LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
Agnė Giedraitienė
CTX-M β-LAKTAMAZES GAMINANČIŲ
Escherichia coli MOLEKULINĖ
CHARAKTERISTIKA
Daktaro disertacija Biomedicinos mokslai, biologija (01B) Kaunas, 2014 1Disertacija rengta 2007–2014 m. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Mikrobiologijos ir virusologijos institute.
Mokslinis vadovas:
prof. dr. Alvydas Pavilonis (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, bio-medicinos mokslai, biologija – 01B)
Konsultantai:
dr. Jolanta Jeroch (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, biomedicinos mokslai, biologija – 01B)
prof. dr. Astra Vitkauskienė (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, biomedicinos mokslai, medicina – 06B) (2010–2014)
TURINYS
SANTRUMPOS ... 5
ĮVADAS ... 7
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 9
DARBO MOKSLINIS NAUJUMAS IR AKTUALUMAS ... 10
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 11
1.1. Escherichia coli klinikinė svarba ir atsparumo antibiotikams problema ... 11
1.2. Antibiotikai ir bakterijų atsparumo antibiotikams mechanizmai ... 11
1.3. β-laktaminiai antibiotikai ir jų nomenklatūra ... 14
1.4. β-laktamazių klasifikacija. CTX-M β-laktamazės ir jų paplitimas ... 17
1.5. CTX-M β-laktamazes gaminančių bakterijų rezervuarai ... 23
1.6. blaCTX-M genų kilmė ... 25
1.7. blaCTX-M genų aplinka. ISEcp1 seka ... 27
1.8. blaCTX-M genų pernaša plazmidėmis. Plazmidžių nesuderinamumo grupės ... 29
1.9. E. coli padermių filogenetinės grupės ... 33
1.10. E. coli padermių didelės rizikos klonai ... 34
2. METODIKA ... 36
2.1. Bioetikos komiteto ir asmens duomenų apsaugos inspekcijos leidimas atlikti biomedicininį tyrimą ... 36
2.2. Tiriamųjų E. coli padermių atranka ir tyrimo planas ... 36
2.3. Mikrobiologinių tyrimų metodika ... 38
2.3.1. E. coli padermių identifikavimas ... 38
2.3.2. Pirminis jautrumo antibiotikams nustatymas ... 39
2.3.3. Minimalios slopinamosios koncentracijos nustatymas ... 39
2.4. Genetinių tyrimų metodika ... 41
2.4.1. Bakterinės DNR išskyrimas ... 41
2.4.2. PGR mišiniai ir sąlygos ... 42
2.4.3. PGR produktų analizė, atlikta elektroforezės metodu ir agarozės gelio vizualizavimas ... 50
2.4.4. Hibridizacija ... 51
2.4.5. E. coli padermių atsparumo antibiotikams genų pernaša kojugacijos metodu ir plazmidžių replikono tipų nustatymas ... 52
2.4.6. Statistinė duomenų analizė ... 53
3. REZULTATAI ... 54
3.1. E. coli padermių atsparumo antibiotikams bendroji charakteristika ... 54
3.2. E. coli padermių dauginis atsparumas antibiotikams ... 59
3.3. E. coli padermių molekulinė charakteristika ... 60
3.3.1. Atsparumo antibiotikams genų paieška ... 60
3.3.2. blaCTX-M genų paplitimo dažnis. E. coli padermių, turinčių blaCTX-M genus, atsparumas antibiotikams ... 61
3.3.3. blaCTX-M genų aplinkos tyrimas ... 68
3.3.4. Plazmidžių replikonų tipų nustatymas ... 72
3.3.5. E. coli padermių pasiskirstymas pagal filogenetines grupes. ST131 klono dažnis ... 73
3.4. E. coli padermių blaCTX-M genų ir filogenetinių grupių, infekcijos šaltinių ir atsparumo antibiotikams sąsąjų tyrimas ... 77
4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 80
4.1. E. coli padermių dauginis atsparumas antibiotikams. blaCTX-M genų paplitimas ir jų aplinka ... 81
4.2. E. coli padermių pasiskirstymas pagal filogenetines grupes. ST131 klono dažnis ... 83
4.3. Plazmidžių vaidmuo blaCTX-M genų perdavime E. coli padermėse ... 84
4.4. blaCTX-M genų ir infekcijos šaltinio, blaCTX-M genų ir filogenetinių grupių, blaCTX-M genų ir atsparumo antibiotikams sąsajos ... 86
IŠVADOS ... 88
LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 90
PUBLIKACIJOS DISERTACIJOS TEMA ... 102
PRIEDAI ... 104
1 priedas ... 104
2 priedas ... 105
PADĖKA ... 106
SANTRUMPOS
AAKL – Alytaus apskrities S. Kudirkos ligoninė
AMI – amikacinas
AKT – apatiniai kvėpavimo takai
a. r. – amino rūgštis
A/S – ampicilinas/sulbaktamas
AZT – aztreonamas
AXO – ceftriaksonas
bla – genas, koduojantis β-laktamazę
CAZ – ceftazidimas
CIP – ciprofloksacinas
CLSI – Klinikinių ir laboratorinių standartų institutas (angl. Clinical and Laboratory Standard Institute)
CTX – cefotaksimas
CTX-M – CTX-M β-laktamazė, cefotaksimazė
GAT – gatifloksacinas
GEN – gentamicinas
DAA – dauginis atsparumas antibiotikams DNR – dezoksiribonukleininė rūgštis
EARS-Net – Europos atsparumo antibiotikams stebėsenos programa ESBL – išplėsto spektro β-laktamazė (angl. extended spectrum
β-lactamases)
FEP – cefepimas
Inc – plazmidžių nesuderinamumo grupė
(angl. Incompatibility)
KOS – kiti organizmo skysčiai
KSV – kolonijas sudarantis vienetas (1 bakterijų kolonija išauga iš vienos bakterijos)
LSMUL KK – Lietuvos sveikatos mokslų universiteto ligoninė Kauno klinikos
ML – Marijampolės ligoninė
MSK – minimali slopinamoji koncentracija
NIT – nitrofurantoinas
OXA – OXA β-laktamazė, oksacilinazė
PGR – polimerazės grandininė reakcija PJB – penicilinus jungiantys baltymai PI – pasikliaujamasis intervalas RPL – Respublikinė Panevėžio ligoninė RŠL – Respublikinė Šiaulių ligoninė
SOS – sterilūs organizmo skysčiai
ŠS – šansų santykis
ŠT – šlapimo takai
SHV – SHV β-laktamazė (angl. Sulfhydryl reagent variable)
ST131 – sekos tipas 131
SXT – trimetoprimas/sulfametoksazolis
TEM – TEM β-laktamazė (fermento pavadinimas kilęs iš paciento pavardės Temoniera)
TIM – tikarcilinas/klavulano rūgštis TKC – trečios kartos cefalosporinai
TOB – tobramicinas
TZP – piperacilinas/tazobaktamas
ĮVADAS
Escherichia coli (E. coli) bakterija yra labiausiai paplitęs mikroorga-nizmas sveikų žmonių virškinamajame trakte (Sievert ir kt., 2013). Nusilpus „šeimininko“ imuninei sistemai ar mikroorganizmui patekus į jam neįprastą aplinką, gali padidėti bakterijos virulentiškumas (Koljalg ir kt., 2013). Neracionalus ir ilgaikis antibiotikų vartojimas, keliautojų nuolatinės išvykos į užsienį didina E. coli atsparumą antibiotikams (Tham ir kt., 2013). Tad ypatingas dėmesys turėtų būti skiriamas atsparių bakterijų stebėsenai, anti-biotikų atsparumo mechanizmų identifikavimui, naujų antianti-biotikų bei gydy-mo strategijų paieškai (Surveillance report, 2013).
Naujausiais Europos antimikrobinio atsparumo priežiūros tinklo duome-nimis (angl. EARS-Net), 2011 m. EARS-Net veikloje dalyvaujančiose šalyse, E. coli atsparumas trečios kartos cefalosporinams (TKC) svyravo nuo 3 proc. (Švedijoje) iki 36 proc. (Kipre). E. coli atsparumas TKC (įskai-čiuojant vidutiniškai jautrias ir atsparias padermes) 2006–2012 m. Lietuvoje vidutiniškai padidėjo 1,5 proc. (nuo 5,9 iki 7,4 proc.) (Surveillance report, 2013).
Daugelis E. coli padermių, atsparių TKC, pasižymi dauginiu atsparumu antibiotikams bei gamina išplėsto spektro β-laktamazes (angl. ESBL). Per pastaruosius 10 metų E. coli gaminamas TEM ir SHV ESBL β-laktamazes beveik pakeitė CTX-M β-laktamazės (Rodriguez-Villalobos ir kt., 2011), kurių šiuo metu identifikuojama apie 150 (Rubin ir Pitout, 2014). Tad CTX-M fermentų paplitimas pasaulyje jau vadinamas „CTX-M pandemija“ (Canton ir kt., 2012). CTX-M-1 grupės fermentai (CTX-M-1, CTX-M-3 ir CTX-M-15 β-laktamazės) dominuoja daugelyje pasaulio šalių, CTX-M-9 grupės fermentai (CTX-M-14, CTX-M-16, CTX-M-19, CTX-M-27 β-lakta-mazės) dažniausiai aptinkami Ispanijoje ir Azijos šalyse (Livermore ir kt., 2007).
CTX-M β-laktamazes koduojančių blaCTX-M genų plitimą didina trys
pagrindiniai bakterijų genų pernašos mechanizmai: (a) atsparumo antibio-tikams genų perkėlimas tarp mobiliųjų genetinių elementų; (b) plazmidžių ir/ar transpozonų paplitimas tarp padermių; (c) padermių, įgijusių atsparumo genus antibiotikams, klonų plitimas (Pfeifer ir kt., 2010; Broaders ir kt., 2013). blaCTX-M genų mobilizacija ir ekspresija yra glaudžiai susijusi su
ISEcp1 įterptinėmis sekomis. Šios sekos atsakingos už vieneto, kurį sudaro ISEcp1 seka ir blaCTX-M genas, pernašą. ISEcp1 sekos promotorius yra
būti-nas blaCTX-M geno ekspresijai (Wang ir kt., 2013). ISEcp1 įterptinės sekos
dažniausiai aptinkamos blaCTX-M-14, blaCTX-M-15 ir blaCTX-M-9 genų aplinkoje
(Kiiru ir kt., 2013).
blaCTX-M genų pernaša mobiliaisiais genetiniais elementais, t. y.
integro-nais, transpozointegro-nais, fagais ir plazmidėmis, skatina blaCTX-M genų plitimą
tarp ESBL E. coli padermių (Forsberg ir kt., 2012). E. coli (kaip ir kitų kli-niškai svarbių Enterobacteriaceae šeimos bakterijų) atsparumą antibioti-kams lemia „atsparumo“ (angl. resistance) plazmidžių genai, koduojantys E. coli atsparumą pagrindinėms antibiotikų klasėms: β-laktamams, aminoglikozidams, tetraciklinams, chloramfenikoliui, sulfonamidams, tri-metoprimui, makrolidams ir chinolonams (Carattoli, 2011; Carattoli, 2009). Šiuo metu daug dėmesio skiriama plazmidėms, priklausančioms IncF, IncL/M, IncI1 ir IncA/C plazmidžių nesuderinamumo grupėms, identifikavimui bei tam, kaip dažnai jos dalyvauja pernešant skirtingus blaCTX-M genų variantus (Carattoli, 2009; Carattoli, 2013).
