Il ragionamento trae la conclusione, ma essa non `e certa, se la mente non la scopre con la via dell’esperienza.

Il ragionamento trae la conclusione, ma essa non `e certa, se la mente non la scopre con la via dell’esperienza.

R. Bacon, 1214–1294

2.1 Colture cellulari

Le cellule staminali embrionali murine della linea E14Tg2A (a passaggio 25-34) sono state coltivate su piastre petri rivestite di gelatina (mediante incubazione a 37

^◦

per 5’ con una soluzione di gelatina allo 0.1%) ad una densit`a di 40’000 cells/cm

²

in ambiente termostatato a 37

^◦

, con pressione di anidride carbonica pCO

2

di 5.5%. Il mezzo di coltura `e stato cambiato ogni giorno per evitarne la rapida acidificazione ed era composto a partire dal Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM) come indicato in Tabella 2.1.

Le cellule sono state splittate utilizzando la dissociazione con tripsina e ripiastrate

ad una diluizione di 1:3/1:4, per evitare la confluenza e mantenerne la pluripoten-

za. Questo procedimento si compie lavando il monostrato cellulare con versene

e lasciando agire la tripsina per 5-6 minuti a 37

^◦

; quindi dopo l’inattivazione

dell’enzima con siero fetale bovino (FCS) le ESC vengono trasferite in una falcon

e dissociate gentilmente per spipettamento. Vengono infine centrifugate ad una

velocit`a di 1’000 RPM (6’-7’) per produrre un pellet che pu`o essere risospeso in ES medium fresco per la semina in piastra.

Le cellule RAW (RAW 264.7, una linea di monociti-macrofagi ottenuti da cloni leucemici di topo; Raschke et al., 1978) sono state coltivate in un mezzo minimo preparato a partire dal Dulbecco’s Minimum Essential Medium (DMEM), la cui composizione `e indicata in Tabella 2.2. Le cellule contenute nelle piastre sono state suddivise ogni due giorni con una densit`a di semina di circa il 10% (1 ·10

⁶

e 3 ·10

⁶

cellule in piastre da 100 e 150 mm, rispettivamente) e cresciute fino a rag- giungere per l’inizio dell’esperimento una confluenza dell’80%. Anche in questo caso per ripiastrare le cellule ad ogni passaggio `e stata impiegata la dissociazione con tripsina e l’inattivazione in FCS.

Le cellule staminali mesenchimali (MSC), ricavate da colture primarie prelevate da topi B6D2F1 (BDF1, “Charles River ”) come descritto in Nadri et al., 2007, sono state trattate allo stesso modo delle RAW 264.7.

Sostanza Conc. Fin.

Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM) q.b.

Siero Fetale Bovino (FCS) 10%

Glutammina 2 mM

Sodio Piruvato 1 mM

Amminoacidi Non Essenziali (NEAA) 1 mM

β-mercaptoetanolo 0.05 mM

Penicillina/Streptomicina 100 U/mL

LIF ricombinante 1000 U/mL

Tabella 2.1: Composizione del mezzo di crescita per ESC (ES medium)

Sostanza Conc. Fin.

Dulbecco’s Minimum Essential Medium (DMEM) q.b.

Siero Fetale Bovino (FCS) 10%

Glutammina 4 mM

Glucosio 4.5 g/L

Tabella 2.2: Composizione del mezzo di crescita per cellule RAW/MSC

2.2 Induzione neurale in vitro

La neurogenesi `e stata ottenuta mediante la cultura delle ESC in un mezzo mi- nimo chimicamente definito (CDMM) composto da DMEM/F12 supplementato con N2 e B27 (Invitrogen

^TM

) come surrogati del siero (Tabella 2.3).

Sostanza Conc. Fin.

DMEM/F12) q.b.

Glutammina 2 mM

Sodio Piruvato 1 mM

Amminoacidi Non Essenziali (NEAA) 0.1 mM

β-mercaptoetanolo 0.05 mM

Penicillina/Streptomicina 100 U/mL

N2 1X

B27

^∗

1X

∗privo di vitamina A

Tabella 2.3: Composizione del CDMM

Il protocollo di differenziamento prevede una procedura di cultura in tre passaggi cos`ı strutturata:

1

^o

Step: Le ESC dissociate sono lavate con DMEM/F12 per rimuovere perfet- tamente eventuali tracce di siero e vengono seminate in piastre di coltura rivestite di agar nobile 1.3% p/v (65’000 cells/cm

²

) che ne facilita l’aggre- gazione; le ES in questo modo formano degli agglomerati galleggianti sfe- roidali, i corpi embrioidi, che vengono fatti crescere in CDMM per 2 giorni, rinnovando quasi completamente il mezzo il secondo giorno: viene rimosso il 50% di CDMM vecchio e ne `e reimmesso un volume doppio, per evitare di perdere materiale e nello stesso tempo non stressare meccanicamente con la centrifugazione i corpi in via di sviluppo.

