Determinazione simultanea di Escherichia coli e dei coliformi totali nelle acque e negli alimenti con la tecnica M.F. (metodo APAT-CNR-IRSA 7010).
La determinazione ed il conteggio dei coliformi e/o di E. coli è uno dei test principali per valutare la qualità microbiologica degli alimenti e delle acque. I metodi convenzionali richiedono dalle 24 alle 72 ore per ottenere risultati completi e presentano a volte falsi positivi e falsi negativi o risultati di dubbia
interpretazione quando la fermentazione del lattosio è debole o ritardata.
Di seguito vengono proposti due substrati di isolamento alternativi.
Terreno impiegato: C-EC Agar
Questo terreno consente, in 18-24 ore, una determinazione quantitativa e contemporanea dei coliformi totali e di Escherichia coli con incubazione a 37°C, o la determinazione di E. coli e dei coliformi fecali con incubazione a 44°C.
Il C-EC Agar è un terreno di coltura fluorogenico e cromogenico per la presenza dei substrati MUG, X-Gluc e IPTG . I coliformi che possiedono l’enzima betagalattosidasi, idrolizzano il composto X-GAL e coltivano con colonie verde-blu. L’Escherichia coli, oltre ad idrolizzare il composto X-GAL, idrolizza anche il MUG e produce indolo dal triptofano e coltiva formando colonie verde blu, fluorescenti alla lampada di Wood e positive al test dell’indolo.
Tale test può essere eseguito direttamente sulla piastra con una goccia di reattivo di Kovacs.
E’ possibile utilizzare il terreno con la semina in superficie o con la semina per inclusione nell’esame degli alimenti o con la tecnica delle membrane filtranti per l’esame delle acque.
- Determinazione di E. coli e coliformi totali, con incubazione a 35°C per 18-24 ore - Determinazione di E. coli e coliformi fecali con incubazione a 44°C per 18-24 ore Dopo 18-24 ore di incubazione interpretare i risultati secondo lo schema seguente:
- colonie verde blu: coliformi
- colonie verde blu, fluorescenti alla lampada di Wood, positive al test dell’indolo: E. coli - colonie incolori: altri batteri Gram negativi
Terreno impiegato: m-Endo agar Les
La presenza di sodio desossicolato, solfito di sodio e sodio laurilsolfato, inibiscono la crescita dei germi Gram+; la fucsina basica è l’indicatore di pH.
Si utilizza la tecnica classica di filtrazione su membrana. Si incuba in termostato a 36°C per 24 ore.
Le colonie tipiche dei microrganismi coliformi mostrano una colorazione da rosa a rosso scuro con un riflesso verde metallico.
Si contano tutte le colonie di questo tipo e si esprime il risultato come coliformi totali per volume di acqua analizzato.
È possibile procedere, per la verifica dell’appartenenza alla famiglia delle Enterobatteriacee, a cui il gruppo dei coliformi totali appartiene, alla prova della citocromossidasi, quale prova di conferma.
Eventualmente si può effettuare l’identificazione delle colonie sospette utilizzando i sistemi miniaturizzati di identificazione biochimica.
Lo strumento legislativo riferito alle acque minerali naturali è il Decreto Legislativo del 25/01/1992 n°
105, seguito dal D.M. del 10/02/2015 sui criteri di valutazione delle caratteristiche delle acque minerali naturali.
La determinazione viene eseguita su un campione di 250 mL di acqua, accertata su semina in due repliche.
Tecnica adoperata: filtrazione con M.F.
Flambatura della base e della bocca Estrazione del filtro sterile dalla confezione dell’imbuto al bunsen
Sterilizzazione della pinzetta La membrana viene posta sul supporto
Filtrazione del campione Deposizione del filtro sul terreno di coltura
Incubazione in termostato a 36°C e a 44°C
m-Endo agar Les
Colonie di coliformi di color rosso scuro con riflessi verde metallico
