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Introduzione. Se l’iperomocisteinemia contribuisca allo sviluppo della microangiopatia diabetica è una pro- blematica tuttora dibattuta che presenta implicazioni scientifiche e di pratica clinica, dal momento che l’ipe- romocisteinemia può essere corretta attraverso interventi nutrizionali.

Obiettivi. Gli scopi dello studio sono: 1) valutare i livelli plasmatici di omocisteina e alcuni dei loro maggiori determinanti in pazienti con diabete mellito di tipo 1 e controlli non diabetici; 2) chiarire le basi di tale associa- zione studiando la relazione tra omocisteinemia, stato vitaminico e complicanze microvascolari del diabete.

Materiale e metodi. Abbiamo studiato 66 pazienti affetti da diabete mellito tipo 1, con durata del diabete superiore a 10 anni, con normale creatininemia (<1,3 mg/dL) e privi di malattie cardiovascolari clinicamente evidenti. Abbiamo inoltre studiato un gruppo di 44 controlli non diabetici. Per tutti i partecipanti sono state determinate le concentrazioni plasmatiche di omocisteina, folato e vitamina B

. La microalbuminuria è stata valutata come rapporto albumina/creatinina sulle urine del mattino; la retina è stata studiata mediante la foto- grafia del fondo oculare.

Risultati. I livelli plasmatici di omocisteina sono molto simili nei pazienti diabetici e nei controlli normoglicemi- ci. I pazienti con microalbuminuria o retinopatia proliferante avevano livelli di omocisteina plasmatica signifi- cativamente più alti rispetto a quelli senza tali complicanze (rispettivamente 9,4 ± 3,1 vs 7,4 ± 2,8 mmol/L, p < 0,02 e 9,5 ± 2,6 vs 7,3 ± 3,0 mmol/L, p < 0,05). Tali risultati non possono essere attribuiti a fattori confon- denti quali età, sesso o fumo di sigaretta, né a differenze nelle concentrazioni plasmatiche di folato e vitamina B

. Conclusioni. Il diabete mellito di tipo 1 di per sé non si associa a elevati livelli plasmatici di omocisteina. I pazienti con microalbuminuria e/o retinopatia proliferante mostrano valori di omocisteinemia significativa- mente più alti rispetto a quelli privi di tali complicanze. Quest’associazione non è mediata dai fattori confon- denti esplorati nello studio né da differenze nel bilancio vitaminico.

Parole chiave. Omocisteina, microalbuminuria, retinopatia, acido folico, vitamina B

. Microvascular complications of diabetes and plasma homocysteine in type 1 diabetic patients.

Background. Whether homocysteine contributes to the development of diabetic microangiopathy is still a debated issue with important scientific and clinical practice implications, since hyperhomocysteinemia is susceptible to cor- rection by nutritional means.

Objectives. 1) To evaluate the association between fasting plasma homocysteine, type 1 diabetes and the microva- scular complications of diabetes; 2) to elucidate the basis of this association by investigating some of the major deter- minants of plasma homocysteine in relation to diabetic microangiopathy.

Methods. We studied sixty-six consecutive patients with type 1 diabetes mellitus of >10 years duration, with normal serum creatinine (1.3 mg/dL) and free from clinically detectable cardiovascular diseases. Forty-four non diabetic con- trols were also studied. Plasma concentrations of homocysteine, folate and vitamin B

were investigated. Renal and retinal diabetic complications were evaluated as albumin/creatinine ratio on early morning urine spot collection and fundus photographs.

Results. Fasting plasma homocysteine levels were very similar in diabetic patients and normoglycemic controls (8.0 ± 2.9 vs 9.3 ± 3.6 mmol/L). Patients with microalbuminuria or proliferative retinopathy had significantly higher plasma homocysteine than those without - respectively 9.4 ± 3.1 vs 7.4 ± 2.8 mmol/L, p < 0.02 and 9.5 ± 2.6 vs 7.3 ± 3.0 mmol/L, p < 0.05.The finding is not explained by confounders, such as age, sex and smoking, nor by dif- ferences in plasma concentrations of folate and vitamin B

.