2

^o

Step: Gli aggregati sono dissociati con la tripsina e le cellule vengono semi-

nate ad una densit`a di 65’000 per cm

²

sulla superficie di una piastra petri

precedentemente trattata con poliornitina (Sigma-Aldrich

^�R

; 20 µg/mL in acqua sterile, 2 ore a 37

^◦

C) e laminina di topo (Invitrogen

^TM

; 5 µg/mL in PBS, 2 ore a 37

^◦

C). Le cellule sono coltivate in queste condizioni per 4 giorni, cambiando quotidianamente il CDMM.

3

^o

Step: Dopo un secondo passaggio di dissociazione le ESC sono mantenute altri 4 giorni in CDMM privo di supplemento B27 per guidarne il diffe- renziamento terminale a neuroni, utilizzando lo stesso tipo di densit`a di semina e di coating della superficie delle piastre a Step 2.

Ad ogni dissociazione del protocollo il siero utilizzato per inattivare la tripsina viene accuratamente rimosso dalle cellule mediante lavaggio in DMEM/F12.

Durante i vari esperimenti sono stati testati gli effetti dei seguenti fattori aggiun- doli al mezzo di coltura durante lo step 2: Noggin ricombinante murino (R&D Systems

^�R

; da 5 nM a 400 nM), BMP4 ricombinante murino (R&D Systems

^�R

; 50 ng/mL), Dorsomorfina (Sigma-Aldrich

^�R

, 10 µM), acido retinoico (Sigma- Aldrich

^�R

; da 0.1 a 10 µM), Ciclopammina (Sigma-Aldrich

^�R

, 10 µM), SAG (Sonic hedgehog agonist, Santa Cruz Biotechnology

^�R

; 100 nM) e SB431542 (Sigma-Aldrich

^�R

, 10 µM). Quando i fattori erano stati risospesi in dimetilsulfos- sido (DMSO) una quantit`a identica del diluente `e stata aggiunta nel CDMM per il controllo negativo dell’esperimento. In ogni caso la concentrazione di DMSO non ha mai superato lo 0.1%.

2.3 Estrazione dell’RNA

Per ottenere dati rappresentativi che tenessero conto dell’inevitabile variabilit`a

presente nelle condizioni di coltura (densit`a di semina, mortalit`a, adesione al

substrato) ogni esperimento includeva 2-4 repliche per ciascuna tesi (pozzetti

diversi delle piastre di coltura) che sono state raggruppate prima dell’estrazione

Figura 2.1: Struttura dei composti chimici utilizzati

Render grafico delle molecole sintetiche impiegate: dorsomorfina (a), acido retinoico (b), ciclopammina (c), SAG (d), SB431542 (e) e DMSO (f).

dell’RNA. Le cellule sono state raccolte mediante dissociazione con tripsina e lavate in PBS (Phosphate Buffered Saline). Nel caso di estrazione da tessuto, abbiamo prelevato campioni di corteccia, mesencefalo e rombencefalo dal cervello di tre topi (ceppo C57BL/6) a stadio embrionale E16.

L’RNA totale `e stato isolato utilizzando il kit commerciale NucleoSpin

^�R

RNA

II (Macherey-Nagel) che si avvale di colonnine in resina centrifugabili per legare

specificamente gli acidi ribonucleici. Il protocollo standard prevede uno step

iniziale di lisi delle cellule mediante un buffer a base di detergenti anionici e di

denaturanti quali il cloruro di guanidinio ed il β-mercaptoetanolo. Nel caso dei tessuti da aree di cervello, i frammenti sono stati omogeneizzati nel buffer di lisi con il Tissuelyser

^�R

(Qiagen) mediante agitazione in tubi da 1.5 mL contenenti una sferetta d’acciaio. L’RNA presente nel lisato viene precipitato in etanolo al 70%, rimane legato alla resina funzionalizzata della colonnina e subisce pi`u lavaggi in tamponi desalinizzanti, che terminano nell’eluizione di RNA puro in H

₂

O milliQ. La procedura comprende una fase intermedia di trattamento con DNasi per evitare la contaminazione da parte di DNA genomico.

