4. MATERIALI Per riprodurre e perfezionare il protocollo abbiamo preso in considerazione la mutazione maggiormente diffusa r

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4. MATERIALI

Per riprodurre e perfezionare il protocollo abbiamo preso in considerazione la mutazione maggiormente diffusa responsabile della fibrosi cistica, la ΔF508 che è causata dalla delezione di tre paia di basi cui corrisponde la Fenilalanina. L’analisi di tale mutazione si è svolta utilizzando l’ABI PRISM® SNaPshot™ Multiplex Kit (Applied Biosystems).

Prima di procedere con l’utilizzo di questo kit, sono state svolte numerose prove utilizzando del DNA estratto da sangue periferico. Per prima cosa è stato quantizzato il DNA e successivamente sono state effettuate varie diluizioni in modo da ottenere una concentrazione simile a quella presente in una singola cellula. Sulle varie diluizioni sono state eseguite reazioni di PCR e di semi NESTED , utilizzando i primer specifici per il gene UGT responsabile della sindrome di Gilbert. Sono state svolte queste varie prove per apprendere la manualità necessaria e capire a pieno come si svolge una reazione di PCR, quali parametri possono influenzare la sua riuscita e come comportarsi per evitare eventuali contaminazioni; requisiti fondamentali per poter poi cercare di mettere a punto un protocollo per una tecnica diagnostica così complicata e sensibile.

Una volta acquisite le conoscenze e la manualità necessarie abbiamo proceduto col cercare di attuare il protocollo di minisequenziamento.

La regione genomica sulla quale ci siamo concentrati per svolgere le nostre prove è quella relativa all’esone 10 del gene CFTR . L’amplificazione esterna si è svolta utilizzando una coppia di primers (colorati in giallo) che danno un amplificato di 491 pb, la nested PCR si è svolta utilizzando una coppia di primers più interni (colorati in verde) che danno un amplificato di 281 pb. Il minisequenziamento invece è stato svolto usando due diversi primers capaci di identificare la mutazione ΔF508 causata dalla delezione di tre paia di basi. Un primer identifica la delezione CTT tramite la produzione di un frammento di 27 pb (colore rosso) e l’altro invece identifica la delezione TTT tramite la produzione di un frammento di 33 pb (colore azzurro) (figura 16).

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Figura 16 Sequenza del gene CFTR contenente l'esone 10

L’efficienza e l’accuratezza della PCR è stata valutata con esperimenti preliminari su DNA estratto e quantizzato da sangue periferico e da amniociti tramite l’uso dell’estrattore automatico Bio Robot EZ1(Qiagen). Con questo DNA si sono fatte delle diluizioni seriali in modo da arrivare ad un quantitativo di DNA più o meno equivalente a quello contenuto in una singola cellula (6 picogrammi).

Per prima cosa sono stati testati i primers per verificare la loro funzionalità e la corretta amplificazione dei frammenti. Ciò si è fatto svolgendo due reazioni di PCR , una contenente i primers più esterni e l’altra contenente invece i primers nested più interni. La corretta amplificazione si è valutata poi tramite corsa elettroforetica per 5 min a 150V insieme ad un DNA ladder andando a verificare la giusta lunghezza delle bande amplificate.( figura17)

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4.1. Prova con DNA estratto da sangue periferico

Il DNA estratto utilizzato aveva una concentrazione di 68 ng/µl, e sono state fatte 4 diluizioni in modo da arrivare ad una concentrazione di 6,8 picogrammi, equivalente alla quantità di DNA presente in una cellula aploide.

Una volta effettuate le varie diluizioni si è svolta una reazione di PCR seguita poi da una NESTED PCR .

La reazione di PCR è stata allestita secondo il seguente schema: Eppendorf 1 (68 ng/µl di DNA)

Eppendorf 2 (6,8 ng/µl di DNA) Eppendorf 3 (0,68 ng/µl di DNA) Eppendorf 4 (0,068 ng/µl di DNA)

Eppendorf 5 (0,0068 ng/µl = 6,8 picogrammi di DNA) Eppendorf 6 (controllo negativo )

Le riuscite dell’amplificazioni dei contenuti delle provette eppendorf 1,2,3 dove c’era un maggior contenuto di Dna si sono verificate tramite corsa elettroforetica di 10 µl del prodotto di PCR per 5 min a 150V in agarosio al 2% in Tris-borate/EDTA buffer colorato con 0,5 µg/ml di bromuro di etidio ed inoltre nelle stesse si è evidenziata l’assenza di nessuna contaminazione.