Lavoro originale

E LEVAZIONE DELLE CONCENTRAZIONI PLASMATICHE DI OMOCISTEINA IN PAZIENTI CON DIABETE DI TIPO 1

E COMPLICANZE MICROVASCOLARI

V. C UOMO , M. S ACCO , A.F. P ERNA *, C. I OVINE , M. M ASULLI , D. I NGROSSO *, O. V ACCARO Dipartimento di Medicina Clinica e Sperimentazione, Facoltà di Medicina, Università degli Studi di Napoli Federico II, Napoli;

*Istituto di Biochimica delle Macromolecole, Facoltà di Medicina, Seconda Università degli Studi di Napoli, Napoli

riassunto summar y

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Conclusions. Type 1 diabetes is not associated with increased plasma homocysteine levels. Patients with microal- buminuria and/or proliferative retinopathy show significantly higher plasma homocysteine values as compared to those free from these conditions. This association is not mediated by obvious confounders, nor by differences in vita- min status. On these basis it is plausible to hypothesize that plasma homocysteine contributes, together with other diabetes related noxae to the development of nephropathy and the progression of retinopathy.

Key words. Homocysteine, microalbuminuria, retinopathy, folic acid, vitamin B

.

Lavoro originale

Le evidenze più recenti della letteratura indicano che un moderato aumento dell’omocisteina plasmatica rappresenta un fattore di rischio indipendente per accidenti cardiovascolari (1-5). Alcune osservazioni, inclusi studi in vitro e su animali, indicano l’esistenza di plausibili meccanismi biologici che mettono in rela- zione l’iperomocisteinemia con gli eventi cardiovasco- lari: ad esempio l’omocisteina causa danno endotelia- le, agisce come agente trombogenico e stimola la pro- liferazione delle cellule muscolari lisce (5-10). Tutti i meccanismi descritti non solo giocano un ruolo nell’a- terogenesi ma sembrano anche essere implicati nella patogenesi delle lesioni microvascolari del diabete.

Se il diabete si associa a elevati livelli di omocisteina e se questi contribuiscono allo sviluppo delle sue com- plicanze vascolari (sia microvascolari che macrova- scolari) non è stato ancora chiarito (11-19). Una rela- zione tra un aumentata escrezione urinaria di albumi- na e iperomocisteinemia è stata riportata in pazienti sia di tipo 1 che di tipo 2, tuttavia le basi di quest’as- sociazione rimangono poco chiare. Inoltre la relazio- ne tra livelli plasmatici di omocisteina e retinopatia (la più specifica tra le complicanze del diabete) è stata finora poco studiata.

La relazione tra l’omocisteinemia e le complicanze vascolari del diabete rappresenta una problematica di rilievo nella pratica clinica, dal momento che l’ipero- mocisteinemia è suscettibile di correzione tramite interventi nutrizionali. È infatti risaputo che condizioni relativamente frequenti, quali un basso apporto di vita- mina B

e di acido folico, possono determinare mode- rati aumenti dei livelli di omocisteina, in quanto tali vitamine sono importanti cofattori nelle tappe del catabolismo dell’omocisteina (2, 8, 20). L’obiettivo di questo studio è duplice: 1) valutare i livelli di omoci- steina e alcuni dei suoi maggiori determinanti in pazienti con diabete mellito di tipo 1 rispetto a con- trolli non diabetici; 2) studiare la relazione tra omoci- steina, stato vitaminico e complicanze microvascolari del diabete.

Introduzione

Materiale e metodi

Abbiamo studiato 66 pazienti consecutivi affetti da diabete mellito di tipo 1 con durata della malattia superiore ai 10 anni. Il deficit di insulina è stato defi- nito come storia documentata di chetoacidosi e/o concentrazione a digiuno di peptide C < 0,2 nmol/L.

Abbiamo inoltre studiato un gruppo di controllo di 44 soggetti non diabetici paragonabili per sesso ed età, reclutato fra i coniugi dei pazienti.

I criteri di esclusione sono stati: la presenza di macro- proteinuria dimostrata dall’Albustix; riscontro di una creatininemia ≥ 1,3 mg/dL; uso di farmaci antiperten- sivi; presenza di malattie cardiovascolari clinicamente evidenti diagnosticate con il questionario della OMS su infarto, angina e claudicatio (21), con l’ECG stan- dard e con l’indice di Winsor. Sia i partecipanti diabe- tici che quelli non diabetici sono stati informati sugli obiettivi e le modalità dello studio e hanno dato il loro consenso a partecipare. L’approvazione per lo studio è stata data dalla commissione etica della struttura.