Pagrindinis veiksnys, lemiantis blaCTX-M genų plitimą, – didelės rizikos
klonai (angl. high risk clone). E. coli padermės, priklausančios O25b:H4-B2-ST131 klonui, yra atsparios kelių skirtingų klasių antibiotikams, išsi-skiria virulentiškumu, geba įgyti naujus atsparumo antibiotikams mechaniz-mus (Coelho ir kt., 2011; Dhanji ir kt., 2011a; Johnson ir kt., 2010). Šios klono savybės ženkliai sumažina antibiotikų, skirtų infekcijoms gydyti, pasirinkimą (Markovska ir kt., 2012). Infekcijų, kurias sukėlė dauginiu atsparumu antibiotikams pasižyminčios E. coli padermės, gydymas gali būti sudėtingas bei grėsti mirtimi (Tham ir kt., 2013).
CTX-M β-laktamazes gaminančių E. coli padermių atsparumas Lietu-voje ir visame pasaulyje nuolat didėja. Atsižvelgiant į šią problemą, darbe siekta nustatyti genų variantus, lemiančius CTX-M β-laktamazes gami-nančių E. coli padermių atsparumą, ir jų aplinką bei kitus veiksnius, kurie įtakoja E. coli padermių atsparumą.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas – nustatyti E. coli padermių, gaminančių CTX-M β-laktamazes, fenotipines ir molekulines charakteristikas bei įvertinti blaCTX-M
genų sąsajas su filogenetinėmis grupėmis, infekcijos šaltiniu ir atsparumu antibiotikams Lietuvos populiacijoje.
Darbo uždaviniai:
1. Nustatyti CTX-M β-laktamazes gaminančių E. coli padermių dauginio atsparumo antibiotikams dažnį ir dažniausią jo derinį. 2. Identifikuoti E. coli blaCTX-M genų variantus, jų ryšį su atsparumu
antibiotikams, įvertinti ISEcp1 įterptinės sekos dažnį ir nustatyti plazmides, atsakingas už blaCTX-M genų pernašą.
3. Nustatyti filogenetinių grupių bei ST131 klono dažnį E. coli padermėse.
4. Įvertinti blaCTX-M genų ir filogenetinių grupių, blaCTX-M genų ir
infekcijos šaltinio bei blaCTX-M genų ir atsparumo antibiotikams
sąsajas CTX-M β-laktamazes gaminančiose E. coli padermėse Lietuvos populiacijoje.
DARBO MOKSLINIS NAUJUMAS IR AKTUALUMAS
Atliktas tyrimas leidžia detaliau pažvelgti į E. coli padermių atsparumo antibiotikams mechanizmus. Duomenų apie blaCTX-M genų ir filogenetinių
grupių, blaCTX-M genų ir infekcijos šaltinio, blaCTX-M genų ir atsparumo
antibiotikams sąsajas CTX-M β-laktamazes gaminančiose E. coli padermėse bei apie analogiškus tyrimus, remiantis prieinamais informaciniais šaltiniais (Medline (Pubmed), EBSCO Publishing, Lippincott Williams & Wilkins, Oxford University Press: Oxford journals, Science Direct, Springer Link Information Service, Wiley InterScience) rasti nepavyko.
Tyrimo metu nustatyta, kad tikimybė, jog E. coli padermė gali priklausyti vienai ar kitai filogenetinei grupei, arba tikimybė, kad E. coli padermė gali būti atspari tam tikram antibiotikui, mažėja arba didėja priklausomai nuo blaCTX-M geno varianto.
Iki šiol blaCTX-M-92 genas nustatytas E. coli padermėse tik Lietuvoje
(Šeputienė ir kt., 2010). Pirmą kartą buvo identifikuotos blaCTX-M-92 geno ir
dviejų blaCTX-M genų derinių pernašoje dalyvaujančios skirtingų
nesuderina-mumo grupių plazmidės.
Siekiant geriau suprasti blaCTX-M genų pernašos mechanizmus, buvo
nustatytas ir ISEcp1 įterpimo sekos dažnis CTX-M β-laktamazes gaminan-čiose E. coli padermėse. Įterptinė ISEcp1 seka dažniau nustatyta E. coli pa-dermėse, turinčiose blaCTX-M-15 geną. O E. coli padermės, koduojančios
blaCTX-M-92 ir blaCTX-M-2 genus, ISEcp1 sekos neturėjo.
Iki šiol Lietuvoje nebuvo nustatytas ir įvertintas filogenetinių grupių bei ST131 klono dažnis CTX-M β-laktamazes gaminančiose E. coli padermėse. Parodyta, kad ST131 klono paplitimas susijęs ne tik su pasaulyje plačiai paplitusiu blaCTX-M-15 genu, bet ir su kitais blaCTX-M genais ar dviejų blaCTX-M
genų deriniais.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Escherichia coli klinikinė svarba ir atsparumo antibiotikams problema
Trys pagrindinės Enterobacteriaceae šeimos bakterijų rūšys, dažniausiai sukeliančios įvairias infekcijas, – E. coli, Klebsiella pneumoniae (K. pneu-moniae) ir Enterobacter spp. (Rodriguez-Villalobos ir kt., 2010). E. coli yra normali storojo žarnyno mikrobiota (Sievert ir kt., 2013). Gimus naujagi-miui, bakterija apsigyvena jo žarnyne ir tampa normalios žarnyno mikro-biotos dalimi (Palmer ir kt., 2007). E. coli gyvena simbiozėje su šeimininku, tačiau patekusi į šlapimo takus, likvorą ar kraują, gali sukelti infekciją (Allocati ir kt., 2013).
E. coli bakterija yra viena dažniausių, visuomenėje įgyjamų žarnyno ir šlapimo takų infekcijų (>85 proc.) bei atsitiktinių bakteriemijų priežasčių (Pitout, 2009). Ji gali sukelti ir kitas hospitalines bei visuomenėje įgyjamas infekcijas – pneumoniją, sepsį, meningitą, žaizdų ir centrinės nervų sistemos infekcijas (Schubert ir kt., 2009; Allocati ir kt., 2013).
Pagrindinė, didelio mirštamumo nuo infekcijų, kurias sukelia antibioti-kams atsparios bakterijos, priežastis yra netinkamas pradinis antimikrobinis gydymas bei vis mažėjantis antibiotikų, kuriems bakterijos yra jautrios, skaičius (Oteo ir kt., 2010; Prescott, 2014). E. coli atsparumas antibio-tikams, ypač TKC ir fluorochinolonams, nuolat didėja dėl: a) neracionalaus ir ilgo antibiotikų vartojimo, b) užsitęsusio gydymo ligoninėse, operacijų, kateterizacijos, invazinių medicininių prietaisų naudojimo, c) ilgo buvimo slaugos namuose, d) kelionių į užsienį, e) paciento amžiaus (> 65 m.) (Tham ir kt., 2013; Boucher ir kt., 2013).
1.2. Antibiotikai ir bakterijų atsparumo antibiotikams mechanizmai Antibiotikai veikia bakterijos fiziologiją, joje vykstančius biocheminius procesus, sukelia bakterijos žūtį bei stabdo bakterijų augimą (Goldstein, 2011). Pagal struktūrą ir veikimo pobūdį, antibiotikai skirstomi į kelias grupes. Antibiotikai gali slopinti bakterijų (I) baltymų sintezę; (II) DNR ir RNR nukleorūgščių sintezę; (III) ląstelės membranos funkcijas; (IV) ląstelės sienelės sintezę; ir stabdyti (V) folinės rūgšties (vitamino B9) sintezę (1.2.1 pav.). β-laktaminiai antibiotikai (penicilinai, cefalosporinai ir karba-penemai) blokuoja bakterinės ląstelės sienelės sintezę. Tetraciklinai, aminoglikozidai, makrolidai ir kiti antibiotikai atakuoja bakterijų ribosomas (Wright, 2010).
Atsparumas antibiotikams – tai tam tikromis savybėmis pasižyminčio mikroorganizmo atsparumas antibiotikui, kuriam natūraliai jis turėtų būti jautrus (WHO, 2013). Įgimtas atsparumas antibiotikui – kai bakterijoje nėra antibiotikui jautrių taikinių, arba ląstelės sienelės nepralaidžios didelėms antibiotikų molekulėms (Davies ir Davies, 2010). Įgytą atsparumą lemia du pagrindiniai mechanizmai: vertikalioji ir horizontalioji genų pernašos. Verti-kaliosios genų pernašos pavyzdys – taškinė mutacija chromosomų genuose, kuri lemia atsparumą antibiotikams, bet nekeičia bakterijos patogeniškumo ir gyvybingumo. Horizontalioji genų pernaša – pagrindinė atsparumo anti-biotikams priežastis, kai atsparumo antianti-biotikams genai pernešami bakterio-fagais, transpozonais ar plazmidėmis (Wright, 2010).
Įgijusi atsparumo antibiotikams genus, bakterija toliau naudoja keletą bio-cheminių atsparumo mechanizmų, t. y. inaktyvuoja antibiotiką, modifikuoja taikinį, kinta jos membranos pralaidumas (kinta išorinės membranos struktūra arba atsiranda naujų membranos baltymų pernešėjų) ar „apeinamas“ bolinis kelias (senasis metabolinis kelias slopinamas, atsiranda naujas meta-bolinis kelias) (Wright, 2010; Giedraitienė ir kt., 2011) (1.2.1 pav.). „Apėjimo“ atveju, antibiotikus ar jų taikinius sujungia baltymai, kurie saugo taikinį nuo susijungimo su antibiotikais. Aktyviam kenksmingų medžiagų išmetimui iš ląstelės naudojami siurbliai (efliuksas, angl. efflux) (Kohanski ir kt., 2010).