L’RNA isolato `e stato controllato mediante spettrofotometro NanoVue

^�R

(GE Healthcare) per determinarne il livello di purezza e la concentrazione. Gene- ralmente partendo da 10

⁶

cellule si ottengono 20-50 µg di RNA, di qualit`a mediamente alta, con rapporto A

260

/A

280

≥ 1.9.

Successivamente `e stato analizzato per elettroforesi su gel di agarosio 1.3% p/v in TBE buffer 0.5% (Tris, Borato, EDTA) per saggiarne l’integrit`a (Figura 2.2).









Figura 2.2: Controllo di qualit`a dell’RNA

Immagine UV della corsa elettroforetica dell’RNA (sx) e spettro di assorbimento misurato al NanoVue

^�R

(dx) con i parametri di purezza.

Quando l’RNA serviva come stampo per le sonde di ibridazione dei microarray,

`e stata utilizzata come ulteriore controllo la microelettroforesi capillare offerta

dal kit RNA 6000 Nano per la piattaforma Bioanalyzer

^�R

(Agilent), che consente di ottenere un elettroferogramma virtuale ad alta risoluzione (Figura 2.3) ed uno score complessivo della qualit`a dell’RNA, che ne riflette il grado di purezza (presenza di contaminanti, salinit`a) e la qualit`a (degradazione). Questo score si

`e rivelato ≥ 9/10 per tutti i campioni presi in esame.

















        

   

 





 



Figura 2.3: Elettroferogramma del Bioanalyzer

Nel grafico si possono notare il picco corrispondente ai piccoli RNA (tRNA, miRNA, snoRNA, piRNA;) e alla subunit`a 5.8S dell’RNA

ribosomiale, le subunit`a maggiori 18S, 28S ed il 28S immaturo.

2.4 Retrotrascrizione

Per ogni campione, sono stati retrotrascritti 500 ng di RNA totale utilizzando il

kit di trascrizione inversa Reverse Transcriptase Core Kit (Eurogentec). La mix di

retrotrascrizione era composta come indicato in Tabella 2.4. In essa `e presente

tutto quello che occorre per la sintesi del DNA stampo, ovvero la trascrittasi

inversa, i dNTPs e il magnesio. L’enzima si serve di olignucleotidi di 9 basi a

sequenza casuale, che utilizza come inneschi. E’ inoltre presente un inibitore delle RNAsi, dal momento che la presenza indesiderata di questi contaminanti ambientali potrebbe danneggiare il template nel corso della reazione.

Sostanza Stock Conc. Fin.

Reaction Buffer 10X 1X

MgCl

2

25 mM 0.5 µL

dNTPs 2.5 mM 500 µM per dNTP

Nonamero random 50 µM 2.5 µM RNAse Inhibitor 20 U/µL 0.4 U/µL Euroscript RT 50 U/µL 1.25 U/µL

H

2

O milliQ - -

RNA stampo - 500ng

Tabella 2.4: Composizione della mix di retrotrascrizione

I parametri termici operativi del kit richiedono uno step iniziale a 25

^◦

C per 10’, la retrotrascrizione vera e propria avviene a 48

^◦

C per 30’ e la reazione si conclude con uno step di inattivazione a 95

^◦

C per 5’.

2.5 Progettazione dei primers di PCR

Per la quantificazione dei livelli di mRNA sono stati progettati diversi primers per l’innesco della reazione di Polymerase Chain Reaction (PCR).

Il software Primer-BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi)

`e risultato un valido strumento per lo scopo. L’interfaccia Web consente di dise- gnare gli oligonucleotidi mediante Primer3 (Rozen et al., 2000) ed al contempo

`e in grado di predire tramite BLAST (Altschul et al., 1990) tutti i possibili siti di malappaiamento su targets indesiderati. Come parametri per la progettazione sono stati utilizzati i seguenti valori:

• Lunghezza ottimale dei primers: 20 bp (range 18 - 27 bp)

• La coppia di primer doveva se possibile attraversare un introne

• Temperatura di melt (T

m

) ottimale: 60

^◦

C (range 57

^◦

- 63

^◦

C)

• Lunghezza dell’amplicone: tra 70 e 200 bp

• Confronto per specificit`a con la libreria refseq mRNA di Mus musculus

• Libreria degli elementi ripetitivi per il mispriming: Roditore

• Massima complementarit`a degli omodimeri e della regione 3’: 2 (da 3 a 5 se il parametro risultava troppo stringente)

Gli altri parametri sono stati lasciati come da default.

