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Sardegna FESR 2014/2020 - ASSE PRIORITARIO I
“RICERCA SCIENTIFICA, SVILUPPO TECNOLOGICO E INNOVAZIONE”
Azione 1.1.4 Sostegno alle attività collaborative di R&S per lo sviluppo di nuove tecnologie sostenibili, di nuovi prodotti e servizi
Progetto COMISAR “COltivazione di ceppi MIcroalgali SARdi per applicazioni innovative nei settori agro- alimentare, nutraceutico, cosmetico e ambientale”
Relazione a cura di: Alessandro Concas e Giacomo Fais
Organismo di Ricerca: Centro di Ingegneria e Scienze Ambientali (CINSA) e Centro di Ricerca Sviluppo e Studi Superiori in Sardegna (CRS4)
Progetto Cluster Top Down: COltivazione di ceppi MIcroalgali SARdi per applicazioni innovative nei settori agro-alimentare, nutraceutico, cosmetico e
ambientale (COMISAR)
Rapporto tecnico sul WP-2
Individuazione, caratterizzazione e sperimentazione di ceppi
microalgali isolati in Sardegna
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WP-2. Individuazione, caratterizzazione e sperimentazione di ceppi microalgali isolati in Sardegna
L’obiettivo realizzativo due era finalizzato ad individuare, campionare, isolare e caratterizzare in maniera preliminare i ceppi algali sardi che sarebbero stati oggetto di ulteriore investigazione nei successivi obiettivi realizzativi. La caratterizzazione metabolica dei ceppi ha poi consentito di individuare le classi di composti ad alto valore aggiunto più convenientemente valorizzabili che potevano essere estratti dai ceppi prescelti. A seguito di questa attività sono state svolte attività di ricerca bibliografica volte a individuare quali erano i pathway metabolici principali coinvolti nella biosintesi dei composti estraibili dalle alghe (lipidi e acidi grassi in genere) nonché capire quali fossero i margini di ottimizzazione di questi ceppi mediante tecniche di ingegneria genetica. In ottemperanza a quanto riportato nel capitolato tecnico del progetto, l’obiettivo realizzativo è stato pertanto articolato secondo lo schema a blocchi in Figura 1.
Figura 1. Schema a blocchi dell’articolazione dell’obiettivo realizzativo WP-2
Le parti successive del documento sono pertanto dedicate alla descrizione sintetica dei principali risultati ottenuti nell’ambito dei sotto-obiettivi schematizzati in Figura.
Individuazione, caratterizzazione e sperimentazione di ceppi microalgali isolati in Sardegna.
WP-2.1.
Individuazione di ceppi algali adatti
e/o adattati alla coltivazione in
Sardegna da utilizzare nel
processo produttivo.
WP-2.2.
Caratterizzazione, anche genetica e
metabolica, dei ceppi sardi in relazione alla loro
capacità di produrre composti
ad alto valore aggiunto e di essere utilizzati in
contesto agro- industriale
efficiente.
WP.2.3 Definizione preliminare dei pathway metabolici
coinvolti nella produzione di prodotti ad alto valore aggiunto.
WP-2.4.
Individuare le potenzialità di ottimizzazione dei ceppi, in relazione
alla loro produttività in composti utili,
attraverso strumenti di
ingegneria metabolica e/o
genetica.
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WP-2.1. Individuazione di ceppi algali adatti e/o adattati alla coltivazione in Sardegna da utilizzare nel processo produttivo.
Sono stati individuati n. 5 ceppi, campionati in diverse località della Sardegna e mantenuti presso la ceppoteca Sardinian Culture Collection of Algae (SCCA), nello specifico:
1. SCCA 024, campionato presso Osini;
2. SCCA 008, campionato presso Molentargius;
3. Picochlorum sp. SCCA 034, campionato presso Seu;
4. Coccomyxa melkonianii SCCA 048, campionato presso Montevecchio;
5. Chlorella sorokiniana SCCA 090, campionato presso Villacidro.
Figura 2. Siti di campionamento dei ceppi selezionati.
In seguito ad una attenta valutazione tecnica il lavoro si è focalizzato principalmente sui ceppi Coccomyxa melkonianii SCCA 048 e Picochlorum sp. 034 perché soddisfavano maggiormente i requisiti di seguito elencati:
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• Robusti, ovvero in grado di resistere a condizioni ambientali non controllate, come quelle di situazioni all’aperto in climi temperati e tropicali;
• Produttivi, ossia in grado di raggiungere densità elevate in breve tempo, con alti contenuti di sostanze desiderate;
• Resistenti ai contaminanti ed in grado di mantenere la monospecificità o una netta prevalenza anche in vasche all’aperto;
• Cosmopoliti o LOCALI, in modo da non causare problematiche in caso di diffusioni / riversamenti in ambienti naturali.
Il primo, C. melkonianii 048, estremofilo e descritto come nuova specie per la scienza, è stato campionato presso il fiume Rio Irvi situato nella parte sud-occidentale della Sardegna (cfr. Figura 3).
Figura 3. Localizzazione geografica e parametri fisico-chimici del sito di campionamento di C.
melkonianii SCCA 048.