Dažniausiai bakterijų naudojamas ir labiausiai išplėtotas biocheminis atsparumo mechanizmas – antibiotiko modifikacija. Bakterijų fermentai at– pažįsta antibiotikus, juos modifikuoja ir neleidžia prisijungti prie taikinių, pvz.: β-laktamazės atidaro β-laktamo žiedą (Wright, 2010).
Enterobacteriaceae šeimos bakterijų atsparumo antibiotikams mecha-nizmai. Gramneigiamų bakterijų įgimtą atsparumą penicilinui G lemia
dvi-guba bakterijų membrana, kuri neleidžia antibiotikui pasiekti taikinio ląste-lės sienelėje. Bakterijų atsparumą kitiems β-laktaminiams antibiotikams sąlygoja: (I) pakitusi kanalų, esančių ląstelės membranoje, struktūra; anti-biotikai sunkiau pasiekia penicilinus jungiančius baltymus (PJB); (II) gali-mos PJB baltymų, dalyvaujančių ląstelės sienelės sintezėje, modifikacijos; sumažėja PJB2 baltymo „jautrumas“ β-laktaminiams antibiotikams (Cox ir Wright, 2013; Kohanski ir kt., 2010).
1.2.1 pav. Antibiotikų taikiniai ir bakterijos atsparumo
antibiotikams mechanizmai (pagal Wright, 2010).
Pagrindinis Enterobacteriaceae šeimos bakterijų atsparumo mecha-nizmas – antibiotikų inaktyvacija. Bakterijų periplazminėje erdvėje β-lakta-mazėms susijungus su antibiotikais, tarp jų susidaro nekovalentinis ryšys (1.2.2 pav.). Acetilinimo reakcijos metu, β-laktaminis žiedas atakuojamas hidroksilinės fermento grupės, ir formuojamas kovalentinis acil – esterinis ryšys. Hidrolizės metu išlaisvinamas aktyvusis fermentas ir inaktyvuotas antibiotikas (Livermore ir kt., 2008; Rice, 2012).
1.2.2 pav. Serino β-laktamazės veikimo principas (Livermore ir kt., 2008).
1.3. β-laktaminiai antibiotikai ir jų nomenklatūra
β-laktaminiai antibiotikai turi keturnarį β-laktaminį žiedą, sudarytą iš trijų anglies ir vieno azoto atomo (1.3.1 pav.). Pagal β-laktaminio žiedo ir prijungto žiedo struktūrą, antibiotikai skirstomi į penicilinus, cefalospo-rinus, karbapenemus, monobaktamus ir β-laktamazių slopiklius (Drawz ir Bonomo, 2010).
β-laktaminiai antibiotikai – tai galinių amino rūgščių (D-alanyl – D-ala-ninas) liekanos, esančios peptidoglikano pirmtako NAM/NAG-peptido sub-vienete, analogai. Jų taikinys yra PJB – fermentai transpeptidazės (Sauvage ir kt., 2008). Antibiotiko β-laktaminis žiedas jungiasi prie aktyviame PJB baltymo centre (403-ioje padėtyje) esančios serino liekanos ir ją acetilina. Taip antibiotikas slopina ląstelės sienelės sintezę (Drawz ir Bonomo, 2010).
1.3.1 pav. Pagrindinių β-laktaminių antibiotikų cheminė struktūra
a) penicilinas; b) cefalosporinas; c) monobaktamas; d) karbapenemas. β-laktaminis žiedas yra keturnaris žiedas, turintis tris anglies ir vieną azoto (N) atomą. R grupė žymi šonines grandines (pagal Machebouef ir kt., 2007).
Pusiau sintetiniai penicilinai, karboksipenemai, monobaktamai, I–V kar-tos cefalosporinai sukurti siekiant sustabdyti gramteigiamų ir gramneigiamų bakterijų dauginimąsi (Kong ir kt., 2009). Tačiau šie antibiotikai neveikia bakterijų, kurių sienelės mažai pralaidžios (t. y. Mycobacteria) arba jos visai neturi (t. y. Mycoplasma), taip pat viduląstelinių patogenų (t. y. Brucella, Legionella ir Chlamydia) (Duplesis ir kt., 2011).
Penicilinai. Penicilinus sudaro β-laktaminis žiedas, tiazolidino žiedas ir prijungtos šoninės grandinės, kurioms keičiantis, keičiasi ir penicilinų aktyvumas (1.3.1 pav., a). „Penicilinas“ – siauro spektro β-laktamas, jautrus β-laktamazėms, išskyrus temociliną (Livermore ir kt., 2006).
Cefalosporinai. Cefalosporinus sudaro β-laktaminis žiedas, sujungtas su dihidrotiazino žiedu bei skirtingomis šoninėmis grandinėmis, kurios lemia antibiotikų antibakterinį aktyvumą, farmakokinetines ir farmakodinamines savybes (1.3.1 pav., b). Cefalosporinai – baktericidiniai antibiotikai, veikia kaip ir daugelis β-laktaminių antibiotikų – stabdo daugelio β-laktamazių veikimą. Šie antibiotikai skirtomi į dvi pagrindines grupes: oksiiminus (cefotaksimas, ceftriaksonas, ceftazidimas) ir metoksicefalosporinus (cefok-sitinas, cefotetanas). Pagal cefalosporinų antibakterinį aktyvumą, jie
skirstomi į I–V kartos cefalosporinus ir β-laktamazių slopiklius (Bryskier ir kt., 1994) (1.3.1 lentelė).
1.3.1 lentelė. Pagrindinių cefalosporinų charakteristika (Duplesis ir kt.,
2011; Laudano, 2011; Zhao ir Hu, 2013).
Cefalospo-rinų karta Veikimo spektras Neveikia Pavyzdžiai
I
siauras, prieš gramteigiamas
bakterijas meticilinui ir vankomicinui atsparių Staphylococcus aureus, penicilinui atsparių Streptococcus pneumoniae, gramneigiamų bakterijų, gaminančių β-laktamazes
cefalotinas, cefazolinas
II platus, prieš gramneigiamas ir gramteigiamas bakterijas Pseudomonas spp., Enterococcus spp., Serratia spp., Bacteroides fragilis
cefuroksimas, cefotetanas, cefoksitinas
III
išplėstas, prieš Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., Providencia spp., β-laktamazes gaminančias Haemophilus influenzae ir Neisseria spp. meticilinui ir vankomicinui atsparių Staphylococcus aureus, gramneigiamų nefermentuojančių bakterijų, ESBL gaminančių bakterijų
ceftriaksonas, cefotaksimas, ceftazidimas
IV išplėstas, prieš bakterijas, chromosomose ir plazmidėse koduojančias β-laktamazes
enterokokų ir anaerobų cefepimas
V
išplėstas, prieš gramneigia-mas ir gramteigiagramneigia-mas bakte-rijas, įskaitant meticilinui ir vankomicinui atsparias S. aureus padermes
Ceftarolino metabolitas - ceftarolinas fosamilis in vitro neveikia išplėsto spektro β-laktamazes gaminančių E. coli ir Klebsiella pneumoniae
ceftarolinas, ceftobiprolis
β-laktamazių slopikliai. β-laktamazių slopikliai sukurti siekiant išsaugoti β-laktaminių antibiotikų aktyvumą ir užtikrinti platesnį jų veikimą. Slopik-liai (klavulano rūgštis, sulbaktamas ir tazobaktamas) veikia bakterijų gami-namas A klasės β-laktamazes, tačiau yra mažiau aktyvūs prieš B, C ir D kla-sės β-laktamazes (Drawz ir Bonomo, 2010).
β-laktaminio antibiotiko ir β-laktamazės slopiklio derinys vadinamas „slopikliu-žudiku“ (Drawz ir Bonomo, 2010). 1981 m. buvo užregistruotas pirmasis derinys – amoksacilinas/klavulano rūgštis (Bush ir Johnson, 2000), ir tik po 20 metų keletas naujų β-laktaminio antibiotiko ir β-laktamazės slopiklio derinių, t. y. ceftolozanas/tazobaktamas, ceftazidimas/avibaktamas ir ceftarolinas/avibaktamas, pasiekė paskutines klinikinių studijų stadijas (Bush ir Fisher, 2011; Shlaes, 2013).
Monobaktamai. Tai monocikliniai antibiotikai, turintys vieną β-laktaminį žiedą. Monobaktamai (t. y. aztreonamas) veikia aerobines gramneigiamas bakterijas, slopina mureino sintezę (1.3.1 pav., c) (Torres ir Blanca, 2010).
Karbapenemai. Molekulinė karbapenemų ir penicilinų struktūra panaši, tik sieros atomas pakeistas anglies atomu (1.3.1 pav., d). Šiai β-laktamų kla-sei priklauso imipenemas, meropenemas, doripenemas, ertapenemas, pa-nipenemas ir biapenemas. Karbapenemai pasižymi plačiausiu antibakterinio aktyvumo spektru prieš gramteigiamas ir gramneigiamas bakterijas (Papp-Wallace ir kt., 2011).
1.4. β-laktamazių klasifikacija. CTX-M β-laktamazės ir jų paplitimas β-laktamazes gamina gramteigiamos ir gramneigiamos bakterijos. Šiuo metu žinoma apie 1000 įvairių β-laktamazių. Šių monomerinių fermentų molekulinis svoris, išskyrus dimerą OXA-10 ir tetramerą L1 MBL, svyruoja nuo 23 iki 44 kDa (Bush, 2012).
β-laktamazės klasifikuojamos pagal dvi pagrindines sistemas: Ambler ir Bush-Jacoby-Medeiros. Molekulinė (arba Ambler) klasifikacija remiasi ami-no rūgščių sekos homologija. Tad β-laktamazės skirstomos į seriami-no (A, C ir D grupės) ir metalo (B grupė) β-laktamazes. Remiantis funkcine (arba Bush-Jacoby-Medeiros) sistema, pagal substrato ir slopiklio komplekso sudėtį, fermentai skirstomi į cefalosporinazes, penicilazes, karbapenemazes ir ne-priskiriamus nei vienai iš ankščiau minėtų grupių (Bush, 2013) (1.4.1 pav.). 2008 m. Livermore ESBL fermentų grupei priskyrė šiuos fermentus: TEM, SHV ir CTX-M (pogrupis 2be), cefalosporinazę (pogrupis 1e) ir cefalospo-rinus, hidrolizuojančius OXA fermentus (pogrupis 2de) (Livermore, 2008). Per 20 metų 2be pogrupis tapo viena didžiausių kliniškai svarbių pogrupių. Ji apima visas svarbiausias išplėsto spektro β-laktamazes (Bush, 2010; Peirano ir Pitout, 2010; Livermore, 2012).