Nome Primer Forward Primer Reverse Amp.

β-Actina

AATCGTGCGTGACATCAAAG AAGGAAGGCTGGAAAAGAGC 177

β-Tub III

TTCTGGTGGACTTGGAACCT ACTCTTTCCGCACGACATCT 186

BMP2

ACACAGGGACACACCAACCAT TGTGACCAGCTGTGTTCATCTTG 125

BMP4

TTCCTGGTAACCGAATGCTGA CCTGAATCTCGGCGACTTTTT 114

BMPR1A

GCAAGGATTCACCGAAAGCCCAG GCTGCCATCAAAGAACGGACCTA 122

BMPR1B

TGGGTGCGTGAAAGATGGAGACC ACCGTAGAGTGAAACACAGAGGGA 187

CamKIIa

CAATATCGTCCGACTCCATG CATCTGGTGACAGTGTAGC 178

Emx2

GGCTAGAGCACGCTTTTGAG CACCGGTTAATGTGGTGTGT 199

En1

AGTGGCGGTGGTAGTGGA CCTTCTCGTTCTTTTTCTTCTTT 232

FoxG1

CGACCCTGCCCTGTGAGT GGAAGAAGACCCCTGATTTTG 107

Gata4

GGAAGACACCCCAATCTCG CATGGCCCCACAATTGAC 72

GFAP

GGAGAGGGACAACTTTGCAC CCAGCGATTCAACCTTTCTC 164

HoxB4

AAAGAGCCCGTCGTCTACC AGTGTAGGCGGTCCGAGAG 102

HoxB9

GAAGGAAGCGAGGACAAAGA AGATTGAGGAGTCTGGCCACT 188

Id1

CGACTACATCAGGGACCTGCA GAACACATGCCGCCTCGG 143

Irx3

AGTGCCTTGGAAGTGGAGAA CGAGGAGAGAGCTGATAAGACC 108

NCAM

AGGAGAAATCAGCGTTGGAG CGATGTTGGCGTTGTAGATG 182

Nestin

TGTCCCTTAGTCTGGAAGTGG GGGGAAGAGAAGGATGTTGG 199

NF-L

CCATGCAGGACACAATCAAC CTACCCACGCTGGTGAAACT 184

Nkx2.1

CAATGAGGCTGACGCCCCCG GAAGTGGGTTTCCTGTCTGAGCG 131

Oct4

TCAGCTTGGGCTAGAGAAGG GGCAGAGGAAAGGATACAGC 150

Otx2

CCACTTCGGGTATGGACTTG GGTCTTGGCAAACAGAGCTT 128

Pax6

CCTCCTTCACATCAGGTTCC CATAACTCCGCCCATTCACT 189

Six3

TCAACAACCCCACCACCACCTACT CACCTCTTTTATGCTTTCTGCCCGC 105

Tbr1

CGCCCTCCTCCATCAAATCCATCG GCAGTTCTTCTCGCAGTCCCGC 155

Wnt7b

ATGCCCGTGAGATCAAAAAG CGGAACTTAGGTAGCGTGGT 163

Tabella 2.5: Sequenze dei primers di amplificazione

La lista completa dei primers utilizzati per la caratterizzazione molecolare `e pre- sentata in Tabella 2.5, in cui sono mostrate le sequenze senso ed antisenso e la dimensione dell’amplicone.

2.6 RT-PCR semiquantitativa

Il cDNA retrotrascritto `e stato quantificato per Real-time PCR su Rotor-Gene

^�R

6000 (Corbett). La PCR `e stata effettuata utilizzando protocolli standard, che prevedono l’utilizzo della miscela di reazione e del profilo termico indicati in Tabella 2.6 e 2.7.