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Lungo circa 7 km, scorre nel distretto minerario dell'Arburese (Sardegna sud-occidentale). Questo fiume è caratterizzato da un pH compreso tra 3 e 7 e da un alto contenuto di metalli pesanti (Cd, Co, Fe, Mn e Zn), in particolare ferro, documentato dal colore rosso vivo dell'acqua per gran parte della sua lunghezza. L'alga è stata reperita in un sito di campionamento (N 39.546894, E 8.480278) dove il pH dell'acqua era 6,85. Il campionamento è stato effettuato raschiando materiale ferroso rosso dalle rocce presenti in riva al fiume (Malavasi et. al 2016). Per la capacità di resistere ad un ambiente caratterizzato dai parametri fisico-chimici descritti, questo ceppo è stato associato alla possibilità di essere coltivato in condizioni avverse e poco controllate come quelle degli “open ponds”.
Il secondo ceppo Picochlorum sp. è stato campionato presso la località di Monte Arquerì (Sardegna centro-est) in prossimità di una sorgente artificiale a circa 800 m di altitudine, in un ambiente oligotrofico di acqua dolce (Malavasi 2012) e, successivamente ad una attenta analisi bibliografica, si è rivelato un potenziale candidato per valutarne la capacità di produrre prodotti ad elevato valore aggiunto in coltivazioni in fotobioreattori di tipo raceway.
Figura 4. Sito di campionamento di Picochlorum sp. SCCA 034.
Una volta campionati i ceppi sono stati isolati e trasferiti presso la ceppoteca SCCA (Sardinian Culutre Collection of Algae e localizzata al CINSA. Presso i laboratori del CINSA e della Cittadella Universitaria di Monserrato sono state poi effettuate le analisi di caratterizzazione di seguito specificate.
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WP-2.2. Caratterizzazione, anche genetica e metabolica, dei ceppi sardi in relazione alla loro capacità di produrre composti ad elevato valore aggiunto e di essere utilizzati in contesto agro-industriale efficiente.
I ceppi SCCA 034 e SCCA 090 sono stati caratterizzati geneticamente. Sequenziando la subunità 18S dell'rRNA è stato possibile collocare queste microalghe rispettivamente nei generi Picochlorum e Chlorella.
Al fine del soddisfacimento dell’obiettivo realizzativo 2.2., si è proceduto primariamente alla produzione della biomassa microalgale ed è stato scelto di operare in condizioni autotrofiche, utilizzando diversi terreni di coltura: WARIS-H (McFadden e Melkonian, 1986) e il Bold’s Basal Medium (BBM) [Bischoff e Bold 1963].
Per poter acquisire una conoscenza completa sul profilo delle principali classi di metaboliti, i cui risultati dessero informazioni sostanziali e applicabili al comparto dell’agroindustria nonché al settore nutraceutico e cosmetico, si è scelto di investigare primariamente i macronutrienti carboidrati, lipidi, e proteine. Inoltre, è stato valutato il contenuto di clorofilla e le proprietà antiossidanti degli estratti algali. Per verificare la bontà delle metodiche analitiche ed effettuare dei paragoni tra i ceppi candidati e prodotti già presenti sul mercato, si è scelto di condurre le analisi anche su “Chlorella Pulver” (Chlorella vulgaris), acquistata dall’azienda tedesca Algova, e di Spirulina (Arthrospira platensis), gentilmente fornita dall’azienda Livegreen srl., associata a Milis Energy e aderente al progetto Cluster.
In breve, l’estrazione e la determinazione spettrofotometrica dei carboidrati totali è stata condotta seguendo il metodo di DuBois et al. (1956), mentre la determinazione del contenuto dei lipidi totali è stata effettuata mediante l’impiego del metodo Marsh e Weinstein (1966). Quest’ultima è una metodica che sfrutta la carbonizzazione con l’acido solforico e prevede un pretrattamento del campione in cui l’estrazione della fase lipidica viene effettuata secondo il metodo Bligh e Dyer (1956). La determinazione delle proteine totali presenti nei diversi ceppi microalgali è stata condotta secondo il protocollo del test dell’acido bicinconinico (BCA), descritto da Smith et al. (1985). Il metodo in questione sfrutta la capacità delle proteine di ridurre, in ambiente basico, gli ioni rameici a rameosi che reagiscono con il BCA sviluppando una colorazione viola, la cui assorbanza viene determinata mediante tecniche spettrofotometriche.
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Il contenuto dei polifenoli totali è stato effettuato su estratti idroalcolici ottenuti dalle biomasse algali impiegando una miscela etanolo – acqua (70:30, v/v) e utilizzando la metodica analitica di Folin- Ciocalteau (Singleton, V. L.; 1965).
Figura 5. Metodiche utilizzate per lo studio della composizione chimica quali-quantitativa.
Il saggio spettrofotometrico del DPPH è stato effettuato in accordo con il protocollo Brand-Williams et al. (Brand–Williams, 1995), mentre Il saggio spettrofotometrico del FRAP (Benzie, 1996) è stato effettuato sullo stesso estratto impiegato per il test del DPPH.
L’analisi quantitativa della clorofilla-a è stata eseguita applicando tre diverse metodiche spettrofotometriche in maniera tale da avere una valutazione più accurata. Il primo metodo, applicato alla biomassa liofilizzata, seguiva il protocollo proposto da Brito et al. (2009) opportunamente modificato che prevede l’estrazione dei pigmenti con acetone al 90%. Il metodo prevede l’utilizzo dell’equazione di Lorenzen (1967) per il calcolo della concentrazione della clorofilla-a; Il secondo metodo, applicato alla biomassa liofilizzata, è stato eseguito secondo il protocollo sviluppato da Fernandes de Souza et al (2018); Il terzo metodo, applicato alla biomassa fresca, è stato condotto secondo il metodo descritto nella tesi di Larivera 2013 che si rifaceva al lavoro di Ritchie 2006, apportando alcune modifiche.