1.4.1 pav. Pagrindinių β-laktamazių grupių molekulinės
ir funkcinės savybės
β-laktamazės į molekulines klases suskirstytos remiantis Ambler klasifikacija. Funkcinės grupės apima β-laktamazes, suskirstytas pagal substrato ir slopiklio kompleksą. Cb – karbapenemai; Cf – cefalosporinai; CA – klavulano rūgštis; EDTA – etilendiaminetetra-acetilo rūgštis; Esc – plataus spektro cefalosporinai; M – monobaktamai; Pn – penicilinai (pagal Bush, 2013).
Išplėsto spektro β-laktamazės. Chromosomų ir plazmidžių koduojami fermentai, hidrolizuojantys vieną ar kelis penicilinus, I–III kartos cefalospo-rinus ir aztreonamą, bet ne cefamicinus ar karbapenemus, yra vadinami iš-plėsto spektro β-laktamazėmis (ESBL). ESBL jautriai reaguoja į klavulano rūgštį, tazobaktamą ir sulbaktamą (Helfand ir kt., 2005; Paterson ir Bono-mo, 2005; Zhao ir Hu, 2013).
Giske ir bendradarbiai pasiūlė supaprastinti ESBL β-laktamazių klasifi-kaciją, kad ji būtų prieinamesnė gydytojams, infekcijų kontrolės specialis-tams ir ligoninių valdymo personalui (Giske ir kt., 2009) (1.4.1 lentelė). ESBL β-laktamazės buvo suskirstytos į tris pagrindines klases: ESBLA,
ESBLM ir ESBLCARBA.
1.4.1 lentelė. ESBL A (ESBLA), ESBL M (ESBLM) ir ESBL klasių, pasižy-minčių hidrolitiniu aktyvumu prieš karbapenemus (ESBLCARBA), klasifikacija (pagal Giske ir kt., 2009).
Įgytos β-laktamazės, pasižyminčios hidrolitiniu aktyvumu prieš išplėsto spektro cefalosporinus ir/arba karbapenemus β-laktamazių
klasės Plačiai paplitę ESBLESBLA A ESBLM ESBLCARBA
CTX-M, TEM-ESBL, SHV-ESBL, VEB, PER ESBLM-C (plazmidėmis įgyta AmpC)
CMY, FOX, MIR, MOX, DHA, LAT, BIL, ACT, ACC
ESBLCARBA-A KPC; GES-2, -4, -5, -6, -8; NMC, SME, IMI-1, -2 Mažai paplitusios ESBLA GES-1, -3, -7, -9; SFO-1, BES-1, BEL-1, TLA, IBC, CMTa ESBLM-D (OXA-ESBL) OXA-10-grupė, OXA-13-grupė, OXA-2- grupė, OXA-18, OXA-45 ESBLCARBA-B (MBL) IMP, VIM, SPM-1, GIM-1, SIM-1, AIM-1 ESBLCARBA-D (OXA
karbapenemazės) OXA-23-grupė, OXA-24-grupė,
OXA-48b, OXA-58-grupė
Veikimo
apibūdinimas Nejautrios išplėsto spektro β-laktamazių ir klavulano rūgšties deriniui Nejautrios išplėsto spektro β-laktama-zėms, fenotipas (ESBLM-C) arba genotipas (ESBLM-D)
Nejautrios išplėsto spektro β-laktamazėms ir ne mažiau kaip vienam karbapenemui,
ESBLCARBA nustatomos fenotipiniais ir/arba genetiniais metodais
aatsparios klavulano r.; bOXA-48 fermentą gaminančios padermės in vitro gali būti jautrios
cefalosporinams.
Pirmą β-laktamazių grupę ESBLA sudaro „klasikinės” ESBL, atsparios
penicilinams ir cefalosporinams, bet jautrios klavulano rūgščiai – CTX-M, SHV ir TEM β-laktamazės. Antrą β-laktamazių grupę sudaro ESBLM,
išplėsto veikimo spektro β-laktamazės, kurioms būdingas atsparumas peni-cilinams, cefalosporinams, dažnai ir karbapenemams, tačiau jos yra jautrios kloksacilinui ir boro rūgščiai. Pagrindinė ESBLM β-laktamazių grupė –
plaz-midinės kilmės AmpC fermentai. ESBLM klasei dar priskiriamos ir kai
kurios OXA-ESBL β-laktamazės. Trečia grupė – ESBLCARBA fermentai,
kurie skaido visus β-laktaminius antibiotikus. Metalo-β-laktamazes (MBL) slopina etilenediaminetetraacto rūgštis (EDTA) arba dipikolino rūgštis (DPA), KPC fermentus – boro rūgštis arba avibaktamas. OXA-23, OXA-24, OXA-48 ir OXA-58 grupių fermentai priskiriami ESBLCARBA klasei (Giske
ir kt., 2009).
Dominuojančios ir klinikiniu požiūriu svarbiausios β-laktamazės – ESBL TEM, ESBL SHV ir CTX-M fermentai (Pitout ir Laupland, 2008; Naas ir kt., 2008). Įvykus taškinėms mutacijoms TEM ar SHV β-laktamazėse, vienai amino rūgščiai pakitus į kitą amino rūgštį, bakterija pradeda gaminti „naują“ β-laktamazę. Dažniausiai pasitaikantys amino rūgščių pasikeitimai: glicinas 238 keičiamas serinu, alaninas 237 – treoninu, argininas 164 – serinu arba histidinu, asparto rūgštis 179 – asparaginu, glutamo rūgštis 104 – lizinu. Tad β-laktamazių skaičius vis didėja (Chen ir kt., 2005).
CTX-M β-laktamazės. Pavadinimu „CTX-M“ (CefoTaXime; fermentas pirmą kartą išskirtas Miunchene iš cefotaksimui atsparios klinikinės E. coli padermės) apibrėžiamas fermento gebėjimas hidrolizuoti cefotaksimą ir cef-triaksoną (Canton ir kt., 2012). CTX-M β-laktamazės jautrios β-laktamazių slopikliams (pvz., klavulano r. ir tazobaktamui), ir avibaktamui (Livermore ir kt., 2008; Lagace-Wiens ir kt., 2011). Priešingai nei TEM-1 ir TEM-2 arba SHV β-laktamazės, visos CTX-M β-laktamazės turi ESBL fenotipą (Gniadkowski, 2008).
CTX-M β-laktamazės koduojamos 291 amino rūgšties seka, išskyrus CTX-M-11 (282 a. r.), CTX-M-107 ir CTX-M-108 (288 a. r.), CTX-M-45 ir CTX-M-109 (289 a. r.), CTX-M-40, CTX-M-63 ir CTX-M-106 (209 a. r.) bei CTX-M-110 β-laktamazes (292 a. r.) (dydis nuo 7 iki 430 kb) (Zhao ir Hu, 2012). CTX-M β-laktamazės – savo struktūra panašūs baltymai, turin-tys α spirales ir β klostes (Bush ir kt., 1995) (1.4.2 pav.).
1.4.2 pav. CTX-M-15 β-laktamazės kristalinė struktūra
Baltymo α spiralės nuspalvintos juoda, β klostės – pilka spalva (http://www.rcsb.org/pdb/ explore/explore.do?structureId=4HBT).
XXI a. pirmame dešimtmetyje CTX-M fermentai tapo labiausiai paplitę ESBL fermentai pasaulyje, ir jau sukėlė visuomenėje įgyjamų šlapimo takų ir vidaus organų infekcijų vadinamąją CTX-M pandemiją (Canton ir Coque, 2006; Pitout, 2009; Rogers ir kt., 2011). Iki 2013 m. rugpjūčio užregistruota apie 150 CTX-M β-laktamazių (http://www.lahey.org/Studies/). Gamtoje aptinkamų ESBL skaičius siekia apie 400 (Rubin ir Pitout, 2014; Naseer ir Sundsfjord, 2011).
Remiantis amino rūgščių homologija, CTX-M fermentai, plazmidinės kilmės cefotaksimazės, gali būti skirstomi į šešias pagrindines grupes (Zhao ir Hu, 2013; D‘Andrea ir kt., 2013) (1.4.3 pav.):
1. CTX-M-1; 2. CTX-M-2; 3. CTX-M-8; 4. CTX-M-9; 5. CTX-M-25; 6. KLUC grupė. 21
Keturi CTX-M β-laktamazių variantai, kurie negali būti priskirti kuriai nors minėtai CTX-M β-laktamazių grupei, pateikiami atskirai. CTX-M-45 ir CTX-M-132 β-laktamazės yra nežinomos kilmės baltymo, ir atitinkamai, CTX-M-14 ir CTX-M-15 β-laktamazių hibridai (D‘Andrea ir kt., 2013). CTX-M-64 ir CTX-M-137 laktamazės yra CTX-M-14 ir CTX-M-15 β-laktamazių hibridai (Nagano ir kt., 2009; Tian ir kt., 2014), o CTX-M-123 – CTX-M-1 ir CTX-M-9 β-laktamazių hibridas (D‘Andrea ir kt., 2013) (1.4.3 pav.).
1.4.3 pav. CTX-M medis-diagrama, sudaryta, remiantis CTX-M fermentų
ir CTX-M fermentų grupių panašumu
CTX-M grupių nariai, kaip ir Kluyvera spp. pirmtakai, pažymėti pilkai (pagal D‘Andrea ir kt., 2013). CTX-M-137 β-laktamazė schemoje nepažymėta, nes identifikuota tik 2014 m. (Tian ir kt., 2014).