Sostanza Conc. Vol

GoTaq qPCR Master Mix 2X 10.0 µL

Primer forward 5 µM 0.5 µL

Primer reverse 5 µM 0.5 µL

cDNA stampo 0.5 ng/µL 8.0 µL

H

2

O milliQ - 1.0 µL

TOTALE - 20.0 µL

Tabella 2.6: Composizione della mix di PCR

Step T Tempo

Denaturazione 95

^◦

C 15”

Annealing 58

^◦

C 25”

Estensione 72

^◦

C 20”

Per un totale di 40 cicli

Tabella 2.7: Ciclo termico di PCR

La GoTaq

^�R

qPCR Master Mix (Promega) `e una miscela pronta all’uso conte-

nente al suo interno tutto ci`o di cui la reazione di PCR Real time necessita (ad

eccezione dei primer e del DNA stampo): sono presenti cio`e un buffer di reazione,

i dNTPs, la DNA-polimerasi, il MgCl

₂

e l’intercalante fluorescente Sybr Green,

che consente di monitorare in tempo reale la polimerizzazione misurando i livelli

di fluorescenza registrati. La reazione prevede un’attivazione hot start per una maggiore accuratezza (3’ a 95

^◦

C).

I valori di takoff dell’amplificazione sono stati ricavati utilizzando la funzione di Rotor-Gene relative quantitation analysis, e abbiamo calcolato l’espressione relativa secondo la relazione

Rel.Exp = 2

^−∆∆CT

dove il ∆∆C

T

= (C

_T^tg

− C

T^hk

) `e calcolato normalizzando i livelli del gene di inte- resse (C

_T^tg

) con quelli del gene housekeeping β-Actina (C

_T^hk

). Gli errori standard dell’espressione relativa indicati nelle figure della sezione Risultati sono stati ot- tenuti dalla seguente formula di propagazione degli errori (Nordg˙ard et al. 2006):

Err.Std = ln2

�

V ar(C

_T^tg

) + V ar(C

_T^hk

) − Cov(C

T^tg

; C

_T^hk

)

La significativit`a statistica delle differenze di espressione genica `e stata saggiata, laddove necessario, con un test di randomizzazione, sfruttando il software REST (Pfaffl et al., 2002).

2.7 Immunocitochimica

Le cellule per gli esperimenti di immunocitochimica sono state coltivate su vetrini coprioggetto rotondi (Thermo Scientific) pretrattati con un lavaggio in etanolo e HCl (1:1) e incubati in poliornitina/laminina come descritto precedentemente.

Le cellule sono state fissate con paraformaldeide al 2% per 15 minuti, lavate due volte in PBS, permeabilizzate utilizzando Triton X100 allo 0.1% in PBS e incubate in una blocking solution di BSA 0.5% in PBS per 1h.

Le cellule sono state incubate negli anticorpi primari per 2h a temperatura

ambiente, quindi sono state sottoposte a 3 lavaggi in PBS (10’ ciascuno).

Come anticorpi secondari abbiamo utilizzato dei monoclonali anti-IgG di topo o di coniglio coniugati all’Alexa Fluor 488 o l’Alexa Fluor 568 (Molecular Probes).

Anticorpo Titolo Produzione

Doublecortin 1:500 Abcam

FoxG1 1:100 Abcam

fosfo-Smad1/5/8 1:100 Millipore

GFAP 1:100 Dako

Internexin 1:100 Santa Cruz DBA

Musashi 1:200 Cell Signalling

Neurnonal class III β-tubulin 1:1000 Covance

Nestin 1:200 Millipore

N-tubulina acetilata 1:1000 Sigma

Oct4 1:200 Santa Cruz DBA

Sinaptofisina 1:100 Santa Cruz DBA

Tbr1 1:400 Millipore

Tabella 2.8: Anticorpi primari per immunocitochimica

Le cellule sono state incubate 1 ora a temperatura ambiente nella soluzione di PBS contenente gli anticorpi secondari e l’Hoechst 33258 per la colorazione nucleare (1:500), Triton X100 allo 0.1% e BSA 0.5%. Il protocollo `e leggermente diverso per Tbr1 e FoxG1, i cui anticorpi sono stati incubati overnight a 4

^◦

C con 0.3% di Triton X100. In ogni caso la procedura termina con tre lavaggi in PBS da 10’ ciascuno e con il montaggio dei vetrini tondi con le cellule in adesione su vetrini portaoggetto grazie ad una goccia di Aqua-Poly/Mount (Polysciences) che solidifica dopo asciugatura overnight a temperatura ambiente.

2.8 Microscopia e analisi delle immagini

Le immagini sono state acquisite con un microscopio confocale a scansione laser

(DM IRE2, Leica), che ha permesso di ottenere stack di sezioni ottiche ad in-

tervalli di 0.5 - 1µm di profondit`a. I vari piani bidimensionali sono stati proiettati

lungo l’asse z in un unico livello secondo la massima intensit`a dei pixel utilizzan- do il software ImageJ (Abramoff et al., 2004): in questo modo si produce una singola immagine che ricrea grossomodo l’aspetto tridimensionale dell’oggetto visto da un punto esterno alla sua superficie.