I risultati ottenuti hanno dimostrato che il contenuto delle proteine totali del campione SCCA 034 risultavano essere in linea con quelli dei prodotti commerciali a differenza di quelli di Chlorella cf.
sorokiniana SCCA 090 e Coccomyxa melkonianii SCCA 048. I ceppi algali SCCA 024 e SCCA 008,
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hanno mostrato invece una percentuale inferiore. Per quanto riguarda i carboidrati totali, invece, il campione SCCA 024 ha riportato una percentuale superiore rispetto a quella presente nella Chlorella Pulver e della Spirulina commercializzata, seguito da Coccomyxa melkonianii SCCA 048 e da Chlorella cf. sorokiniana SCCA 090. Il ceppo SCCA 034, analogamente a quanto osservato per le proteine, presentava un quantitativo di carboidrati totali paragonabile a quello della Chlorella Pulver.
Per quanto riguarda i lipidi totali, il campione SCCA 034 possedeva un contenuto percentuale comparabile con quello della Chlorella Pulver, mentre la Chlorella cf. sorokiniana SCCA 090 era caratterizzata da una più bassa percentuale di lipidi totali ma in linea con quella della Spirulina.
Oltre ai macronutrienti appena descritti, sugli stessi campioni sono stati determinati i principali composti bioattivi, quali i polifenoli totali e la clorofilla-a. Il tenore dei polifenoli totali ha mostrato delle significative differenze tra i campioni analizzati. Infatti, l’unico ceppo algale che presentava un quantitativo di polifenoli simile a quello dei campioni commerciali è stato SCCA 034. Tutti gli altri, presentavano un basso tenore di polifenoli totali.
Si è infine valutata l’attività antiossidante e antiradicalica mediante l’impiego dei più comuni test in vitro, il test del FRAP e il test del DPPH. Tutti i campioni analizzati mostravano un’elevata capacità antiradicalica ad eccezione dei campioni SCCA 024 e SCCA 008, mentre la Chlorella cf. sorokiniana SCCA 090 è risultata il ceppo con una maggiore attività antiossidante. I risultati ottenuti non hanno mostrato una correlazione diretta tra l’attività antiossidante, antiradicalica e il tenore dei polifenoli totali suggerendo che in questi ceppi microalgali potrebbero essere presenti altri principi attivi che contribuiscono all’attività antiossidante.
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Figura 6. Tecniche per la valutazione dell’attività antiossidante.
Inoltre, per meglio caratterizzare il profilo metabolico dei ceppi sardi selezionati sono state portate avanti indagini sul profilo molecolare degli estratti polari. Nello specifico è stato condotto uno screening metabolomico di Coccomyxa melkonianii SCCA 048 e di Picochlorum sp. SCCA 034. I campioni sono stati estratti con una estrazione solido/liquido con solventi polari ed essiccati sotto flusso di azoto. Gli estratti secchi sono stati derivatizzati e successivamente è stata eseguita l’analisi GC-MS. Per l'analisi della frazione polare è stato utilizzato un gascromatografo accoppiato a spettrometro di massa (GC-MS). L’analisi è stata eseguita in triplicato su una coltura di Picochlorum sp. SCCA 034 e su una coltura di C. melkonianii SCCA 048 in BBM standard durante le diverse fasi di crescita. I campioni sono stati estratti ed essiccati sotto flusso di azoto. Successivamente, i campioni sono stati derivatizzati e iniettati in un gascromatografo Hewlett Packard 6850, con rilevatore selettivo di massa 5973 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA), utilizzando elio come gas di trasporto a un flusso di 1,0 mL / min. Un μL di ciascun campione è stato iniettato in modalità split- less e risolto su una colonna DB-5MS di 30 m × 0,25 mm × 0,25 μm (Agilent Technologies, Palo Alto, CA). Le temperature di ingresso, interfaccia e sorgente ionica erano rispettivamente 250, 250 e 230 ° C. La temperatura iniziale del forno è stata impostata a 50 ° C, la temperatura finale a 230 °
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C con una velocità di riscaldamento di 5 ° C / min per 36 min e poi per 2 min a temperatura costante.
Gli spettri di massa sono stati registrati da m/z 50 a 550 a 70 eV.
Successivamente, cromatogrammi e spettri di massa associati sono stati acquisiti in formato .AIA e dunque caricati sulla piattaforma XCMS Online (Tautenhahn, Patti, Rinehart e Siuzdak, 2012). Gli output di XCMS consistevano in un elenco di caratteristiche corrispondenti al valore di intensità di ogni ione m/z a uno specifico valore del tempo di ritenzione. L'identificazione dei metaboliti è stata eseguita mediante confronto tra spettri di massa e standard analitici, utilizzando il database della libreria NIST14 del National Institute of Standards and Technology (Gaithersburg, MD) e la libreria Golm (http: //gmd.mpimp-golm.mpg.de /) unitamente ad una libreria interna di metaboliti.
I dati GC-MS sono stati inoltre acquisiti dal software SIMCA-P + (versione 14.1, Umetrics, Umeå, Svezia). L'analisi delle componenti principali (PCA) è stata eseguita per studiare le distribuzioni del campione, le caratteristiche devianti e le tendenze prevalenti.