La retinopatia è stata studiata mediante fotografia del fondo oculare eseguita e valutata secondo un proto- collo standard (22). I partecipanti sono stati classifi- cati in tre gruppi: assenza di retinopatia (< 2 microa- neurismi), retinopatia non proliferante (2 o più microaneurismi, o emorragie retiniche, o essudati duri o morbidi, o edema maculare), retinopatia proli- ferante (neovascolarizzazione o emorragie del vitreo o glaucoma emorragico o proliferazione fibrovascola- re o distacco di retina, pregressa fotocoagulazione panretinica) (22-23). L’esame del fondo oculare non è disponibile per due pazienti.

Per la determinazione dell’omocisteina, il sangue è stato prelevato a digiuno in provette con EDTA imme- diatamente centrifugate a 4 °C per separare il plasma dalle cellule. I campioni sono stati poi congelati a –80

°C per successive misurazioni. L’omocisteinemia è

stata misurata con la cromatografia liquida ad alta

risoluzione secondo il metodo di Ubbink, modificato

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da Perna (24, 25), valutando l’omocisteina totale. Le concentrazioni plasmatiche di vitamina B

e folato sono state misurate contemporaneamente sul siero usando un kit presente in commercio (Simultrac SNB B

57Co/folate

I radioassay solid phase no-boil Kit;

ICN Biomedicals).

La microalbuminuria è stata misurata con metodo radioimmunologico sulle urine del mattino; valori com- presi tra 30 e 300 µg/mg di creatinina sono stati definiti come microalbuminuria (26). La clearance della creatini- na è stata calcolata tramite la formula di Cockroft (27).

Tutti gli esami clinici e laboratoristici sono stati ese- guiti in cieco da operatori che non erano a conoscen- za né della diagnosi di diabete né dello stato delle complicanze.

Analisi statistica: i risultati sono espressi come media

± deviazione standard o in percentuali. La relazione tra l’omocisteinemia e lo stato vitaminico o le altre variabili è stata studiata con la correlazione di Pearson. I confronti tra i gruppi per le variabili con- tinue sono stati eseguiti attraverso un test t di Student per dati non appaiati o con analisi della varianza con il post hoc Duncan test. È stata neces- saria la trasformazione logaritmica dei valori di omocisteina per rendere valida l’assunzione della normalità della sua distribuzione. L’analisi è stata condotta con i dati in forma logaritmica; i risultati sono stati espressi nella scala originale.

Risultati

I partecipanti diabetici avevano una durata media del diabete di 17 ± 7 anni, ed erano in uno stato di dis- creto controllo glicemico come dimostrato dai livelli di emoglobina glicata (8,0 ± 1,2%). Per effetto dei cri- teri di selezione adottati l’età e la distribuzione dei due sessi erano simili nei pazienti diabetici e nei controlli (tab. I). L’indice di massa corporea era significativa- mente più alto nei pazienti non diabetici, mentre i livelli plasmatici di omocisteina a digiuno erano molto simili nei partecipanti con o senza diabete (tab. I).

I livelli plasmatici di folato e vitamina B

erano in un range normale sia nei pazienti diabetici che nei sog- getti non diabetici; ma i valori erano significativa- mente più alti nei diabetici (tab. I).

I livelli plasmatici di omocisteina erano significativa- mente e inversamente correlati con i livelli plasmatici di folato e vitamina B

sia nei partecipanti diabetici che nei non diabetici, mentre nel gruppo dei diabeti- ci nessuna correlazione significativa era osservata con variabili associate al diabete, quali la durata della malattia e l’emoglobina glicata (tab. II).