Per la microscopia ottica destinata alla deconvoluzione abbiamo acquisito stack di immagini digitali ad intervalli di 0.25-0.5 µm utilizzando un microscopio in- vertito motorizzato ad epifluorescenza (Eclipse Ti, Nikon) dotato di una camera monocromatica a CCD raffreddata da 1.3 megapixel (Nikon DS-Qi1Mc).

Le immagini sono state deconvolute con il software di analisi NIS Elements (Nikon). Con la deconvoluzione, un metodo di calcolo utilizzato nel migliora- mento delle immagini per ridurre la fluorescenza fuori fuoco, `e stato possibile ottenere un’elevata risoluzione anche senza ricorrere alla microscopia confocale;

tutte le micrografie in tre colori sono state ottenute sfruttando questa metodica.

Ciascun canale `e stato fotografato separatamente ed in un secondo tempo ab- biamo costruito un’immagine RGB mediante Adobe

^�R

Photoshop

^�R

CS4.

Il calcolo dell’ intensit`a media dei pixel per misurare il livello di fosforilazione di Smad1/5/8 `e stato effettuato su immagini a 16-bit, attraverso un plugin di ImageJ concepito per lo scopo. Esso sfrutta lo staining dell’Hoechst per costruire un confine che definisce l’area nucleare, entro la quale viene calcolata intensit`a media del segnale di Phospho-Smad1/5/8. Per fare questo il plugin si serve dell’algoritmo di Li di entropia minima (Li & Lee, 1993), che consente di creare in modo assai affidabile e del tutto automatizzato delle selezioni fluttuanti con l’esatta forma dei nuclei. In Materiali Aggiuntivi (Listato 1) `e presentato il codice macro di ImageJ (PixelIntensity.ijm) che implementa questa misurazione.

Per il conteggio delle cellule sono state acquisite immagini casuali da 2-3 espe-

rimenti indipendenti per eseguire un’analisi in doppio cieco utilizzando il plugin

contatore di ImageJ. Per ogni trattamento o marcatore abbiamo contato dalle

300 alle 1000 cellule e la significativit`a statistica delle differenze rilevate `e stata saggiata mediante test di Student (t) a due code.

2.9 Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay

Le cellule di cui si voleva misurare la secrezione di BMP2 (ES na¨ıve, ES diffe- renziate a step 2, RAW 264.7 e MSC) sono state seminate nei pozzetti di una piastra 24-wells e tenute in coltura come descritto al Paragrafo 2.1. Quando le 3 linee hanno raggiunto il 70-80% di confluenza ogni pozzetto `e stato lavato con PBS ed abbiamo sostituito il mezzo di crescita con eguale volume di mezzo fresco. Dopo 24 ore, il surnatante `e stato raccolto, centrifugato per rimuovere le particelle in sospensione (5’ a 10’000 ·g) e conservato a -80

^◦

C in attesa di essere analizzato con il metodo dell’Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA).

Per la quantificazione del secreto ci siamo avvalsi di un kit disponibile commer- cialmente (Quantikine

^�R

BMP-2 Immunoassay, R&D Systems), attenendoci alle istruzioni del produttore.

Il surnatante viene diluito in uno specifico tampone e trasferito in una piastra microwell su cui sono stati immobilizzati gli anticorpi anti-BMP2, e vi rimane in agitazione (500 RPM) per 2h a temperatura ambiente. Dopo 3 lavaggi nel washing buffer viene aggiunto un anticorpo coniugato con la perossidasi ed in- cubato altre 2h in agitazione (500 RPM) a temperatura ambiente. Dopo altri 3 lavaggi nei pozzetti `e posta una soluzione contenente il substrato cromoforo, dopo 10’ si inattiva la reazione con una soluzione di stop a base di un acido forte e si procede immediatamente con la colorimetria.

Le concentrazioni di BMP-2 dei campioni di due esperimenti diversi (ciascuno

in triplicato tecnico) sono state determinate a partire dalla densit`a ottica rile-

vata a 450 nm tramite la piattaforma fluorimetrica iMark

^TM

Microplate Reader

(Biorad), in relazione alla curva standard che abbiamo ricostruito misurando di- luizioni seriali da 1000 a 0 pg/mL (con fattore 1:2) dell’antigene ricombinante fornito nel kit (grafico in Figura 2.4).