I dati GC-MS sono stati correlati alla concentrazione di biomassa calcolata (g/L) mediante una regressione OPLS (Orthogonal Partial Least-Squares) a Y singola, al fine di evidenziare i metaboliti maggiormente correlati all'evoluzione temporale della biomassa. Per identificare i metaboliti discriminanti tra le due alghe, è stata eseguita l'analisi ortogonale parziale discriminante ai minimi quadrati (OPLS-DA). Sono stati analizzati i punteggi di importanza variabile (VIP) che riassumono il contributo di ogni variabile al modello. Con il fine di quantificare ogni metabolita sono stati considerati l'intensità del frammento di massa più abbondante.
Dall’analisi dei cromatogrammi e degli spettri di massa associati, sono stati rilevati 90 metaboliti, 75 dei quali identificati. La classe dei carboidrati è stata di gran lunga la più abbondante durante la crescita di queste alghe (39%), seguita dagli acidi organici (18%) e dai grassi (15%). La classe meno abbondante di composti identificati era quella degli amminoacidi (6%). Dall’analisi dei metaboliti discriminanti si è potuto evidenziare che le due alghe presentavano dei profili metabolici caratteristici. Infatti, per quanto riguarda C. melkonianii i metaboliti acido malico, treonico e inositolo risultavano essere più abbondanti rispetto a Picochlorum sp. che, diversamente, era caratterizzato dalla presenza di acidi grassi tra cui acido stearico, palmitico e nonanoico. Questa analisi suggerisce che i due ceppi potrebbero trovare delle applicazioni tecnologiche distinte in settori diversi che meglio sfruttino le diverse potenzialità intrinseche. Per quanto riguarda C. melkonianii infatti,
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I’inositolo, che fa parte del complesso della vitamina B2, che in caso di carenza determina caduta dei capelli e dermatiti, è anche presente nel bagaglio terapeutico della cura dell’ovaio policistico e dell’infertilità. Inoltre, possiede un’azione lipotropa, volta alla mobilizzazione dei grassi dal fegato.
L’acido l-treonico è un metabolita della vitamina C ed è indagato per le sue proprietà simili all'acido ascorbico, e per la sua abilità di aumentare i livelli di assorbimento dei minerali essenziali da parte dell'organismo. Alcune ricerche suggeriscono che tale composto svolga un’azione in sinergia col calcio nella produzione di collagene e nella prevenzione dell'osteoporosi. L'acido l-treonico risulta inoltre in grado di reprimere l'espressione di un gene, conosciuto come DKK-1, regolato dal diidrotestosterone nello sviluppo della calvizie. L’acido malico, nonostante venga anche utilizzato come additivo alimentare in qualità di acidificante con la sigla E296, è un ingrediente di farmaci ed integratori, volti al trattamento di condizioni quali secchezza della fauci, sindrome d'affaticamento cronico, fibromialgia e reumatismi. È inoltre apprezzato in ambito sportivo in quanto si ritiene aumentare l'energia e la forza muscolare e velocizzare le capacità di recupero.
Per quanto concerne gli acidi grassi stearico, palmitico e nonanoico maggiormente abbondanti in Picochlorum sp., l’acido palmitico, così come l’acido stearico, possiede proprietà emolienti e lipogelificanti. Viene utilizzato come ingrediente intermedio per l’ottenimento di numerose materie prime cosmetiche e, unitamente all’acido stearico, forma la stearina. Per la preparazione di saponi, viene fatto reagire con idrossido di sodio per dare palmitato di sodio. Inoltre, viene utilizzato principalmente come fattore di consistenza nelle formulazioni cosmetiche. Ancora, trova largo impiego anche in forma di sapone bi-trivalente (Al, Zn, Ca). Il palmitato di magnesio si usa invece come perlante negli shampoo. L’acido nonanoico, conosciuto anche come acido pelargonico è invece usato come intermedio per la produzione di erbicidi, solventi e lubrificanti e per la produzione di esteri utilizzati nell'industria cosmetica, dei profumi e aromi. Viste e considerate queste caratteristiche tecnologiche si evince facilmente che le due alghe troverebbero applicazioni in settori differenti. Specificamente C.melkonianii potrebbe trovare un più conveniente impiego nell’industria nutraceutica e degli integratori alimentari, mentre Picochlorum sp. si rivela un migliore candidato per il settore cosmetico, per la produzione di saponi e lubrificanti.
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Per meglio caratterizzare il ceppo C. melkonianii SCCA 045, è stata eseguita una analisi termogravimetrica (TGA) i cui termogrammi hanno fornito indicazioni sulla composizione dell’alga in esame.
Figura 7. Termogramma relativo allo studio di C.melkonianii SCCA 045.
Infine, è stata effettuata una analisi elementare CHN della biomassa algale secca. I risultati mostrano che mediamente la biomassa è caratterizzata da un contenuto percentuale di carbonio pari al 46.71
0.47 %, dello 7.94 di idrogeno e dello 6.13 0.16 % di azoto.
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WP-2.3. Definizione preliminare dei pathway metabolici coinvolti nella produzione di prodotti ad alto valore aggiunto.
Una volta identificati nei lipidi e negli acidi grassi in genere i composti estraibili dai ceppi algali e potenzialmente suscettibili di valorizzazione economica, è stata svolta una revisione della letteratura scientifica finalizzata ad individuare i principali pathways metabolici che determinano la loro sintesi nelle alghe. Tali pathways sono schematizzati nella Figura seguente:
Figura 8. Principali pathways metabolici coinvolti nella sintesi lipidica da parte delle microalghe.
(Bellou et al. 2014; Q. Hu et al. 2008; Liu et al., 2011).