Didelį β-laktamazių paplitimą lemia jų heterogeniškumas (D‘Andrea ir kt., 2013). CTX-M-1 grupę sudaro daugiau nei 60 CTX-M fermentų. CTX-M-15 β-laktamazė, dažniausiai aptinkama CTX-M β-laktamazė pasaulyje, priskiriama šiai grupei (Livermore ir kt., 2007; Peirano ir kt., 2010; Woodford ir kt., 2011). Pirmą kartą CTX-M-15 β-laktamazė buvo nustatyta Indijoje 2001 m. (Karim ir kt., 2001). Manoma, kad Europoje paplitusi CTX-M-15 β-laktamazė yra kilusi iš CTX-M-3 β-laktamazės (asparto rūgštis 240 pakeista glicinu), identifikuojamos Lenkijoje (Poirel ir kt., 2002). Pirmą kartą CTX-M-15 β-laktamazė Lietuvoje buvo nustatyta tigeciklino klinikinio tyrimo metu, tiriant klinikines E. coli padermes (Jones ir kt., 2009). 2010 m. Šeputienė ir kiti mokslininkai nustatė, kad dažniausiai
klinikinės E. coli padermės Lietuvoje gamino CTX-M-15 β-laktamazę (Šeputienė ir kt., 2010).
Antra dažniausiai aptinkama CTX-M β-laktamazė pasaulyje, CTX-M-14 β-laktamazė, pirmą kartą nustatyta Korėjoje 1995 m. (Xu ir kt., 2011). Ji priklauso CTX-M-9 fermentų grupei. Manoma, kad CTX-M-14 β-laktamazė yra CTX-M-9 klasterio pirmtakas, nes CTX-M-9 β-β-laktamazė nuo savo pirmtako skiriasi tik viena amino rūgštimi (alaninas 231 pakeistas valinu) (Valverde ir kt., 2009). CTX-M-14 β-laktamazė pasižymi aukštu hidrolitiniu aktyvumu prieš cefotaksimą, tačiau jos aktyvumas prieš ceftazidimą net 1000 kartų mažesnis (Chen ir kt., 2005). CTX-M-14 β-laktamazė vyrauja Ispanijoje, Pietų Amerikoje ir Rytų Azijoje (Canton ir kt., 2012). 2010 m. CTX-M-14 fermentas išskirtas iš klinikinių E. coli padermių ir Lietuvoje (Šeputienė ir kt., 2010).
CTX-M β-laktamazės įvairiose šalyse gali būti paplitę nevienodai, be to, vienas CTX-M fermentas gali keisti kitą CTX-M fermentą toje pačioje šaly-je (Livermore ir kt., 2007; Chmielarczyk ir kt., 2013). 2007 m. Šeputienė ir kiti mokslininkai atrado naują M-2 grupės fermentą, kuris nuo CTX-M-2 β-laktamazės skyrėsi viena amino rūgštimi (alaninas 205 keičiamas treoninu). Šis fermentas užregistruotas kaip CTX-M-92 β-laktamazė (Gen-Bank accession no. GU127598). 2010 m. CTX-M-92 fermentas E. coli klinikinėse padermėse buvo vienas iš dažniausiai nustatomų fermentų Lietu-voje. Tyrimas su konjugatais parodė, kad E. coli padermių, gaminančių CTX-M-2 ir CTX-M-92 β-laktamazes, ESBL fenotipai panašūs (Šeputienė ir kt., 2010).
Įvairiose šalyse nustatytos skirtingos dominuojančios CTX-M β-lakta-mazės: Ispanijoje (CTX-M-14 ir CTX-M-9 β-laktamazės), Kanadoje ir Ki-nijoje (CTX-M-14 β-laktamazė), Italijoje (CTX-M-1 β-laktamazė), Lenki-joje (CTX-M-3 β-laktamazė), AngliLenki-joje ir Lietuvoje (CTX-M-15 β-lakta-mazė) (Empel ir kt., 2008, Šeputienė ir kt., 2010), Japonijoje ir Izraelyje (CTX-M-2 β-laktamazė) (Bonnet, 2004; Vervoort ir kt., 2012).
1.5. CTX-M β-laktamazes gaminančių bakterijų rezervuarai Paskutiniame praeito tūkstantmečio dešimtmetyje CTX-M β-laktamazės beveik pakeitė vyravusias ESBL TEM ir ESBL SHV β-laktamazes (Rodri-guez-Villalobos ir kt., 2011). CTX-M fermentus gamina 26 bakterijų rūšys, tačiau pagrindinis ESBL šaltinis yra E. coli, K. pneumoniae ir Proteus mira-bilis bakterijos (Zhao ir Hu, 2013). Tiesa, CTX-M β-laktamazės nefermen-tuojančiose bakterijose (Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepacia, Acinetobacter baumanii, Stenotrophomonas maltophilia) aptinkamos gana
retai. Manoma, kad viena iš priežasčių – plazmidžių, pernešančių blaCTX-M
genus, nesuderinamumas arba fenotipiniai sunkumai identifikuojant nefer-mentuojančias ir CTX-M β-laktamazes gaminančias bakterijas (Canton ir kt., 2012). CTX-M β-laktamazės taip pat nustatytos Enterobacter spp., Serratia marcescens, Citrobacter spp. ir Morganella morganii bakterijose, turinčiose chromosominės kilmės AmpC geną (Canton ir kt., 2012; Smith Moland ir kt., 2008; Castanheira ir kt., 2008).
CTX-M β-laktamazes gaminančios E. coli padermės nustatytos tiriamo-joje medžiagoje, išskirtoje iš ligonių, sveikų žmonių, naminių ir laukinių gyvūnų, taip pat iš nuotekų ir upių vandens (Dhanji ir kt., 2010; Shaheen ir kt., 2011; Pinto ir kt., 2010; Bortolaia ir kt., 2010; Smet ir kt., 2010a; Tausova ir kt., 2012). Bartolini ir kiti mokslininkai nustatė atsparumo anti-biotikams genus bakterijose, išskirtose iš žmonių, gyvenančių izoliuotose vietovėse ir niekad nesigydžiusių antibiotikais, žarnyno (Bartoloni ir kt., 2009).
Manoma, kad pagrindiniai CTX-M β-laktamazių šaltiniai yra slaugos na-mų pacientai ir keliautojai. Fluorochinolonams atsparios E. coli padermės, gaminančios CTX-M β-laktamazes ir sukeliančios šlapimo takų infekcijas, išskirtos iš vyresniojo amžiaus žmonių, gyvenančių ilgalaikės priežiūros įstaigose, klinikinės medžiagos bei kitoje visuomeninėje aplinkoje (Dhanji ir kt., 2010; Pitout ir kt., 2009). Paltansing ir bendradarbiai atliko tyrimą, kurio metu nustatė, kad keliautojų išmatų tepinėliuose, E. coli padermių, gaminančių ESBL β-laktamazes, buvo daugiau po kelionės (30,5 proc.) nei prieš ją (8,6 proc.) (Paltansing ir kt., 2013). Maždaug 13 proc. E. coli sukeltų bakteriemijų nustatoma onkologiniams ligoniams (Gudiol ir kt., 2010). Be to, ESBL gaminančios E. coli, kurios sukelia šlapimo takų infekcijas, dažniau nustatomos visuomenėje nei ligoninėse (Bourjilat ir kt., 2011).
Antibiotikų naudojimas žemės ir vandens ūkyje, atliekų šalinimas sukūrė pagrindinę atsparumo antibiotikams ir virulentiškumo genų „talpyklą“ mik-roorganizmuose (Moura ir kt., 2010). Žinoma, kad ESBL gaminančios E. coli padermės gali „keliauti“ maisto grandine: viščiukų mėsoje, esančios E. coli padermės, gali būti perduodamos žmonėms (Overdevest ir kt., 2011). Viščiukai yra numanomas šaltinis, žmonėms sukeliantis E. coli šlapimo takų infekciją (Nordstrom ir kt., 2013). Atsparumo antibiotikams genų paplitimas visuomeninėje aplinkoje, ligoninėse, taip pat nuotekose ir kitoje aplinkoje pavaizduotas 1.5.1 pav. (Ewers ir kt., 2012; Prescott, 2014).
1.5.1 pav. Atsparumo antibiotikams genų paplitimas visuomeninėje
aplinkoje, ligoninėse, taip pat nuotekose ir kitoje aplinkoje (Ewers ir kt., 2012; Prescott, 2014)
1.6. blaCTX-M genų kilmė
ESBL TEM ir ESBL SHV fermentai evoliucionavo dėl fermentuose – pirmtakuose vykusių mutacijų; kai CTX-M β-laktamazės, įvykus horizon-taliai genų pernašai: genai „perkelti“ iš Enterobacteriaceae šeimai priklausančių Kluyvera spp. bakterijų į kitas Enterobacteriaceae šeimos bakterijas (Humeniuk ir kt., 2002). Šių bakterijų chromosomose cefatoksimazes koduojantys genai glaudžiai siejasi su E. coli CTX-M fermentais. Įdomu, kad E. coli padermės, turinčios blaCTX-M genus yra
atsparios cefotaksimui, kai Kluyvera spp. bakterijos, turinčios analogiškus genus, – jautrios šiam antibiotikui (Decousser ir kt., 2001).
Nustatyta, kad blaCTX-M-2, blaCTX-M-4, blaCTX-M-6 ir blaCTX-M-7 genai yra 95–
100 proc. identiški chromosomose koduojamiems K. ascorbata blaKLUA-1
genams (Humeniuk ir kt., 2002) (1.6.1 lentelė), o plazmidinės kilmės blaCTX-M-5 genas – blaKLUA-2 genui. blaCTX-M-8, blaCTX-M-9 ir blaCTX-M-25 genai
kildinami iš K. georgiana chromosominių blakluG genų (Rodriguez ir kt.,
2010), o blaCTX-M-1 genas – iš K. cryocrescens blakluC geno (Decousser ir kt.,
2001). CTX-M klasifikacija ir evoliucija pateikta 1.6.1 lentelėje.