 





 

 











     

   

 !"

Figura 2.4: Retta di taratura della quantificazione ELISA

La retta di taratura mostra un andamento lineare nel range preso in considerazione, come `e dimostrato dal valore di R

²

.

2.10 Ibridazione dei Microarray

Per l’esperimento con i microarray abbiamo raggruppato l’RNA delle cellule di

tre diversi esperimenti per ogni tesi. Le sonde sono state prodotte con l’ap-

posito kit One Color Quick Amp Labelling (Agilent). In una prima fase l’RNA

stampo (nel nostro caso 500 ng) viene retrotrascritto a DNA single strand dalla

trascrittasi inversa MMLV, quindi l’RNA polimerasi T7 sintetizza a partire dal

cDNA una molecola di cRNA marcato con il dye fluorescente Cy-3, legato cova-

lentemente alla citidina. Le sonde cos`ı ottenute sono state purificate per mezzo delle colonnine centrifugabili RNeasy (Qiagen) con un protocollo simile a quello descritto al Paragrafo 2.3, ed il cRNA `e stato misurato con lo spettrofotome- tro NanoDrop

^�R

ND-1000 (Thermo Scientific) per saggiarne la concentrazione, il rapporto A

₂₆₀

/A

₂₈₀

e la concentrazione del fluoroforo Cy-3.

Abbiamo ottenuto dai 380 ai 760 ng/µL di sonde, con coefficiente A

260

/A

280

� 2 e contenenti dalle 4.6 alle 8.5 pmol/µL di Cy-3; quindi sono state frammentate con un apposito buffer che agisce a 60

^◦

C ed ibridate overnight sui vetrini Agilent Mouse Gene Expression Microarray chip (4x44K v2) a 65

^◦

C in rotazione (10 RPM). Tre chip sono stati ibridati con il cRNA delle ESC differenziate in CDMM, altri tre con quello delle cellule trattate con Noggin e due vetrini con il cRNA da ogni altra condizione.

Al termine dell’incubazione i microarray sono stati lavati in due differenti buffer a temperatura ambiente al fine di rimuovere le sonde non appaiate.

Per l’acquisizione delle immagini dei vetrini abbiamo utilizzato l’Agilent G2565CA microarray scanner, che eccita i fluorofori Cy-3 alla lunghezza d’onda di 550 nm e legge l’emissione del segnale nel verde (570 nm) e del rumore di fondo nel rosso (650 nm) con una risoluzione laterale di 5 µm.

2.11 Analisi dei dati di Microarray

La spot analysis `e stata effettuata con il software Feature Extraction (Agilent).

Il programma conosce le coordinate spaziali delle aree delle singole sonde (spots) ed analizzando l’immagine grezza integra l’intensit`a di fluorescenza registrata come valore di colore a 20-bit su ogni pixel dello spot, ricavando un unico valore di espressione per il gene corrispondente a quella sonda.

I primi controlli di qualit`a dei dati ottenuti sono stati effettuati utilizzando il

pacchetto gratuito ed open source Bioconductor (Gentleman et al., 2004), che si basa sull’ambiente di programmazione statistica R (http://www.R-project.org).

In primo luogo abbiamo visualizzato in silico l’ibridazione degli array a partire dai dati ottenuti da Feature Extraction. I comandi che implementano questa funzione sono mostrati nel Listato 2 in Materiali Aggiuntivi. I vetrini del segnale Cy-3 (verde in Figura 2.5) si presentano con una marcatura granulata e pulita, che deriva dalla specificit`a del legame delle sonde; il segnale di fondo (rosso) `e pi`u diffuso e sfumato, piuttosto debole.

Figura 2.5: Analisi del layout di un miroarray

Segnale di fondo (sopra) ed emissione di Cy-3 (sotto) dello stesso vetrino.

Abbiamo quindi osservato la riproducibilit`a degli esperimenti, comparando l’e-

spressione dei singoli geni in coppie di replicati tecnici. In Bioconductor questo

tipo di analisi `e facilmente implementabile con la serie di comandi presentata

nella sezione Materiale Aggiuntivo (Listato 3). Il grafico in Figura ?? mostra che i valori logaritmici di intensit`a presentano una buona riproducibilit`a, leggermente minore soltanto ai bassi valori (nuvola di dispersione intorno a valori 4-6), dove il rumore di fondo esercita un maggiore effetto sulla misurazione.