PDK = piruvato chinasi; PDC = complesso della piruvato deidrogenasi; ACCase = acetil-CoA carbossilasi; MAT = malonil-CoA:[proteina trasportatrice di acili] S-maloniltrasferasi; KAS = 3- chetoacil ACP sintasi; KAR = 3-chetoacil-ACP reduttasi; HD = 3-idrossiacil-ACP deidratasi; ENR =
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25 enoil-ACP reduttasi; FAT = acil-ACP saturo tioesterasi; LACS = acido lisofosfatidico aciltransferasi;
DGAT = diacilglicerolo aciltrasferasi; GPAT = glicerolo-3-fosfato aciltrasferasi; LPAAT = acido liso- fosfatidico aciltransferasi; LPAT = liso-fosfatidilcolina aciltrasferasi.
Nelle microalghe, la produzione di lipidi inizia nei cloroplasti con la sintesi “de novo” degli acidi grassi.
In figura 8 viene mostrato lo schema semplificato delle principali vie metaboliche coinvolte in questo processo.
Il piruvato è l'intermedio di partenza ottenuto a partire dal fosfoenolpiruvato (PEP) che a sua volta è deriva dalla gliceraldeide-3-fosfato (G3P) proveniente dal ciclo di Calvin.
Enzimi specifici, il cui nome è riportato nella didascalia della figura, catalizzano le reazioni di sintesi degli acidi grassi. Qualunque sia l'origine del piruvato, nella fase successiva del processo, viene decarbossilato in acetil-coenzima A (acetil-CoA) dal complesso multienzimatico del piruvato deidrogenasi (PDC) (Jin Liu, Huang e Che 2011).
L'acetil-CoA viene quindi sottoposto ad una reazione di carbossilazione catalizzata dall'enzima ACCasi che porta alla sintesi del malonil-CoA, reazione ampiamente accettata come limitante la biosintesi degli acidi grassi.
Successivamente, il gruppo malonile viene trasferito dal CoA ad un cofattore proteico sulla proteina trasportatrice di acili (ACP) per mezzo dell'azione catalitica dell'enzima MAT. Il malonil-ACP risultante partecipa quindi ad una serie di reazioni che determinano l’allungamento della catena carboniosa dell'acil-ACP. La prima reazione di condensazione è catalizzata dall’enzima chetoacil- ACP sintasi III (KAS III) il quale porta alla formazione di 3-chetoacil-ACP che possiede quattro atomi di carbonio (Q. Hu et al. 2008; Jin Liu, Huang e Che 2011). Quest'ultimo viene successivamente ridotto, disidratato e nuovamente ridotto, rispettivamente, dagli enzimi 3-chetoacil-ACP riduttasi, 3- idrossiacil-ACP deidratasi ed enoil-ACP riduttasi (KAR, HD ed ENR). In questo modo è generato un acil-ACP saturo, con quattro atomi di carbonio, che può reagire nuovamente con una nuova molecola di malonil-ACP per dar luogo ad un processo ciclico. Infatti, il precursore degli acidi grassi (acil-ACP saturo) si allunga di due atomi di carbonio reagendo con una nuova molecola di malonil- ACP ad ogni ciclo di allungamento (Q. Hu et al. 2008). Quindi, l’acil-ACP saturo risultante viene
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sottoposto alle stesse reazioni di riduzione-disidratazione-riduzione sopra descritte, prima di rientrare nel ciclo dove viene ulteriormente allungato di due atomi di carbonio reagendo con malonil- ACP. Un altro enzima di condensazione, il 3-chetoacil ACP sintasi (KAS I) è responsabile della produzione di catene carboniose di varie lunghezze (da 6 a 16-18) e, in alcune microalghe delle catene più lunghe (C20-C22) a seguito di un ulteriore elongazione e/o desaturazione di C18.
L'allungamento degli acil-ACP termina quando il gruppo acile viene rilasciato dal trasportatore proteico ACP dall'enzima acil-ACP tioesterasi (FAT) situato nell'involucro del cloroplasto. Quindi, l'enzima acido lisofosfatidico aciltransferasi LACS, anch'esso situato nella membrana del cloroplasto, attiva gli acili rilasciati convertendoli in acil-CoA saturi (Bellou et al. 2014). In questo modo gli acil-CoA saturi possono essere trasferiti al citosol, dove diventano disponibili per la sintesi dei triacilgliceroli (TAG).
In alternativa, le catene aciliche possono essere utilizzate per la sintesi dei lipidi strutturali all'interno del plastide grazie all’azione di enzimi aciltransferasi: tipicamente, glicolipidi e fosfolipidi hanno ruoli strutturali, essendo usati nella sintesi delle membrane, mentre i triacilgliceroli (TAG) sono stoccati come riserve energetiche.
Le proporzioni tra le tipologie dei lipidi sono fortemente dipendenti dal ceppo microalgale considerato. È però possibile asserire che in media i lipidi algali totali sono costituiti da circa il 35%
da lipidi neutri, circa il 40% da glicolipidi e il 25% da fosfolipidi (Williams e Laurens 2010).
Per lo scopo di questa relazione, a titolo di esempio, si focalizza l’attenzione sulla sintesi dei TAG.
Quest'ultima inizia quando le catene di acil-CoA dal citosol entrano nel reticolo endoplasmatico (RE).