1.6.1 lentelė. blaCTX-M genų klasifikacija ir evoliucija (pagal Pfeifer ir kt., 2010).
blaCTX-M genų
grupė Spėjamas šaltinis ir genas pirmtakas Enterobacteriaceae bakterijose blaCTX-M genų pavyzdžiai
CTX-M-1 Kluyvera ascorbata kluA1-11 genai →CTX-M-1 →CTX-M-3 →CTX-M-15a →CTX-M-23a →CTX-M-28a →CTX-M-32a →CTX-M-54a →CTX-M-58a CTX-M-2 Kluyvera ascorbata kluA1-11 genai →CTX-M-2 →CTX-M-35a →CTX-M-42a CTX-M-8 Kluyvera georgiana kluG1 genas →CTX-M-8 →CTX-M-40 →CTX-M-63 CTX-M-9 Kluyvera georgiana kluG1 genas →CTX-M-14 →CTX-M-16a →CTX-M-19a →CTX-M-27a CTX-M-25 Kluyvera georgiana kluG1 genas →CTX-M-25 →CTX-M-26 →CTX-M-41
agenai, koduojantys CTX-M β-laktamazes, hidrolizuojančias ceftazidimą; → žymi genų evoliuciją.
blaCTX-M genų evoliuciją ir įvairovę skatina nuolat vykstanti
rekombi-nacija. Taip „atsirado“ CTX-M-64 ir CTX-M-137 β-laktamazės (CTX-M-14 ir CTX-M-15 β-laktamazės hibridai) ir CTX-M-123β-laktamazė (CTX-M-1 ir CTX-M-9 β-laktamazės hibridas) (Nagano ir kt., 2009; Tian ir kt., 2014; Zhao ir Hu, 2013). Vis dažniau išskiriami mikroorganizmai, kurie vienu metu gali sintetinti du ar net daugiau fermentų, pvz.: CTX-M β-laktamazes ir karbapenemazes, serino ir metalo-β-laktamazes (Bush ir Fisher, 2011). Morosini bei Sun su savo kolegomis mokslininkais identifikavo padermes, kurios turėjo kelių M β-laktamazių derinius (M-14 kartu su
M-15; CTX-M-55, CTX-M-64 kartu su CTX-M-14) (Morosini ir kt., 2010; Sun ir kt., 2010). Kelių skirtingų CTX-M fermentų deriniai yra gan įprastas genetinis reiškinys, tad greitu laiku gali būti atrasta ir daugiau kitų rekom-binacijos genų (Canton ir kt., 2012).
Dėl įvairių β-laktaminių antibiotikų vartojimo nustatomi nauji atsparumo ir dauginio atsparumo mechanizmai bei aktyvesni CTX-M variantai (Canton ir kt., 2012). Pirmieji CTX-M fermentai buvo atsparūs cefotaksimui, o šiuo metu daugiau nei 60 proc. CTX-M fermentų hidrolizuoja ne tik cefotaksimą ir/ar ceftazidimą, bet ir cefepimą. Įdomu, kad klinikinė padermė, kuri gamina naują CTX-M fermentą (nuo fermento pirmtako gali skirtis tik viena amino rūgštimi (L169Q), ne taip aktyviai hidrolizuoja cefatoksimą, bet yra gerokai aktyvesnė prieš ceftazidimą (Djamdjian ir kt., 2011). Taigi ceftazi-dimas gali būti viena priežasčių, lėmusių CTX-M β-laktamazių įvairovę (Canton ir kt., 2012).
1.7. blaCTX-M genų aplinka. ISEcp1 seka
blaCTX-M genai tarp bakterijų lengviau plinta dėl trijų pagrindinių
bakterijų atsparumo blaCTX-M genų perdavimo mechanizmų: (a) atsparumo
antibiotikams genų perdavimo įvairiems mobiliesiems genetiniams elemen-tams; (b) tam tikrų plazmidžių ir/arba skirtingų transpozonų paplitimo tarp skirtingų padermių; (c) bakterijų padermių, įgijusių atsparumo antibioti-kams, klonų plitimo (Pfeifer ir kt., 2010) (1.7.1 pav.).
Nustatyta, kad įterptinės sekos ISEcp1, ISCR1 ir su fagu susiję elementai dalyvauja pernešant blaCTX-M genus, koduojančius β-laktamazes. Įterptinės
sekos perneša atsparumo antibiotikams, baltymų, dalyvaujančių degrada-cijos ir kataboliniuose procesuose, koduojančius genus (Rossolini ir kt., 2008; Wang ir kt., 2013).
ISEcp1 įterptinė seka sudaryta iš dviejų – nepilnųjų (angl. imperfect) ir atvirkštinių (angl. inverted) kartotinių sekų bei atvirojo skaitymo rėmelio (angl. open reading frame), kuris koduoja transpozazę (420 a. r.). ISEcp1 sekos ir į ISEcp1 panašios sekos dažniausiai būna išsidėsčiusios 5’ gale prieš blaCTX-M geną, į jas gali įsiterpti mobiliosios sekos, pvz.: IS26, IS1
arba IS10 (Tian ir kt., 2011) (1.7.2 pav.). Įterptines sekas ISEcp1 galima sieti su trijų blaCTX-M-14, blaCTX-M-15 ir blaCTX-M-9 genų, bet ne blaCTX-M-2
grupės genų pernaša (Smet ir kt., 2012) (1.7.2 pav.). Vienintelė ISEcp1 sekos kopija gali mobilizuoti Kluyvera spp. chromosomos blaCTX-M geną
(Lartigue ir kt., 2006). Nustatyta, kad ISEcp1 Pout promotorius sustiprina blaCTX-M-14/18, blaCTX-M-17, blaCTX-M-19, blaCTX-M-22, blaCTX-M-24, blaCTX-M-55 ir
blaCTX-M-79 genų ekspresiją (Poirel ir kt., 2003; Wang ir kt., 2013; Tian ir kt.,
2011).
1.7.1 pav. blaCTX-M genai dalyvauja mobilizacijoje, ekspresijoje,
jie pernešami plazmidžių ir klonų (Canton ir kt., 2012).
Genetinis atstumas tarp įterptinės sekos ir blaCTX-M geno, siejamas su
minimalia slopinamąją antibiotiko koncentracija, tačiau, kaip sekos ilgis veikia β-laktamazes koduojančių genų ekspresiją, kol kas nėra nustatyta (Ma ir kt., 2011).
1.7.2 pav. blaCTX-M genų aplinkos schema (pagal Tacao ir kt., 2012).
1.8. blaCTX-M genų pernaša plazmidėmis.
Plazmidžių nesuderinamumo grupės
Gramneigiamų klinikinių bakterijų atsparumas antibiotikams glaudžiai siejamas su DNR apsikeitimu tarp bakterijų ir jų viduje. Plazmidės – pagrin-dinis mechanizmas, per kurį bakterijos ex novo gali įgyti atsparumo antibiotikams genus (Carattoli, 2008).
Plazmidės – tai žiedinės DNR, kurios gali savarankiškai replikuotis, kontroliuoti savo kopijų skaičių ir garantuoti paveldimumą, kai ląstelė da-lijasi. Be to, jos koduoja detoksikacijos, virulentiškumo, atsparumo antibio-tikams bei sunkiesiems metalams genus (Carattoli, 2009). Konjugacijos metu kliniškai svarbios bakterijos plazmidėmis perneša atsparumo antibiotikams ir virulentiškumo genus (Barlow, 2009).
Dažniausiai blaCTX-M genai identifikuojami plazmidėse, kurių dydis
svy-ruoja nuo 7 iki 430 kb (Naseer ir Sundsfjord, 2011). Šios plazmidės vadina-mos epidemiologinėmis atsparumo plazmidėmis (angl. epidemic resistance plasmids). Jose taip pat koduojami atsparumą chinolonams, aminogliko-zidams, makrolidams, tetraciklinams, sulfonamidams, trimetoprimui ir chloramfenikoliui lemiantys genai (Smet ir kt., 2010a; Carattoli, 2011).
Atsparumo plazmidės yra viena iš CTX-M fermentus gaminančių bakterijų sukeliamų infekcijų priežasčių (Paterson ir kt., 2005).
Enterobacteriaceae bakterijų plazmidžių klasifikacija yra paremta plazmidžių nesuderinamumo (angl. incompatibility (Inc) grupių nustatytumu. Plazmidžių nesuderinamumas apibrėžiamas kaip dviejų plazmidžių negebėjimas egzistuoti toje pačioje padermėje (Novick, 1987). Transformacijos ar konjugacijos metu „nežinomo“ nesuderinamumo grupės plazmidė pernešama į bakteriją su žinoma nesuderinamumo grupės plazmide. Jei plazmidė iš bakterijos recipientės yra pašalinama, bakterijos donorės plazmidė priskiriama pašalintos plazmidės nesuderinanumo grupei (Datta ir Hedges, 1971).
Enterobacteriaceae šeimos bakterijų plazmidės priskiriamos mažiausiai 29 plazmidžių nesuderinamumo Inc grupėms: IncFI, IncFII, IncFIII, IncFIV, IncFV, IncFVI, IncI1, IncI2, IncIY, IncHI1, IncHI2, IncHI3, IncA/C, IncB, IncD, IncJ, IncK, IncL/M, IncN, IncO, IncP, IncS, IncT, IncU, IncV, IncW, IncX, IncY ir com9 (Novick, 1987). Šiuo metu dažniausiai taikomas Enterobacteriaceae plazmidžių inc/rep PGR metodas, nustatomi 18 dažniausi plazmidžių replikonų tipai: FIA, FIB, FIC, HI1, HI2, I1-Iγ, L/M, N, P, W, T, A/C, K, B/O, X, Y, F ir FIIA (Carattoli ir kt., 2005). Replikonas – tai minimali plazmidės dalis, galinti savarankiškai replikuotis. Jį sudaro ori seka, bei genai, koduojantys replikacijos iniciacijos baltymus (Rep) (Carattoli, 2011).
Žinoma, kad IncFI, IncFII, IncHI2, IncI1, IncN, IncP, IncL/M, IncK ir IncA/C nesuderinamumo grupių plazmidės dalyvauja pernešant atsparumo antibiotikams genus (Falagas ir Karageorgopoulos, 2009; Pitout, 2010; Carattoli, 2009). IncFII plazmidės – mažakopijinės plazmidės, randamos siaurame „šeimininkų“ rate. Tyrimai parodė, kad IncFII plazmidės tarp Enterobacteriaceae šeimos bakterijų plačiai buvo paplitusios dar prieš „antibiotikų erą“ (Canton ir kt., 2012). Šios plazmidės paprastai turi daugiau nei vieną replikoną (Naseer ir Sundsfjord, 2011), dažniausiai yra susijusios su blaCTX-M-15 genu, kuris plazmidėje gali būti koduojamas kartu su blaTEM-1,
blaOXA-1 ir acc(6‘)-lb-cr genais. FII plazmidžių grupė yra heterogeniška, ir
tai galėjo lemti blaCTX-M-15 geno paplitimą visame pasaulyje (Carattoli,
2009).