Lavoro originale

TAB. I. Caratteristiche generali, livelli plasmatici di omocisteina acido folico e vitamina B

nei pazienti con diabete mellito tipo 1 e nei controlli normoglicemici

Pazienti diabetici Controlli normoglicemici

(n = 66) (n = 44)

Età (anni) 43,3 ± 6,8 44,1 ± 6,5

Maschi (%) 50 55

IMC (kg/m

) 25,1 ± 2,9 26,9 ± 3,7*

Omocisteinemia (mmol/L) 8,0 ± 2,9 9,3 ± 3,6

Folati (nmol/L) 15,2 ± 4,9 10,2 ± 5,9**

B

(pmol/L) 417, ± 115,0 303,0 ± 116,1**

Durata del diabete (anni) 17,0 ± 7,0 -

* p < 0,05; ** p < 0,02

I pazienti con microalbuminuria (fig. 1) avevano livel- li significativamente più alti di omocisteina plasmati- ca rispetto a quelli senza microalbuminuria (9,4 ± 3,1 vs 7,4 ± 2,8 mmol/L, rispettivamente). Questa diffe- renza non è spiegata da variazioni nella concentra- zione di acido folico o di vitamina B

, i cui valori non erano significativamente differenti fra i due gruppi con o senza microalbuminuria (fig. 2); né da differen- ze nella creatinina sierica (0,9 ± 0,2 e 0,86 ± 0,1

Omocisteinemia ( µ mol/L)

14

12

10

8

6

4

2

0

Microalbuminuria

No Sì

* p < 0,03

*

Fig. 1. Livelli di omocisteinemia nei pazienti diabetici di tipo 1 con

o senza microalbuminuria.

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mg/dL rispettivamente) o nella clearance della creati- nina (96,8 ± 18,2 e 99,4 ± 18,3 mL/m rispettivamen- te). I livelli plasmatici di omocisteina aumentavano progressivamente, con un trend lineare significativo (p < 0,03), con il grado di compromissione retinica (7,3 ± 3,0 vs 8,2 ± 2,6 vs 9,5 ± 2,6 mmol/L, rispetti- vamente nei pazienti senza retinopatia, con retinopa- tia non proliferante e con retinopatia proliferante). Il Post hoc Duncan test indicava livelli significativamen- te (p < 0,05) più alti di omocisteina plasmatica a digiuno nei pazienti con retinopatia proliferante rispetto a quelli senza alcun segno di retinopatia

Lavoro originale

TAB. II Correlazione semplice (r) fra i livelli plasmatici di omocisteina e alcuni suoi

determinanti, nei pazienti con o senza diabete mellito tipo 1

Pazienti diabetici Controlli normoglicemici

(n = 66) (n = 44)

r p r p

Età (anni) 0,20 0,26 0,15 0,32

Folati (nmol/L) –0,46 0,001 –0,55 0,001

B

(pmol/L) –0,41 0,001 –0,51 0,001

Durata del

diabete (anni) 0,2 0,9 - -

Emoglobina

glicosilata (%) –0,15 0,3 - -

(fig. 3). Ancora una volta le concentrazioni di folato e di vitamina B

(fig. 4) non erano significativamente differenti nei tre gruppi. Analogamente non si osser- vavano differenze nei tre gruppi per la creatininemia (0,8 ± 0,1, 0,9 ± 0,1, 0,9 ± 0,2 mg/dL rispettivamen- te) e la clearance della creatinina (97,8 ± 16,2, 105,6

± 21,7, 90,6 ± 11,9 mg/min rispettivamente).

Le condizioni di retinopatia proliferante e di microal- buminuria erano largamente sovrapposte (in questo studio il 50% dei pazienti con retinopatia proliferante avevano anche microalbuminuria).

Nel tentativo di valutare la relazione dell’omocistei- nemia con ognuna di queste condizioni separata- mente, i livelli plasmatici di omocisteina sono stati confrontati fra quei pazienti con microalbuminuria ma senza retinopatia proliferante (n = 9) e quelli con retinopatia proliferante ma senza microalbuminuria (n = 5), i valori erano simili (8,9 ± 2,7 vs 8,8 ± 2,6 mmol/L) e per entrambi sostanzialmente più alti di quelli dei pazienti privi di ogni segno di retinopatia o microalbuminuria (6,9 ± 3,1 mmol/L). È anche inte- ressante sottolineare che, sebbene il gruppo totale di pazienti diabetici mostri livelli plasmatici di omoci- steina a digiuno simili a quelli dei pazienti non diabe- tici, i pazienti diabetici non microalbuminurici e senza retinopatia (né proliferativa né background) hanno l’omocisteina plasmatica a digiuno significativamen- te più bassa dei controlli normoglicemici (6,9 ± 3,1 vs 9,3 ± 3,6 mol/L, p < 0,03).