In questa fase, alcuni acidi grassi subiscono una reazione di esterificazione con alcuni fosfolipidi strutturali del RE per essere poi convertiti in acidi grassi poli-insaturi (PUFA). All'interno del RE, gli acidi grassi sono utilizzati come elementi costitutivi per la formazione di TAG attraverso il ciclo di Kennedy che coinvolge quattro enzimi di concerto al fotosintato G3P (Bellou et al.2014; Q. Hu et al.2008; Jin Liu, Huang e Che 2011). In particolare, il ciclo di Kennedy inizia con l'acilazione di G3P per formare acido lisofosfatidico attraverso l'azione dell’enzima glicerolo-3-fosfato aciltrasferasi (GPAT). La seconda acilazione, catalizzata dall’ enzima acido liso-fosfatidico aciltransferasi (LPAAT), porta alla formazione di acido fosfatidico (PA). Quindi l'enzima liso-fosfatidilcolina aciltrasferasi (LPAT) promuove il rilascio di fosfato dal PA per ottenere diacilglicerolo (DAG). Infine,
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l'ultima acilazione, guidata dall'enzima diacilglicerolo aciltrasferasi (DGAT), permette di ottenere triacilgliceroli.
Una volta sintetizzati, i TAG vengono immagazzinati nel citosol come fonte energetica. I percorsi sopra descritti hanno ampia validità per le cellule vegetali ma, per le microalghe, alcuni passaggi non sono ancora ben compresi anche perché possono variare da specie a specie. Poiché la conoscenza rigorosa delle vie metaboliche di cui sopra e dei geni coinvolti, è fondamentale per perseguire l'obiettivo di aumentare la produttività dei lipidi delle alghe attraverso strumenti di ingegneria genetica, sono attualmente in corso sforzi significativi su queste linee. Risulta importante sottolineare che, all'interno della cellula algale, i percorsi sopra riportati portano all'accumulo di lipidi la cui composizione, espressa in termini di esteri di acidi grassi, è paragonabile a quello degli oli vegetali tipicamente utilizzati per la produzione di biodiesel (Klok et al. 2013).
WP-2.4. Individuare le potenzialità di ottimizzazione dei ceppi, in relazione alla loro produttività in composti utili, attraverso strumenti di ingegneria metabolica e/o genetica.
Tale attività si è concretizzata in una analisi dello stato dell’arte sui risultati dell’applicazione di tecniche di ingegneria genetica a ceppi microalgali, al fine della massimizzazione della loro produzione di lipidi, ossia dei prodotti utili del processo identificati come riportato nei paragrafi precedenti.
Da questa analisi è emerso che le principali tecnologie di ingegnerizzazione genetica dei ceppi algali adottate ai fini della massimizzazione della loro produttività in biomassa e/o lipidica possono essere raggruppate in tre fondamentali categorie come riportato nella figura seguente.
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25 Figura 9. Schema a blocchi delle principali categorie di ingegnerizzazione dei ceppi algali utilizzate Per via dello scarso utilizzo delle tecniche di editing genomico ci si è focalizzati sulla analisi dei risultati ottenuti con le prime due categorie di tecniche. Nella Tabella seguente sono mostrati i principali risultati ottenuti mediante tecniche di mutagenesi randomizzata. Nelle Tabelle successive sono riassunti i principali risultati di letteratura ottenuti utilizzando tecniche molecolari.
Tabella 1. Tecniche di mutagenesi adottate per l’ingegnerizzazione delle microalghe (Park et al., 2019)
Agenti mutageni Azione Esempi pubblicati Riferimento
Specie Strategia di
screening
Fenotipo
mutante
Chimici
MNNG
Alchilazione delle basi del DNA.
Specificamente singole mutazioni sulle guanine.
Desmodesmus sp. Rosso Nilo/lettore di piastre
Aumento della produzione di lipidi da 19.83 a 778.10 mg/L
Zhang et al.
(2016)
EMS Nannochloropsis
salina BODIPY/FACS
Aumento di PUFA e FAME fino al 156% (A causa della diminuzione della crescita, l'aumento della produttività dei lipidi è stata del 76%)
Beacham et al.
(2015)
2AP Analoghi delle
basi Chlorella vulgaris Biocida
Contenuto lipidico fino al 23,4% nel mutante indotto da FdUMP
Zhang et al.
(2016)
Tecniche di ingegnerizzazione dei ceppi
Mutagenesi Randomizzata:
Chemicals
Radiazioni UV, g, X, fasci di ioni
Trasformazione nucleare per mutagenesi inserzionale e /o
espressione di transgeni
Editing genomico CRISPR
(poco usato per microalghe)
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25 Tabella 1. Tecniche di mutagenesi adottate per l’ingegnerizzazione delle microalghe (Park et al., 2019)
Agenti mutageni Azione Esempi pubblicati Riferimento
Specie Strategia di
screening
Fenotipo
mutante
Radiazioni
γ-rays, X-rays
Energia prodotta dalla
disintegrazione dei radioisotopi (60Co o 137Cs) / Ionizzazione delle molecole di DNA che provocano rotture e delezioni a doppio filamento
Scenedesmus
dimorphus Rosso Nilo
Contenuto lipidico aumentato del 25%, cambiamento morfologico con un tasso di crescita più elevato
Choi et al. (2014)
Nitzschia sp.
Graduale aumento della salinità del medium
Aumento del contenuto di lipidi dall'11,9%
al 27,2%
(ulteriore aumento fino al 51,2% in caso di deplezione di N e Si)
Cheng et al.
(2014)
Chlorella sorokiniana
Evaporazione dello Iodio
Mutanti senza amido, ma nessuna differenza nel contenuto di lipidi
Vonlanthen et al.
(2015)
Scenedesmus sp.