Rečiau identifikuojamos IncN ir IncI1 plazmidės dažniausiai koduoja kitą CTX-M-1grupės geną – blaCTX-M-1 geną, IncI1 ir IncL/M plazmidės –
blaCTX-M-3 geną (Carattoli, 2009; Zhao ir Hu, 2013). Anksčiau minėtos
plazmidžių grupės nustatytos Kroatijoje, Bulgarijoje, Rusijoje, Korėjoje, Prancūzijoje bei Lenkijoje (Marcade ir kt., 2009; Carattoli, 2009; Markovska ir kt., 2013). Chmielarczyk ir kiti mokslininkai neseniai nustatė, kad blaCTX-M-3 geną gali pernešti ir IncFIB, IncHI2, IncHI1 bei B/O
plazmidžių nesuderinamumo grupėms priklausančios plazmidės (Chmielarc-zyk ir kt., 2013).
blaCTX-M-14 geno paplitimas susijęs su IncF, IncK, IncHI2 ir IncI1 grupių
plazmidėmis. Ryšys tarp IncK plazmidžių ir blaCTX-M-14 geno buvo
nustaty-tas klinikinėse E. coli padermėse, išskirtose Ispanijoje ir Prancūzijoje (Dies-tra ir kt., 2009; Valverde ir kt., 2009).
Dažniausiai E. coli identifikuojami atsparumo plazmidžių replikonai, tiriamoji medžiaga ir šalys, kuriose identifikuotos plazmidės pateikta 1.8.1 lentelėje.
1.8.1 lentelė. E. coli bakterijose nustatyti atsparumo plazmidžių replikonų
tipai ir atsparumo genai, kuriuos perneša plazmidės (Carattoli, 2009).
CTX-M
β-laktamazė replikono tipas Plazmidžių identifikuotos plazmidės Šalys, kuriose Tiriamoji medžiaga
CTX-M-1 N Danija, Prancūzija, Ispanija klinikinė, kiaulės I1 Prancūzija, Italija klinikinė, naminiai
gyvūnai, šunys
L/M Ispanija klinikinė
CTX-M-2 A/C Bolivija, Prancūzija, Peru,
Didžioji Britanija klinikinė
HI2 Prancūzija, Belgija klinikinė, naminiai gyvūnai
P Prancūzija, Airija klinikinė
I1 Prancūzija klinikinė
FVII Bolivija, Peru klinikinė
CTX-M-3 L/M Bulgarija klinikinė
N Australija, Ispanija, Didžioji
Britanija klinikinė
A/C Ispanija klinikinė
FII Australija, Kroatija klinikinė CTX-M-9 HI2 Prancūzija, Hondūras,
Pakistanas, Ispanija, Didžioji Britanija
klinikinė, naminiai gyvūnai
1.8.1 lentelės tęsinys
CTX-M
β-laktamazė replikono tipas Plazmidžių identifikuotos plazmidės Šalys, kuriose Tiriamoji medžiaga
CTX-M-10 P Ispanija klinikinė
FII, FIB Australija, Prancūzija,
Ispanija klinikinė
I1 Ispanija klinikinė
Y Ispanija klinikinė
B/O Ispanija klinikinė
K Ispanija klinikinė
K Ispanija klinikinė
CTX-M-14 K Australija, Prancūzija,
Ispanija, Didžioji Britanija galvijai, klinikinė FII, FIB Australija, Prancūzija klinikinė
I1 Australija, Prancūzija, Bolivija, Peru, Ispanija, Didžioji Britanija
klinikinė
HI2 Ispanija klinikinė
B Australija klinikinė
A/C Prancūzija klinikinė
CTX-M-15 FII, FIA, FIB Australija, Bolivija, Kanada, Centrinės Afrikos
Respublika, Kroatija, Čekija, Prancūzija, Kuveitas, Indija, Italija, Portugalija, Ispanija, Šveicarija, Tunisas, Turkija, Peru, Didžioji Britanija
klinikinė
I1 Australija, Prancūzija,
Didžioji Britanija klinikinė
A/C Prancūzija klinikinė
L/M Prancūzija klinikinė
N Prancūzija klinikinė
CTX-M-24 FII Australija klinikinė
I1 Bolivija, Peru klinikinė
CTX-M-25 FII Australija klinikinė
CTX-M-32 N Ispanija klinikinė
CTX-M-40 N Didžioji Britanija klinikinė
CTX-M-42 L/M Rusija klinikinė
CTX-M-56 A/C Bolivija, Peru klinikinė
1.9. E. coli padermių filogenetinės grupės
Klinikinės E. coli padermės gali būti suskirstytos į keturias pagrindines grupes (A, B1, B2 ir D) bei septynis pogrupius (A0, A1, B1, B22, B23, D1 ir
D2). Tyrimai parodė, kad šių filogenetinių grupių padermės skiriasi savo
virulentiškumo faktoriais, genomo dydžiu, jos priklauso skirtingoms ekolo-ginėms nišoms (Tenaillon ir kt., 2010). Padermės, priklausančios B2 ir D filogenetinėms grupėms, yra virulentiškos, ir dažnai sukelia šlapimo takų bei kitas ne žarnyno infekcijas (Ferjani ir kt., 2012). Remiantis Tenaillon ir kitų mokslininkų tyrimų rezultatais, galima teigti, kad B2 filogenetinė grupė yra visų E. coli filogenetinių grupių pirmtakas (Tenaillon ir kt., 2010). A ir B1 filogenetių grupių padermės – komensalai, kurie gali būti atsparesni nei B2 ir D filogenetinėms grupėms priklausančios padermės (Ho ir kt., 2009).
E. coli padermių filogenetinių grupių nustatymui, Clermont ir bendraautoriai sukūrė sudėtinį polimerazės grandininės reakcijos (PGR) metodą. PGR naudojami trys DNR žymenys: chuA, yjaA genai ir DNR fragmentas TspE4.C2 (Clermont ir kt., 2000) (1.9.1 pav.).
1.9.1 pav. Sudėtinis PGR metodas, naudojamas
E. coli filogenetinėms grupėms nustatyti
Filogenetinei grupei A priskiriamos padermės, kuriose nebuvo nustatytas joks genas (yjaA-, chuA-, TspE4.C2-), B1 – chuA-, TspE4.C2+, B2 – chuA+, yjaA+, D – chuA+, yjaA- (Cler-mont ir kt., 2000).
2010 m. atlikus tyrimą (Lee ir kt., 2010) pastebėta, kad padermės, išskir-tos iš kraujo ar šlapimo, dažniausiai buvo priskirišskir-tos B2 filogenetinei grupei,
ir tik apie 20 proc. E. coli padermių, išskirtų iš išmatų – B2 filogenetinei grupei (Lee ir kt., 2010). Brisse ir bendraautoriai, CTX-M β-laktamazes gaminančias klinikines E. coli padermes suskirstė į filogenetines grupes ir nustatytė, kad daugiausia šių padermių priklausė B2 filogenetinei grupei, o A, D ir B1 filogenetinėms grupėms priskirtos padermės sudarė mažesnę tiriamųjų padermių dalį (Brisse ir kt., 2012).
1.10. E. coli padermių didelės rizikos klonai
E. coli padermių genotipavimas parodė, kad „E. coli klonams“ priski-riamos padermės turi vienodas genotipines charakteristikas. Ištyrus pader-mes daugiažidininiu sekų nustatymo metodu (angl. multilocus sequence typing (MLST), nustatyta, kad tam tikri sekų tipai (ST) arba klonai yra glaudžiai susiję su blaCTX-M genų plitimu bei tiesiogiai dalyvauja pernešant
blaCTX-M genus (Riley, 2014). Dominuojantys ST38, ST69, ST131, ST393 ir
ST405 klonai vadinami didelės rizikos klonais (angl. high risk clone) (Canton ir Ruiz-Garbajosa, 2011; Woodford ir kt., 2011; Van der Bij ir Pitout, 2012; Dhanji ir kt., 2011a).
Retrospektyvinė analizė parodė, kad padermės, priklausančios ST131 klonui, pandeminėmis padermėmis tapo ne anksčiau nei prieš 10 metų. Tačiau šiuo metu jos apibūdinamos kaip viena pagrindinių visuomenėje įgyjamų šlapimo takų infekcijos priežasčių visame pasaulyje (Rogers ir kt., 2011; Assimacopoulos ir kt., 2012). 2012 m. Brisse ir bendraautoriai atliko klinikinių E. coli padermių populiacijos tyrimus ir nustatė, kad ST131 klonui priklausė net 64 proc. padermių, iš kurių net 54 proc. gamino ESBL, o likusios 10 proc. – negamino (Brisse ir kt., 2012).
Manoma, kad ST131 klonas yra E. coli klonų klasterio „protėvisˮ. Jis priskiriamas O25:H4 serogrupei, B2 filogenetinei grupei, glaudžiai siejamas su CTX-M-15 β-laktamaze, bei dažnai gamina OXA-1, TEM-1 β-laktama-zes bei aminoglikozidus modifikuojantį fermentą (Peirano ir Pitout, 2010; Assimacopoulos ir kt., 2012; Nicolas-Chanoine ir kt., 2008; Peirano ir kt., 2010).
Nors dažniausiai ST131 klonui priskiriamos E. coli padermės gamina CTX-M-15 β-laktamazę (Coque ir kt., 2008; Johnson ir kt., 2012; Novais ir kt., 2013), skirtingų populiacijų tyrimuose nustatyta, kad ST131 klonas gali būti susijęs ir su kitomis CTX-M β-laktamazėmis, t. y. 9, CTX-M-14, CTX-M-2, CTX-M-35, bei CMY ir KPC β-laktamazėmis (Cao ir kt., 2011; Suzuki ir kt., 2009; Doi ir kt., 2013). Svarbu paminėti, kad ST131 klonui priskiriamos padermės, genų pernešai naudoja IncFII
rinamumo grupės plazmides, turinčias papildomų FIA/FIB, FIAFIB/FII ir FIB/FII replikonų (Naseer ir Sundsfjord, 2011).
Kiti didelės rizikos klonai, ST38, ST69, ST393 ir ST405 klonai, taip pat yra siejami su blaCTX-M genų plitimu (Blanco ir kt., 2011). E. coli padermės,
priklausančios ST38 ir ST393 klonams, dažnai koduoja blaCTX-M-9 ir bla CTX-M-14 genus, o ST405 klonas – blaCTX-M-15 genus (Poirel ir kt., 2011; Ho ir kt.,
2012).
Iki šiol tyrimus atlikusiems mokslininkams dar nepavyko iki galo atskleisti veiksnių, kurie įtakoja CTX-M β-laktamazes gaminančių E. coli padermių atsparumą. Tad šiame darbe buvo atlikti eksperimentiniai tyrimai, kuriais remiantis galima geriau būtų įvertinti ryšį tarp blaCTX-M genų ir
filogenetinių grupių, infekcijos šaltinių ir atsparumo antibiotikams.