4 6 8 10 12 14 16 18

51015

E16 Mesencephalon

US83803561_251486834205_S01_GE1_107_Sep09_1_3.txt

US83803561_251486834206_S01_GE1_107_Sep09_1_3.txt

Figura 2.6: Controllo di riproducibilit`a dei Microarray

Confronto tra intensit`a log

₂

I di due replicati tecnici.

L’entit`a di questo errore `e piuttosto omogenea ed ha un valore basso, parago- nabile a quello del rumore di fondo misurato nell’emissione del rosso (rappre- sentato col medesimo tipo di grafico nella Figura S1 dei Materiali Aggiuntivi), che sta intorno alle 2-3 unit`a logaritmiche, in buon accordo con quanto detto precedentemente.

Per prima cosa il dataset completo ottenuto dall’ibridazione dei microarray `e sta-

to utilizzato per l’analisi di Gene Set Enrichment (GSEA). La GSEA `e un metodo

bioinformatico che permette di verificare se esistano degli specifici gruppi di geni

(associati a particolari set di funzioni cellulari o con comuni caratteristiche di ontologia genica, come nel nostro caso) che sono globalmente regolati quando si confrontano due differenti condizioni (Subramanian et al., 2005). Per questo sco- po `e stato utilizzato il software Agilent GeneSpring GX11.0, con il quale abbiamo individuato i geni espressi in modo differenziale tra ESC a step 3 trattate con CDMM e con Noggin 400 nM, o tra cellule trattate con CDMM e quelle differen- ziate in acido retinoico. I geni che mostravano un fold change maggiore o uguale a 2 sono stati analizzati sulla base della collezione C5 (gruppi di Gene Ontology) curata e mantenuta dall’istituto BROAD (www.broadinstitute.org/gsea).

Il progetto Gene Ontology (GO) `e un vocabolario strutturato pensato per de- scrivere i geni e i loro prodotti in qualsiasi tipo di organismo. All’interno di esso ogni voce `e categorizzata secondo la componente cellulare che essa occupa, il processo biologico in cui `e coinvolta e la funzione molecolare che riveste, in modo da essere univocamente identificata anche tra specie diverse. Questo consente la creazione di sottoinsiemi di geni accomunati da una caratteristica affine, un’utile prerequisito per l’analisi di Gene Set Enrichment.

Al fine di selezionare un set di geni rappresentativi e caratteristici della regiona- lizzazione antero-posteriore del cervello durante lo sviluppo embrionale abbiamo confrontato i profili di espressione della corteccia e del romboencefalo murino a stadio E16, sempre avvalendoci del software GeneSpring. Abbiamo scelto i geni il cui fold change assoluto fosse maggiore o uguale a 10 (in modo statisticamente significativo; p<0.05). La significativit`a dei risultati `e stata provata con il meto- do dell’ANOVA accoppiata al test post hoc di Tukey con correzione del p-value secondo Bonferroni. In questo modo `e stato ricavato un insieme di 592 geni, che descrivono l’asse rostro-caudale del sistema nervoso centrale in formazione.

Abbiamo quindi usato questo set di geni per la successiva analisi di clustering

gerarchico, effettuata con il software gratuito Cluster (Eisen et al., 1998). Que-

sto tipo di metodica computazionale consente di raggruppare insieme molteplici entit`a eterogenee dopo averne paragonato la similarit`a nel pattern e nel livello di espressione genica, in modo che risultino tra loro pi`u correlati gli elementi pi`u simili. Per lo scopo `e stato impiegato l’algoritmo di single linkage e gli alberi sono stati generati utilizzando come misura del clustering dei geni la correlazione assoluta e per gli array la distanza euclidea. I risultati finali sono stati visualizzati con l’applicazione javaTreeView (Saldanha, 2004).

Sullo stesso dataset e con il medesimo programma di clustering `e stata effettuata l’Analisi delle Componenti Principali (PCA) dei vari campioni. Questa procedura matematica consente di ridurre la complessit`a di un grande insieme di variabili che rappresentano le caratteristiche osservabili di un particolare sistema (nel nostro caso, il livello di espressione I

n,m

di N geni in M campioni) ricavando un gruppo pi`u piccolo di variabili tra loro indipendenti (le componenti principali) che da sole caratterizzano gran parte delle differenze presenti tra le entit`a in esame.

I valori delle due componenti principali che contribuivano alla maggior parte della

varianza osservata nei diversi campioni sono state rappresentati in un grafico

bidimensionale.