Le eppendorf 4 e 5 probabilmente per la esigua quantità di DNA non hanno mostrato amplificati e si sono quindi sottoposte insieme anche alla 3 a nested PCR.(figura 18)

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La reazione di nested PCR è stata allestita invece secondo il seguente schema:

 Eppendorf 3N (contenente 2 µl dell’amplificato precedente n° 3 e 3 µl di H2O)

Eppendorf 4N (contenente 2 µl dell’amplificato precedente n° 4 e 3 µl di H2O)

Eppendorf 4N5 (contenente 5 µl dell’amplificato precedente n° 4) Eppendorf 5N5 (contenente 5 µl dell’amplificato precedente n° 5) Eppendorf 6 (controllo negativo formato da 2µl del controllo

precedente + 3 µl di H2O)

Eppendorf 7 (nuovo controllo negativo)

In questa prova si sono fatte anche due eppendorf con 5 µl dell’amplificato precedente per valutare l’efficienza di amplificazione con quantità così ristrette di DNA. Anche in questo caso il risultato positivo della NESTED PCR si è valutato tramite corsa elettroforetica per 5 min a 150V ed anche l’assenza di contaminazioni.

Questi risultati ci portano a ritenere di essere stati in grado di amplificare perfettamente la quantità di DNA presente in una singola cellula aploide. Inoltre possiamo anche affermare che la nested PCR è risultata migliore nelle eppendorf che contenevano soltanto 2 µl dell’amplificato precedente perché mostravano su gel una banda molto netta e pulita.( figura 19)

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Il prodotto della nested PCR 5N è stato poi purificato e 2µl si sono utilizzati per effettuare il sequenziamento svolto con il kit Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (Applied Biosystems) così da poter verificare con esattezza la sequenza nucleotidica.

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4.2. Prova con DNA estratto da amniociti

Il DNA estratto utilizzato aveva una concentrazione di 10 ng/µl, e sono state fatte 4 diluizioni in modo da arrivare ad una concentrazione di 5 picogrammi leggermente minore rispetto alla quantità di DNA presente in una cellula (6 picogrammi).

Una volta effettuate le varie diluizioni si è svolta una reazione di PCR seguita poi da una NESTED PCR .

La reazione di PCR è stata allestita secondo il seguente schema:

Eppendorf 1 (30 ng/µl di DNA) Eppendorf 2 (10 ng/µl di DNA Eppendorf 3 (1 ng/µl di DNA) Eppendorf 4 (0,10 ng/µl di DNA) Eppendorf 5 (0,010 ng/µl di DNA)

Eppendorf 6 (0,0050 ng/µl = 5,0 picogrammi di DNA) Eppendorf 7 (controllo negativo)

Il risultato dell’amplificazione si è monitorato tramite corsa elettroforetica di 10 µl del prodotto di PCR per 5 min a 150V in agarosio al 2% in Tris-borate/EDTA buffer colorato con 0,5 µg/ml di bromuro di etidio. Si è così verificata la corretta amplificazione avvenuta in tutte le eppendorf senza presenza di contaminazione.

La eppendorf 6 pur avendo una esigua quantità di DNA mostrava già in questo ciclo di PCR una leggera banda di amplificazione. Si è deciso poi di effettuare la nested PCR per le eppendorf 4-5-6 ( figura 20) .

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La reazione di nested PCR è stata allestita invece secondo il seguente schema:

Eppendorf 7 (controllo negativo formato da 2µl del controllo precedente con 3 µl di H2O)

Anche in questo caso il risultato della nested PCR è stato valutato tramite corsa elettroforetica per 5 min a 150V. Si è così potuto verificare che non si erano avute contaminazioni, ma soprattutto anche in questo caso abbiamo avuto la corretta amplificazione in tutte le eppendorf. Si può quindi affermare anche per la prova eseguita su DNA proveniente da amniociti che siamo riusciti ad amplificare perfettamente anche una quantità di DNA leggermente minore (5 picogrammi) rispetto a quella presente in una singola cellula aploide (6 picogrammi)(figura 21).

Figura 21 nested PCR su DNA estratto da amniociti

Il prodotto della nested PCR 6N si è poi purificato con il QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) e quantizzato. 10 ng si sono utilizzati per svolgere la reazione di minisequenziamento.