Discussione

Questo studio esplora la relazione dei livelli plasmati- ci di omocisteina, e alcuni dei loro maggiori determi-

B

(pmol/L)

600

500

400

300

200

100

0

Microalbuminuria

Sì No

Fig. 2. Livelli di vitamina B

e folato in pazienti diabetici di tipo 1 con o senza microalbuminuria.

Folato (nmol/L)

25

20

15

10

5

0

Microalbuminuria

Sì No

Folato (nmol/L)

25

20

15

10

5

0

Microalbuminuria

Sì No

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nanti, con il diabete di tipo 1 e le sue complicanze microvascolari. Studi precedenti hanno prodotto risultati discordanti riportando che i pazienti diabeti- ci, sia di tipo 1 che di tipo 2, possono avere valori di omocisteina più alti, più bassi o sovrapponibili rispet- to a quelli dei soggetti non diabetici (11-17, 28).

Differenze nella funzione renale e nella presenza di patologie concomitanti (per es. malattie cardiovasco- lari) nei vari campioni studiati possono in parte spie- gare queste discrepanze. Diversamente da molti pre- cedenti lavori, questo studio è stato condotto su di un campione estremamente ben caratterizzato di pazienti con diabete di tipo 1, così da permettere di stabilire con chiarezza che questo tipo di diabete di per sé non è associato a elevati livelli plasmatici di omocisteina; un aumento delle concentrazioni di omocisteina si osserva infatti solo in presenza di com- plicanze microvascolari (retinopatia e microalbumi- nuria), mentre i pazienti senza queste complicanze hanno valori di omocisteina più bassi rispetto ai con- trolli non diabetici.

Un elegante lavoro dimostra una relazione diretta tra filtrato glomerulare e livelli di omocisteina plasmatici anche nel range normale di filtrazione glomerulare, e suggerisce che i bassi livelli di omocisteina nei pazien- ti diabetici possono essere spiegati da una iperfiltra- zione spesso presente nel diabete (29). Questa non sembra una spiegazione plausibile nel nostro studio, giacché i pazienti con microalbuminuria o retinopatia proliferante non presentano livelli di filtrato glomeru- lare significamente diversi. Tuttavia occorre sottoli- neare che la filtrazione glomerulare nel nostro studio è stata calcolata mediante la formula di Cockroft e

Lavoro originale

Omocisteinemia ( µ mol/L)

p < 0,03 per il trend 14

12

10

8

6

4

2

0

*

Assente Non proliferante Proliferante

* p < 0,05 vs retinopatia assente, Post hoc Duncan Test

Fig. 3. Livelli di omocisteinemia nei pazienti con diabete di tipo 1 in relazione al grado di retinopatia.

non misurata direttamente. Inoltre, in accordo con altri lavori condotti in soggetti non diabetici (2, 8, 30- 32), i nostri risultati indicano che lo stato vitaminico ha un ruolo importante come determinante della omoci- steinemia anche nei diabetici. La dieta abitualmente prescritta ai nostri pazienti copre abbondantemente il fabbisogno giornaliero di acido folico e vitamina B

; infatti i pazienti partecipanti allo studio hanno livelli significativamente più alti di B

e folato rispetto ai controlli non diabetici, e ciò può a sua volta contribui- re a regolare i livelli plasmatici dell’omocisteina.