Aumento del contenuto di lipidi dal 40% al 50% (ulteriore aumento dello stress ossidativo fino a 1,63 g/L)
Sivaramakrishnan and
Incharoensakdi (2017)
UV
Reazioni fotochimiche che danno luogo a dimeri di ciclobutano- piridina e conversioni da A/T a C/G
Scenedesmus obliquus
Evaporazione dello iodio dopo deplezione di N
Accumulo di TAG fino al 45%
sotto fame di azoto
de Jaeger et al.
(2014)
Chlorella
vulgaris (local) Anticorpi e biocidi
Contenuto lipidico da 15% a 17.4%∼26.9%
Anthony et al.
(2015)
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25 Tabella 1. Tecniche di mutagenesi adottate per l’ingegnerizzazione delle microalghe (Park et al., 2019)
Agenti mutageni Azione Esempi pubblicati Riferimento
Specie Strategia di
screening
Fenotipo
mutante
Fascio ionico pesante (12C6+, 14N7+, 20Ne10+
(135 MeV/u), 40Ar17+
(95 MeV/u), or 56Fe24+
(90 MeV/u) ions)
L'elevato trasferimento di energia lineare (LET) del fascio di ioni pesanti provoca rotture a doppio filamento sulle molecole di DNA
Chlamydomonas sp.
Screening di adattamento ad alta salinità, iodio
Kato et al. (2017)
Desmodesmus sp. Fluorescenza della clorofilla
La produttività dei lipidi aumenta del 20,6%, maggiore efficienza fotosintetica (aumento FV/FM)
Hu et al. (2013)
Parachlorella kessleri
Colorazione Rosso Nilo sotto deplezione d N.
Aumento dell'accumulo di lipidi al 66% e produttività della biomassa a 0,82 g /L/d
Takeshita et al.
(2018)
Le tecniche molecolari testate sulle microalghe sono invece riportate nella tabella seguente.
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Geni Approccio Specie Modifiche fenotipiche Riferimento
Biosintesi di acidi grassi e TAG
ACCase
Heterologous expression Dunaliella salina Aumento di 1,4 volte del contenuto lipidico
totale Talebi et al. (2014)
Overexpression Cyclotella cryptica Atteso aumento di 2-3 volte dei lipidi Dunahay (1993)
Heterologous expression Schizochytrium sp. Aumento della biomassa del 29,9% e degli
acidi grassi dell'11,3% Yan et al. (2013) Overexpression Chlamydomonas reinhardtii Aumento di 2,4 volte del contenuto dei TAG Rengel et al. (2018)
DGAT
Overexpression Nannochloropsis oceanica Aumento totale dei lipidi del 69% Li et al. (2016) Heterologous expression Chlamydomonas reinhardtii Aumento di 2 volte del contenuto TAG Ahmad et al. (2015) Overexpression Phaeodactylum tricornutum Aumento dei lipidi neutri del 35% Niu et al. (2013) Five TAG synthesis enzymes Heterologous gene expression Chlorella minutissima 30–40% di aumento del contenuto di TAG Hsieh et al. (2012)
GPAT1 & LPAT1 Overexpression Phaeodactylum tricornutum Il TAG aumenta di 2,3 volte sotto
l'esaurimento dell'azoto Wang et al. (2018)
ME
Overexpression Phaeodactylum tricornutum Aumento di 2,5 volte del contenuto lipidico Xue et al. (2015)
Overexpression Chlorella protothecoides Aumento di 2,8 volte del contenuto lipidico
totale Yan et al. (2019)
Heterologous expression Chlamydomonas reinhardtii PTS42
23,4% di acidi grassi, aumento del contenuto
di lipidi del 19,9% Kim et al. (2019a)
Glycerol kinase Heterologous expression Scenedesmus quadricauda Aumento di 1,6 volte dei contenuti G3P Gomma et al. (2015)
G3PDH Overexpression Phaeodactylum tricornutum Aumento di 1,9 volte del contenuto di lipidi
neutri, lieve calo della crescita Yao et al. (2014) G6PD Overexpression Phaeodactylum tricornutum Aumento di 2,7 volte del contenuto lipidico Xue et al. (2018)
2/25 Tabella 2. Tecniche molecolari utilizzate per la modificazione genetica delle microalghe (Park et al., 2019)
Geni Approccio Specie Modifiche fenotipiche Riferimento
Percorsi competitivi
AGPase Knock-out/mutation Chlamydomonas Aumento di 10 volte del contenuto TAG Li et al. (2010)
UGPase
Knock-out/TALEN Phaeodactylum tricornutum Aumento di 45 volte del TAG Daboussi et al. (2014)
Knock-down/RNAi Phaeodactylum tricornutum
Significativa diminuzione della
crisolaminarina e lieve diminuzione dei lipidi totali
Zhu et al. (2016)
CIS Knock-down/RNAi Chlamydomonas reinhardtii Aumento di 3 volte del contenuto dei TAG Deng et al. (2013) PEPC1 Knock-down/RNAi Chlamydomonas reinhardtii Aumento del 20% del contenuto dei TAG Deng et al. (2014)
PDK Knock-down/RNAi Phaeodactylum tricornutum Aumento dei lipidi neutri dal 23,1% al 42,1%,
lieve diminuzione della crescita Ma et al. (2014)
Formazione di corpi lipidici
StLDP Overexpression Phaeodactylum tricornutum Aumento dell'accumulo di goccioline lipidiche Yoneda et al. (2018) AtOLEO3 Heterologous expression Phaeodactylum tricornutum Aumento di 1,4 volte nel contenuto dei TAG Zulu et al. (2017) Catabolismo di TAG e lipidi
TGL1 Knock-down/RNAi Phaeodactylum tricornutum Livello di TAG aumentato negli estratti lipidici Barka et al. (2016) PLA2 Knock-out/CRISPR/Cas9 Chlamydomonas reinhardtii Aumento del 64% del contenuto lipidico totale Shin et al. (2019)