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Il volume della reazione di minisequenziamento è di 10 µl, composti da:

5 µl del Ready Reaction Premix

10 pmol di primer capace di individuare la delezione TTT per il minisequenziamento.

La quantità corrispondente a 10 ng del prodotto purificato.

La reazione è stata svolta in 25 cicli così strutturati:

step di denaturazione di 10 s a 96°C, annealing per 10 s a 50°C

estensione per 30 s a 60°C.

Il prodotto di minisequenziamento è stato purificato utilizzando delle colonnine con Sephadex G‐50. Si è poi denaturato per 4 min a 90°C 1 µl del purificato e 15 µl di Hi-Di Formammide e corso sul sequenziatore automatico ABI Prism 3130xl.

Analizzando la sequenza abbiamo individuato il picco corrispondente alla base che doveva essere incorporata(ci aspettavamo una A - adenina con picco di colore verde),però il picco non era ben definito e netto ma mostrava una doppia punta perché il purificato era troppo concentrato. Abbiamo ripetuto la corsa sul sequenziatore automatico utilizzando solo 0,2 µl di purificato e siamo riusciti ad ottenere un picco netto e ben definito (figura 22).

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4.3. Confronto tra MINISEQUENZIAMENTO e SEQUENZIAMENTO

DIRETTO per la mutazione Δf508

Il confronto tra queste due tecniche è stato eseguito utilizzando DNA estratto da sangue periferico di pazienti omozigoti ed eterozigoti per la mutazione ΔF508 precedentemente caratterizzati.

La reazione di PCR è stata svolta utilizzando direttamente i primers interni secondo il seguente schema:

Eppendorf 1 (1 µl di DNA del paziente eterozigote) Eppendorf 2 (1 µl di DNA del paziente omozigote) Eppendorf 3 (1 µl di DNA di un paziente sano) Eppendorf 4 (controllo negativo)

Il risultato dell’amplificazione si è monitorato tramite corsa elettroforetica di 10 µl del prodotto di PCR per 5 min a 150V in agarosio al 2% in Tris-borate/EDTA buffer colorato con 0,5 µg/ml di bromuro di etidio. Si è così verificata la corretta amplificazione avvenuta nelle eppendorf 1-2-3 e la presenza di nessuna contaminazione (figura 23).

Figura 23 Risultato della PCR

Il prodotto della PCR è stato poi purificato con il QIAquick PCR Purification Kit e 10 ng sono stati utilizzati per effettuare il minisequenziamento. Mentre 2µl si sono utilizzati per effettuare il sequenziamento diretto svolto con il kit Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (Applied Biosystems).

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Il volume della reazione di minisequenziamento è di 10 µl,composti da:

5µl del Ready Reaction Premix

10 pmol di primer per il minisequenziamento.

estensione per 30 s a 60°C.

Alla fine dei cicli il prodotto di misequenziamento è stato purificato utilizzando delle colonnine con Sephadex G‐50.

Si sono poi denaturati per 4 min a 90°C 0,2 µl del purificato e 15 µl di Hi-Di Formammide e poi caricati sul sequenziatore automatico ABI Prism 3130xl.

Analizzando la sequenza abbiamo potuto vedere che il paziente precedentemente caratterizzato come eterozigote risultava tale anche in queste analisi(figura 24), allo stesso modo il paziente omozigote(figura 25), mentre il controllo risultava privo della mutazione(figura 26).Inoltre si è anche potuto vedere che per entrambi la mutazione ΔF508 è causata della delezione CTT .

Lo stesso risultato è stato riscontrato nell’analisi della sequenza ottenuta dal sequenziamento diretto come mostrato nelle figure sottostanti.