2. METODIKA
2.1. Bioetikos komiteto ir asmens duomenų apsaugos inspekcijos leidimas atlikti biomedicininį tyrimą
Tyrimai atlikti Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos fakul-teto Mikrobiologijos katedroje (nuo 2013 m. Mikrobiologijos ir virusologi-jos institutas), Kardiologivirusologi-jos instituto Molekulinės kardiologivirusologi-jos laboratori-joje bei LSMUL Kauno klinikų Laboratorinės medicinos klinikoje.
Leidimai tyrimams „Gramneigiamųjų bakterijų atsparumo antimikrobi-nėms medžiagoms epidemiologinė ir genetinė analizė“ atlikti gauti iš Kauno regioninio biomedicininių tyrimų bioetikos komiteto (2009 m. birželio 30 d., leidimas BE-2-10) ir Valstybinės duomenų apsaugos inspekcijos (2010 m. sausio 10 d. Nr. 2R-170).
2.2. Tiriamųjų E. coli padermių atranka ir tyrimo planas
2008–2012 metais E. coli padermės išskirtos Lietuvos sveikatos mokslų universiteto ligoninės Kauno klinikos (LSMUL KK), Respublikinės Panevė-žio ligoninės (RPL), Respublikinės Šiaulių ligoninės (RŠL), Marijampolės ligoninės (ML) ir Alytaus apskrities S. Kudirkos ligoninės (AAKL) Mikro-biologijos laboratorijose. Pagal atrankos kriterijų – atsparumą trečios kartos cefalosporinams, tolesniems tyrimams diskų metodu (ceftazidimui (30µg) ir/ar cefotaksimui (30 µg)), atrinktos 158 E. coli padermės (2.2.1 lentelė). Tiriamosios padermės išskirtos iš 5 skirtingų infekcijos vietų/ėminių: šla-pimo takų (šlapimas), apatinių kvėpavimo takų (skrepliai, bronchų išplovos, bronchų nuobrūžos, trachėjos aspiratas, bronchoalveolinis lavažo skystis), žaizdų (pūliai, žaizdos sekretas), sterilių organizmo skysčių (kraujas, tulžis, smegenų skystis, pleuros skystis) ir kitų organizmo skysčių (pilvaplėvės ertmės skystis, ascitas, įtariama infekcijos vieta) (2.2.1 lentelė).
2.2.1lentelė. E.coli padermių (n=158) pasiskirstymas ligoninėse ir infekci-jos vietose/ėminiuose
Ligoninė Padermių skaičius n (proc.) vieta/ėminys Infekcijos Padermių skaičius n (proc.)
LSMUL KK 115 (72,8) ŠT 58 (36,7)
RPL 32 (20,3) AKT 36 (22,7)
RŠL 7 (4,4) žaizdos 32 (20,3)
ML 3 (1,9) SOS 14 (8,9)
AAKL 1 (0,6) KOS 18 (11,4)
LSMUL KK – Lietuvos sveikatos mokslų universiteto ligoninė Kauno klinikos, RPL – Res-publikinė Panevėžio ligoninė, RŠL – ResRes-publikinė Šiaulių ligoninė, ML – Marijampolės ligoninė, AAKL – Alytaus apskrities S. Kudirkos ligoninė, ŠT – šlapimo takai, AKT – apatiniai kvėpavimo takai, SOS – sterilūs organizmo skysčiai, KOS – kiti organizmo skysčiai.
Minimali tiriamųjų imtis (n), reikalinga logistinės regresijos modeliams taikyti, apskaičiuota pagal formulę (Hsieh ir kt., 1998):
, čia: 1-β – tyrimo galia;
z1-α/2 – Gauso skirstinio (1–α/2) eilės kvantilis (kai α=0,05, tai z1-α/2=1,96);
z1-β – Gauso skirstinio (1-β) eilės kvantilis (kai β =0,20, tai z1-β =0,84);
P – bendras įvykio dažnis, apskaičiuotas pagal formulę P= (1-B)P1 + BP2;
B – įvykio dalis/proporcija (kai X=1, B=0,5); P1, P2 – atskirų įvykių dažnis (P1=0,5, P2=0,2).
Pasirinkus reikšmingumo lygmenį 0,05 ir galingumą 80 proc., apskaičiuota minimali tiriamoji imtis - 77 E. coli padermės. Mes ištyrėme 158 E. coli padermes.
Tyrimo planas pavaizduotas 2.2.1 pav.
2.2.1pav. Tyrimo planas
2.3. Mikrobiologinių tyrimų metodika 2.3.1. E. coli padermių identifikavimas
E.coli padermės atrinktos identifikuojant standartinius mikrobiologinius metodus. E.coli identifikuota įvertinus jų biocheminį (fermentinį) aktyvumą specialiose terpėse. 1–2 kolonijos, kurios augo McConkey terpėje, sterilia kilpele perkeliamos į mėgintuvėlius su terpėmis, sudarančiomis „margąją eilutę“ (Farmer irkt., 2007).
E.coli padermės atrinktos biocheminiu būdu, patvirtintos naudojant API 20E rinkinį (bioMerieux, Marcy l’Etoile, Prancūzija) bei 16S rRNR geno amplifikaciją (Molbak irkt., 2006).
Išskirtos padermės tyrimo metu buvo saugomos triptozės sojos buljone su 15 proc. glicerolio (–70°C temperatūroje).
2.3.2. Pirminis jautrumo antibiotikams nustatymas
E.coli padermių atsparumas TKC, nustatytas Kirby Bauer diskų metodu Muller-Hinton agare (Becton, Dickinson, JAV) bei naudojant standartinę vertinimo metodiką (Clinical Laboratory Standards Institute, CLSI, 2008). Trys–penkios E.coli kolonijos sterilia kilpele nuo kraujo agaro perkeliamos į mėgintuvėlį, kuriame yra sterilus fiziologinis tirpalas. 0,5 MacFarland drumstumo bakterinė suspensija (1–2×108 KSV/ml) steriliu vatos
tampo-nėliu pasėjama į sterilų Muller-Hinton agarą (Becton, Dickinson, JAV). Vatos tamponėliu braukiama per agaro paviršių, procedūra kartojama kelis kartus. Petri lėkštelė sukama 60° kampu, kad suspensija tolygiai pasiskirs-tytų lėkštelėje. Antibiotikų cefotaksimo ir ceftazidimo diskeliai, (Becton, Dickinson, JAV), steriliu pincetu prispaudžiami prie Muller-Hinton agaro paviršiaus, ant kurio užsėta bakterinė suspensija. Paruoštos Petri lėkštelės inkubuojamos 18–24 val. +35°C temperatūroje. E.coli padermių augimas apie antibiotiko diskelį, pagal CLSI rekomendacijas, vertinamas nustatant slopinamosios ribos diametrą (CLSI, 2008) (2.3.2.1lentelė). Antibiotikų jautrumo kontrolei naudota CLSI referentinė E.coli ATCC 25922 padermė.
2.3.2.1lentelė. E.coli padermių atsparumas nustatytas pagal patvirtintas atsparumo antibiotikams ribas pagal CLSI standartą (M2–A9, 2A lentelė, CLSI, 2008).
Antibiotikas Koncentracija Ribos diametras, mm
atsparu vidut. jautru jautru
Cefotaksimas 30 µg ≤14 15–22 ≥23
Ceftazidimas 30 µg ≤14 15–17 ≥18
2.3.3. Minimalios slopinamosios koncentracijos nustatymas
Minimali vaisto slopinamoji koncentracija (MSK) vertinta taip: kai auga 50 proc. bakterijų – MSK50, kai žūsta 99,9 proc. bakterijų – MSK90.
Siekiant nustatyti minimalią antibiotikų (ceftriaksono, ceftazidimo, cefo-taksimo, cefepimo, aztreonamo, piperacilino/tazobaktamo, ampicilino/sul-baktamo, tikarcilino/klavulano rūgšties, meropenemo, imipenemo, ertapene-mo, gentamicino, amikacino, tobramicino, ciprofloksacino, gatifloksacino, trimetoprimo/ sulfametoksazolio ir nitrofurantoino) MSK, naudotos buljono minimalaus praskiedimo (angl. microdilution plates) plokštelės (GN1F,
GN3F, Sensititre; TREK Diagnostic Systems, JAV), atsižvelgiant į gamin-tojo rekomendacijas.
Trys–penkios vienos paros E.coli kolonijos nuo kraujo agaro sterilia kil-pele perkeliamos į mėgintuvėlį, kuriame yra 9 ml steriliaus vandens. 10 µl 0,5 MacFarland drumstumo suspensijos steriliu antgaliu perkeliama į mė-gintuvėlį su Muller-Hinton buljonu. Mėgintuvėlis 8–10 kartų pavartomas, 50 µl suspensijos perkeliama į plokštelės šulinėlius, prisotintus skirtingų koncentracijų antibiotikų. Buljono mikropraskiedimo plokštelės inkubuoja-mos +35°C temperatūroje. Po 18–24 val. inkubacijos vertinainkubuoja-mos mikroorga-nizmų augimą slopinančios koncentracijos. MSK dydžiai buvo vertinami, remiantis CLSI standartu(CLSI, 2008) (2.3.3.1lentelė).
2.3.3.1lentelė. E.coli padermių MSK atsparumo antibiotikams ribos pagal CLSI standartą (M7–A7, 2A lentelė, CLSI, 2008) (CLSI, 2008).
Antibiotikas MSK (µg/ml)
jautru vidut. jautru atsparu
Ceftriaksonas ≤8 16-32 ≥64 Ceftazidimas ≤8 16 ≥32 Cefotaksimas ≤8 16-32 ≥64 Cefepimas ≤8 16 ≥32 Aztreonamas ≤8 16 ≥32 Piperacilinas/tazobaktamas ≤16/4 32/4–64/4 ≥128/4 Ampicilinas/sulbaktamas ≤8/4 16/8 ≥32/16 Tikarcilino/klavulano rūgštis ≤16/2 32/2–64/2 ≥128/2 Meropenemas ≤4 8 ≥16 Imipenemas ≤4 8 ≥16 Ertapenemas ≤2 4 ≥8 Gentamicinas ≤4 8 ≥16 Amikacinas ≤16 32 ≥64 Tobramicinas ≤4 8 ≥16 Ciprofloksacinas ≤1 2 ≥4 Gatifloksacinas ≤2 4 ≥8 Trimetoprimas/sulfametoksazolis ≤2/38 – ≥4/76 Nitrofurantoinas ≤32 64 ≥128 40