CrACX2 Knock-out/random insertional
mutagenesis Chlamydomonas reinhardtii Aumento del 20% del contenuto di olio sotto
fame di azoto Kong et al. (2017)
Regolatori della trascrizione
HLH2 Overexpression Nannochloropsis salina 33% di aumento della resa di FAME Kang et al. (2015)
WRI1 Heterologous expression Nannochloropsis salina 64% di aumento della resa di FAME Kang et al. (2017)
3/25 Tabella 2. Tecniche molecolari utilizzate per la modificazione genetica delle microalghe (Park et al., 2019)
Geni Approccio Specie Modifiche fenotipiche Riferimento
Dof-type TF
Heterologous expression Chlamydomonas reinhardtii Aumento di 2 volte della produzione totale di
lipidi Ibáñez-Salazar et al. (2014)
Heterologous expression Chlorella ellipsoidea Aumento del 46,4-52,9% dei lipidi totali Zhang et al. (2014) ZnCys TF Knock-down/CRISPR/Cas9 Nannochloropsis gaditana Aumento di 2 volte della produttività dei lipidi Ajjawi et al. (2017)
bZIP Overexpression Nannochloropsis salina Sia la crescita che la produzione di lipidi sono
state migliorate Kwon et al. (2018)
PSR1 Overexpression Chlamydomonas reinhardtii Aumento dei granuli di amido, diminuzione
del contenuto di lipidi neutri Bajhaiya et al. (2016)
CHT7 Knock-out/random insertional
mutagenesis Chlamydomonas reinhardtii Riduzione del 90% del TAG e dell'accumulo
di goccioline lipidiche Tsai et al. (2014)
TAR1 Knock-out/random insertional
mutagenesis Chlamydomonas reinhardtii Incapace di riprendere la crescita e
riprendersi dopo privazione di S e N. Kajikawa et al. (2015)
NRR1 Knock-out/random insertional
mutagenesis Chlamydomonas reinhardtii Riduzione dell'accumulo di TAG nel mutante
difettoso Boyle et al. (2012)
Efficienza fotosintetica
LHC isoforms Knock-down/RNAi Chlamydomonas reinhardtii Tasso di crescita più veloce del 65% Mussgnug et al. (2007)
CpSRP54 Knock out/CRISPR/Cas9 Chlamydomonas reinhardtii Aumento dell'80% di Pmax Jeong et al. (2017)
NAB1 Overexpression Chlamydomonas reinhardtii Aumento del 53% del tasso di crescita Beckmann et al. (2009)
RuBisCO activase Overexpression Nannochloropsis oceanica Aumento di oltre il 40% della biomassa e
della produttività dei lipidi Wei et al. (2017)
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Il grande bisogno di alternative più sostenibili ai combustibili fossili ha incentivato la ricerca sui biocarburanti di origine algale e, negli ultimi anni, il numero di articoli scientifici che pongono l’attenzione su queste “biofabbriche verdi” è aumentato enormemente. Le cellule microalgali, caratterizzate da un'elevata efficienza fotosintetica e da una rapida divisione cellulare, sono un'ottima fonte di lipidi e di prodotti ad elevato valore aggiunto. Vari fattori di stress, in particolare condizioni di carenza di nutrienti, possono indurne una maggiore sintesi. Tuttavia, l'aumento della produttività complessiva, in particolar modo dei lipidi, è ostacolato dal compromesso tra accumulo di lipidi e crescita cellulare. Per questa ragione sono stati compiuti svariati sforzi ad ampio raggio per risolvere queste sfide, dalla selezione di ceppi produttori di olii alla coltivazione con diversi terreni di coltura. Ciò nonostante, lo sviluppo di ceppi ingegnerizzati risulta un approccio ancora poco utilizzato nonostante questa alternativa potrebbe fornire molteplici vantaggi in settori tecnologici differenti: dai mangimi per animali ai biocarburanti, all'alimentazione umana e per la produzione di materiali ecologici. Proprio per questa ragione, gli obiettivi futuri riguarderanno quasi certamente il trasferimento tecnologico mirato a ceppi robusti e ingegnerizzati, per esempio produttori di biodiesel, che possano crescere all'aperto, in ambienti diversi, senza essere superati da altri microrganismi e resistere ai predatori.
Conclusioni
Dalle operazioni di campionamento e caratterizzazione dei ceppi algali si è pervenuti alla scelta del ceppo da investigare nelle fasi successive del progetto. Tale ceppo, noto come Coccomyxa melkonianii è stato campionato nella zona mineraria di Montevecchio e la sua caratterizzazione metabolomica preliminare ha mostrato un buon contenuto di lipidi valorizzabili soprattutto nel settore della nutraceutica e della cosmetica. Si è pertanto pervenuti anche alla scelta del composto ad alto valore aggiunto su cui focalizzarsi, ossia i lipidi algali, e i settori di mercato più adatti alla sua valorizzazione, ossia quello dei cibi funzionali e degli integratori nonché quello della cosmetica.
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In Biodiesel - Feedstocks and Processing Technologies, edited by Margarita Stoytcheva. InTech.
Il sottoscritto ______________________________________ in qualità di Responsabile scientifico del progetto Cluster Top Down
Timbro e Firma_________________________________ Data __________________________