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Figura 24 Risultato minisequenziamento e sequenziamento diretto paziente eterozigote

Figura 25 Risultato minisequenziamento e sequenziamento diretto paziente omozigote

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4.4. Prova con due GLOBULI POLARI di due diversi ovociti

I globuli polari utilizzati sono stati prelevati da due diversi ovociti. Gli ovociti sono tenuti in apposite piastre con dei pozzetti contenenti il terreno cleavage medium (Cook) in termostato a 37°C con una percentuale del 5.5 % di CO2 . Prima di procedere con il prelievo dei globuli polari, la piastra contenente l’ovocita viene osservata al microscopio invertito e con un’apposita pipetta si aspira l’ovocita che viene poi posto in una piastra contenente una goccia di terreno di coltura HEPES buffer (Cook) ricoperta successivamente con olio di paraffina che impedisce l’evaporazione del terreno e una variazione di pH. Questa piastra viene poi osservata al microscopio invertito dotato di un micromanipolatore (Olimpus IXSY). Per poter prelevare un globulo polare si utilizzano alcune pipette speciali con dimensioni e orientazione adeguate: la pipetta di suzione di Holding che aspira l’ovocita e lo immobilizza, un coltello microchirurgico con cui viene effettuato un taglio nella zona pellucida di circa 20 micrometri e la pipetta di aspirazione che consente di prelevare un globulo polare. Una volta prelevato il globulo polare si mette in una eppendorf da 0,2 ml contenente 5 µl di buffer di lisi alcalino (200 mmol/l KOH, 50 mmol/l DTT) e si copre con una goccia di olio minerale.

La lisi cellulare viene effettuata tramite incubazione a 65°C per 10 min. Il buffer di lisi alcalino viene poi neutralizzato tramite aggiunta di 5 µl di buffer di neutralizzazione (900 mmol/l Tris–HCl, 200 mmol/l KCl, 200mmol/l HCl) prima di procedere alla PCR.

La reazione di PCR è stata allestita secondo il seguente schema:

Eppendorf 1 (1 globulo polare di un ovocita) Eppendorf 2 (1 globulo polare di un altro ovocita) Eppendorf 3 (controllo negativo)

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Il successo dell’amplificazione si è monitorato tramite corsa elettroforetica di 10 µl del prodotto di PCR per 5 min a 150V in agarosio al 2% in

Tris-borate/EDTA buffer colorato con 0,5 µg/ml di bromuro di etidio(figura 27).

Figura 27 Risultato della PCR sui globuli polari

Si è così verificata l’assenza di contaminazione; inoltre non erano presenti amplificati probabilmente per la esigua quantità di DNA dei globuli polari. Successivamente è stata svolta la nested PCR.

La reazione di nested PCR è stata allestita secondo il seguente schema:

 Eppendorf 1N (contenente 2 µl dell’amplificato precedente n° 1 e 3 µl di H2O)

Eppendorf 3 (controllo negativo formato da 2µl del controllo precedente + 3 µl di H2O)

Anche in questo caso il successo della nested PCR è stato valutato tramite corsa elettroforetica per 5 min a 150V. Si è così potuto verificare che non erano presenti contaminazioni, ma soprattutto si è visto che è avvenuta la corretta amplificazione nelle due eppendorf contenenti i globuli polari.

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Siamo quindi riusciti ad amplificare perfettamente la quantità di DNA presente in un globulo polare.(figura 28).

Figura 28 Risultato NESTED PCR sui globuli polari

Il prodotto della nested PCR 1N e 2N sono stati poi purificati con il QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) e quantizzati.

Il volume della reazione di minisequenziamento è di 10 µl, composti per la eppendorf 1 da:

10 pmol di primer capace di individuare la delezione CTT per il minisequenziamento.

Mentre per la eppendorf 2 la reazione di minisequenziamento era composta da:

10 pmol di primer capace di individuare la delezione TTT per il minisequenziamento.

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I prodotti di minisequenziamento sono stati purificati utilizzando delle colonnine con Sephadex G‐50. Si sono poi denaturati per 4 min a 90°C 0.2 µl del purificato di un blastomero con 15 µl di Hi-Di Formammide. Una volta terminata la denaturazione i due campioni sono stati corsi sul sequenziatore automatico ABI Prism 3130xl.

Analizzando le due reazioni abbiamo individuato nel campione 1 il picco di colore nero corrispondente ad una citosina - C che era la base che ci aspettavamo dovesse essere incorporata(figura 29),

Figura 29 Risultato minisequenziamento per delezione CTT

mentre per il campione 2 abbiamo individuato un picco di colore verde corrispondente ella base adenina – A che ci aspettavamo dovesse essere incorporata(figura 30).

Figura 30 Risultato minisequenziamento per delezione TTT

A seguito dei risultati ottenuti possiamo affermare in modo oggettivo di essere riusciti a svolgere effettivamente un protocollo di analisi genetica su singola cellula.