIONI PRE-TEST e ritestati.
Tipica Curva di Calibrazione (Esempio. Non usare per il calcolo!)
Standard dsDNA (IU/mL)
Media cpm
Corretto cpm
B/Bmax
(%)
T 17494 17494
A 0 587 0 0
B 3 786 199 1.8
C 6 1182 596 5.4
D 12 2151 1564 14.2
E 24 5110 4523 41.1
F 80 11602 11015 100
14. VALORI ATTESI
I soli risultati non dovrebbero essere l’unica motivazione alla base di una scelta terapeutica. Devono essere correlati ad altre osservazioni cliniche e test diagnostici.
Soggetti apparentemente sani mostrano i seguenti valori:
< 7 IU/mL (n = 590)
Si consiglia ad ogni laboratorio di calcolare i propri valori di riferimento.
15. LIMITI DELLA PROCEDURA
La raccolta e conservazione dei campioni ha influenza significativa sui risultati del test. Vedere la sezione PRELIEVO E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI per maggiori dettagli.
Per le reazioni crociate vedere la sezione PERFORMANCE.
I seguenti componenti del sangue non hanno effetto significativo (+/-20%) sui risultati del test fino ai livelli di concentrazione riportati in tabella:
Emoglobina 4.0 mg/mL
Bilirubina 0.5 mg/mL
Trigliceridi 30 mg/mL
0 2000 4000 6000 8000 10000 12000
1 10 100 1000
IU / m L
CPM
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
0 20 40 60 80 100
dsDNA-Ab RIA Antibody [IU/mL]
n
16. PERFORMANCE
Specificità Analitica (Reattività Crociate)
Non si sono rilevate reazioni crociate con le seguenti sostanze testate.
Sostanza Sorgente Conc.
Siero di Artride Reumatoide WHO ≤ 100 IU/mL
Autoanticorpo anti-ribonucleoproteina nucleare (nRNO) WHO ≤ 1:2 Diluizione
Anticorpi di classe IgM anti-nucleare WHO ≤ 10 mg/mL
Glicoproteina C1q Calbiochem ≤ 500 µg/mL
Sensibilità Analitica
(Limite di Rilevazione) 2.5 IU/mL Media (Zero-Standard) - 2SD
Precisione Campione No Media ± SD (IU/mL) CV (%)
Intra-Saggio (n = 20)
1 6.51 ± 0.57 8.83
2 10.48 ± 0.48 4.59
3 23.00 ± 0.80 3.48
4 38.99 ± 0.87 2.22
Inter-Saggio (n = 20)
1 3.81 ± 0.45 11.75
2 9.81 ± 0.82 8.32
3 23.74 ± 1.91 8.03
4 38.42 ± 1.48 3.84
5 21.49 ± 2.00 9.29
Linearità
Campione No
Diluizione Misurato Conc.
(IU/mL)
Conc. Atteso (IU/mL)
Recupero (%)
1
1:2 44.64 - 100
1:4 22.37 22.32 100
1:8 10.49 11.16 94
1:16 5.44 5.58 97
1:32 3.24 2.79 116
1.64 1.93 1.40 138
2
1:2 43.02 - 100
1:4 22.98 21.51 107
1:8 10.52 10.76 98
1:16 5.10 5.38 95
1:32 2.54 2.69 95
1.64 1.20 1.34 89
3
1:4 79.78 - 100
1:8 39.90 39.89 100
1:16 19.88 19.95 100
1:32 10.70 9.97 107
1.64 6.17 4.99 124
Recupero
Campione No
dsDNA Endogena (IU/mL)
Aggiunto dsDNA (IU/mL)
Rec.
dsDNA (IU/mL)
dsDNA Atteso (IU/mL)
Rec.
(%)
1
0.9 7.5 8.2 8.4 98
0.9 15 17.5 15.9 110
0.9 30 32.7 30.9 106
0.9 60 62.6 60.9 103
2
4.41 7.5 11.8 11.6 101
4.41 15 23.4 19.1 122
4.41 30 37.3 34.1 109
4.41 60 64.1 64.1 100
3
0.72 7.5 8.2 8.2 99
0.72 15 16.9 15.7 108
0.72 30 30.7 30.7 100
0.72 60 60.8 60.7 100
Metodo di Paragone
verso RIA Test IBL = 1.14 x AMERLEX RIA (Ortho Clinical Diagnostics) + 1.3 r = 0.951, n = 100
17. RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI SUL PRODOTTO
1. Hamann D., Smeenk R.J.T. dsDNA Autoantibodies. In Autoantibodies 2nd Edition. 2007
2. Linnik M.D., Hu J.Z., Heilbrunn K. R., Strand V., Hurley F. L., Joh T., LJP 394 Investigator Consortium.
Relationship between anti-double-stranded DNA antibodies and exacerbation of renal disease in patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis and rheumatism. 2005 Apr, 52(4): 1129-37
3. Riboldi P., Gerosa M., Moroni G., Radice A., Allegri F., Sinico A., Tincani A., Meroni PL. Anti-DNA antibodies: a diagnostic and prognostic tool for systemic lupus erythematosus? Autoimmunity. 2005 Feb, 38(1):39-45
4. Isenberg D. Anti-dsDNA antibodies: still a useful criterion for patients with systemic lupus erythematosus? Lupus 2004, 13: 881-885
5. Wasmuth J.-C., Grün B., Terjung B., Homrighausen A., Spengler U. ROC Analysis Comparison of Three Assays for the Detection of Antibodies against Double-Stranded DNA in Serum for the Diagnosis of Systemic Lupus Erythematosus. Clinical Chemistry 2004, 50:2169-2171
6. Smeenk R.J.T. Detection of antibodies to dsDNA: Current insights into its relevance. Clin Exp Rheumatol 2002; 20: 294-300
7. Egner W. The use of laboratory tests in the diagnosis of SLE. J. Clin. Pathol. 2000; 53; 424-432
8. Takeuchi Y., Ishikawa O., Miyachi Y. The comparative Study of Anti-Double Stranded DNA Antibody Levels Measured by Radioimmunoassay and Enzyme-Linked Immunosorbent Assay in Systemic Lupus Erythematosus. The Journal of Dermatology. 1997. Vol. 24: 297-300
9. Ter Borg E.J., Horst G., Hummel E.J., Limburg P.C., Kallenberg C.G.M. Measurement of increases in anti-double-stranded dna antibody levels as a predictor of disease exacerbation in systemic lupus erythematosus. Arthritis & Rheumatism. 1990 May, 33 (5): 634-643
10. Sutjita M., Hohmann A., Boey M.L., Bradley J. Microplate ELISA for Detction of Antibodies to DNA in Patients with Systemic Lupus Erythematosus: Specificity and Correlation with Farr Radioimmunoassay.
Journal of Clinical Laboratory Analysis. 1989, 3: 34-40
REF Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N.–Cat.: / Αριθμός-Κατ.:
LOT Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθμός -Παραγωγή:
Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιμοποιείται από:
No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθμός εξετάσεων:
CONC Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συμπύκνωμα LYO Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασμένο
IVD
In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro Διάγνωση.
Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης.
Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell’uso. / Διαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση.
Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l’abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται μακριά από θερμότητα και άμεση επαφή με το φως του ηλίου.
Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους:
Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός:
Caution! / Vorsicht! / Attention! / ¡Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή!
Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED.
Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben.
Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit.
Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS.
Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS.
Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT.
Για τα σύμβολα των συστατικών του κιτ συμβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ.
COMPLAINTS: Complaints may be submitted initially written or vocal. Subsequently they need to be filed including the test performance and results in writing in case of analytical reasons.
WARRANTY: The product is warranted to be free from material defects within the specific shelf life and to comply with product specifications delivered with the product. The product must be used according to the Intended use, all instructions given in the instructions for use and within the product specific shelf life. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement.
LIMITATION OF LIABILITY: IN ALL CIRCUMSTANCES THE EXTENT OF MANUFACTURER’S LIABILITY IS LIMITED TO THE PURCHASE PRICE OF THE KIT(S) IN QUESTION. IN NO EVENT SHALL MANUFACTURER BE LIABLE FOR ANY INCIDENTAL OR CONSEQUENTIAL DAMAGES, INCLUDING DAMAGES FOR LOST PROFITS, LOST SALES, INJURY TO PERSON OR PROPERTY OR ANY OTHER INCIDENTAL OR CONSEQUENTIAL LOSS.
IBL International GmbH Flughafenstrasse 52a
D-22335 Hamburg, Germany
Phone: +49 (0)40-53 28 91-0 Fax: +49 (0)40-53 28 91-11
[email protected] www.tecan.com/ibl