Per quanto riguarda l’associazione dell’omocisteina

plasmatica con le complicanze microvascolari del dia-

bete, la relazione microalbuminuria-iperomocisteine-

mia è stata riportata in molti, anche se non in tutti i

precedenti lavori, mentre la relazione con la retino-

patia è molto meno studiata ed è più controversa (11-

18). A ogni modo i possibili meccanismi di queste

associazioni restano poco chiari. Questo studio stabi-

lisce chiaramente una associazione della omocistei-

nemia sia con la microalbuminuria sia con la retino-

patia, inoltre studia alcuni dei meccanismi più plausi-

bili di quest’associazione. L’aumento dei livelli pla-

smatici di omocisteina osservati nei pazienti diabetici

con microalbuminuria o retinopatia diabetica prolife-

rante non può essere spiegato dalla contemporanea

presenza di malattie cardiovascolari o insufficienza

renale – condizioni di per sé associate con un aumen-

to dell’omocisteina plasmatica. Anche altri possibili

fattori confondenti quali età, sesso, fumo di sigaretta

sono stati esclusi, così come differenze nelle concen-

trazioni plasmatiche di vitamina B

, acido folico e

creatinina sierica; anche se non possiamo escludere

l’esistenza di lievi differenze nella filtrazione glomeru-

lare non evidenziabili con l’uso della formula di

Cockroft. L’iperomocisteinemia è costantemente pre-

sente nei pazienti con insufficienza renale clinica-

mente evidente. Allo stadio di microalbuminuria non

c’è traccia di danno renale e la filtrazione glomerula-

re è spesso sopra la norma, nondimeno sono già pre-

senti alterazioni morfologiche nel rene (33). Inoltre

un recente lavoro ha chiaramente stabilito una rela-

zione tra il tasso di filtrazione glomerulare e l’omoci-

steina plasmatica in soggetti con normale funzione

renale (29). In contrasto con questi dati, l’esistenza di

un ruolo centrale del rene nel metabolismo e/o escre-

zione dell’omocisteina, basata essenzialmente sui

risultati di studi condotti su animali, è stata seriamen-

te messa in discussione nell’uomo da uno studio

recente che non ha evidenziato nessuna differenza

tra la concentrazione di omocisteina nell’arteria e

nella vena renale in soggetti con normale funzione

renale (34). Quindi la relazione tra omocisteina e fun-

zione renale è ancora estremamente poco chiara, e

allo stato attuale delle conoscenze è verosimile ipotiz- zare che l’omocisteina giochi un ruolo come determi- nante delle lesioni vascolari del diabete, piuttosto che essere secondaria alla microalbuminuria. Questa ipo- tesi è supportata da esperimenti in vitro che dimo- strano come l’omocisteina danneggi selettivamente cellule endoteliali in precedenza esposte a prodotti avanzati della glicazione, suggerendo così un effetto sinergico dell’iperglicemia e dell’omocisteina sull’en- dotelio vascolare (16).

Data l’impostazione trasversale dello studio, tuttavia l’ipotesi alternativa che l’aumento dell’omocisteina pla- smatica possa rappresentare una conseguenza, piutto- sto che un determinante del danno tissutale, come recentemente suggerito (35), non può essere trascurata.

I limiti di questo studio derivano principalmente dalle piccole dimensioni del campione e dalla definizione di microalbuminuria basata su un’unica misurazione, entrambe queste condizioni possono mascherare l’associazione e viziare l’interpretazione verso conclu- sioni negative piuttosto che positive. In ogni caso le nostre osservazioni meritano ulteriori approfondi- menti in quanto hanno importanti implicazioni nella pratica clinica; infatti i livelli di omocisteina plasmati- ca possono essere controllati attraverso adeguati interventi nutrizionali o supplementi di acido folico (31). Quindi, i risultati di questo studio forniscono un forte incentivo per trials d’intervento mirati a testare se la riduzione dell’omocisteinemia contribuisca a prevenire sia la micro- che la macroangiopatia nel diabete di tipo 1.

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Lavoro originale

B

(pmol/L)

600

500

400

300

200

100

0

Assente Non proliferante Proliferante

Fig. 4. Livelli di vitamina B

e folati nei pazienti con diabete di tipo 1 in relazione al grado di retinopatia.

Folati (nmol/L)

25

20

15

10

5

0

Assente Non proliferante Proliferante

15

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Corrispondenza a: Dott. Vincenzo Cuomo, Dipartimento di Medicina Clinica e Sperimentale, Policlinico dell'Università di Napoli Federico II, Via S. Pansini 5, 80131 Napoli

Pervenuto in Redazione il 15/09/2000 - Accettato per la pub- blicazione il 30/10/2000

A questo lavoro è stato attribuito il 3° Premio Nazionale Roche

Giornale Italiano di Diabetologia e Metabolismo “Diabete, obe-

sità e patologie metaboliche: dalla ricerca alla clinica”