1. INTRODUZIONE
La Transtiretina (TTR) è una proteina plasmatica identificata nel 1974 da Dewitt Goodman [1]
deputata al trasporto della tiroxina e del retinolo, da qui il suo nome “Trans Thyroxine Retinol”. Il
gene che codifica per la TTR si trova sul cromosoma 18 [2]. Viene sintetizzata principalmente nel
fegato, ma alcuni studi hanno mostrato che la TTR è prodotta, anche se in misura minore,
nell‟epitelio pigmentato retinico e nel sistema nervoso centrale al livello dei plessi corioidei [3]. I
plessi corioidei sono localizzati nel cervello, in corrispondenza dei ventricoli cerebrali, dove hanno
la funzione di secernere il liquido celebrospinale (CSF). Il liquido celebrospinale è costituito per
80% da acqua, zuccheri, proteine plasmatiche ed è isotonico con il plasma; si distribuisce in tutto
l‟organismo garantendo così la presenza della TTR in tutti i distretti. Nel liquido celebrospinale la
TTR svolge un importante ruolo di trasporto per gli ormoni tiroidei Tiroxina (T4), Triiodiotironina
(T3). La TTR presente nel CSF è catabolizzata dal fegato, dai muscoli, e dalla pelle probabilmente
dopo il riassorbimento da parte dei villi arachinoidi [4].
1.1 Struttura della Transtiretina
La TTR è un omotetramero, β-sheet, che circola sia nel sangue che nel liquido celebrospinale
[5]composto di quattro subunità identiche denominate A, B, C, e D. Queste sono disposte attorno ad un canale centrale in cui sono localizzati i siti di legame per due molecole di tiroxina (Fig.1).
Figura.1: (a) Struttura cristallina della TTR legata con T4, in ogni suo sito di legame. (b) Immagine di un sito di legame per il T4 e delle tasche di legame per gli alogenuri.
La struttura cristallografica della proteina rivela che ogni monomero è un β-sandwich con due quattro strands β-sheets: un foglio interno di strands D, A, G, H, un foglio esterno di strands C, B, E, F ed infine una piccola regione elicoidale che connette gli strands E ed F. I monomeri si assemblano in dimeri grazie alla formazione di legami ad idrogeno tra gli strands H e F [5,6]. Il legame ad idrogeno si ha tra i residui di Ser-115 e Thr-123 dello strand H e tra quelli di Ala-91 e Ala-97 dello strand F. Ogni monomero di TTR si compone di 127 amminoacidi, ed ha un perso molecolare di 14 KDa. La TTR, quando è legata con la proteina legante il retinolo (RBP) e con l‟ormone tiroideo Tiroxina, è presente nel plasma umano alla concentrazione di circa 0.20 mg/ml (3.6 µM). Per di più TTR è il maggior carrier del T4 nel fluido celebrospinale dove è presente una concentrazione di 0.02mg/ml (0.29 µM) [7].
Ogni sito di legame della Tiroxina è caratterizzato da due sottositi, un sottosito di legame esterno
(outer binding), uno interno (inner binding). In particolare i due sottositi di legame (inner e outer)
sono caratterizzati da tre piccole depressioni idrofobiche simmetriche chiamate tasche di legame degli alogenuri (HBP
s) nelle quali si legano gli atomi di iodio presenti della Tiroxina [8]. Nella TTR sono presenti in ogni sito di legame sei tasche leganti gli alogenuri (HBP1, HBP1
‟, HBP2, HBP2‟, HBP3, e HBP3‟) (Fig.2) [8,9].
Figura.2: Compesso TTR-T4, Outer/Inner Cavity, HBPs
HBP
S1 e 1‟ nel sottosito di legame esterno comprendono le catene laterali di Ala-108/108‟, Thr106/106‟, Met-13/13‟ e Lys-15/15‟ con le tasche delineate dai gruppi metile e metilene della Lys-15/15‟, Ala-108/108‟, Thr-106/106‟[9].
HBP
s2 e 2‟ sono posizionati all‟interfaccia dell‟esterno e dell‟interno delle cavità di legame, sono
costituite dalle catene laterali di Leu17/17‟, Ala108/108‟, Ala109/109‟ e Leu110/110‟. La tasca di
legame è altamente lipofila permettendo così ai residui di HBP2 e HBP2‟ di interagire
favorevolmente con la porzione idrofobica della Tiroxina [8,9].
Le cavità di legame interne comprendono HBP3 e HBP3‟ , sono formate dalle catene laterali della
Ser117/117‟, Leu110/110‟, Thr119/119‟ e Ala108/108‟ [8,9].
1.2 Transtiretina e patologie associate ad una sua mutazione
La dissociazione di una proteina in monomeri e la sua successiva aggregazione sono in relazione con numerose patologie quali ad esempio l‟Alzheimer, il Parkinson, le amiloidosi, alterazioni patologiche per le quali non sono ancora ben conosciuti i meccanismi che sono alla basa della loro eziologia. L‟elemento distintivo di queste malattie riferito alla formazione delle fibrille amiloidi è la formazione di aggregati β-sheet-rich [10]. Il processo di dissociazione, che può caratterizzarla, determina la formazione di fibrille amiloidi che sono insolubili nei liquidi biologici e quindi si depositano nei tessuti e nelle matrici extracellulari portando a neurodegenerazione e morte cellulare [9]. In realtà è bene puntualizzare che la TTR non è l‟unica proteina coinvolta nella formazione di fibrille, ma rappresenta sicuramente una delle 20 proteine umane meglio conosciute per il suo comportamento in vivo [11].
La deposizione di aggregati costituiti da TTR wild-type e da altre mutazioni della TTR implica il conclamarsi di diverse e gravi malattie amiloidi [7]. Sono state osservate quattro tipi di amiloidosi (Fig.3): amiloidosi sistemica senile (SSA); cardiomiopatia amiloide famigliare (FAC);
polineuropatia amiloide familiare (FAP); amiloidosi del sistema nervoso centrale (CNSA) [12].
SSA deriva da una mutazione wild-type della TTR e implica la deposizione di fibrille amiloidi a
livello cardiaco; è stata riscontrata sopratutto nelle persone anziane (colpisce 10-15 %) [9], mentre
l‟origine delle patologie famigliari (FAC, FAP, e CNSA) si pensa essere radicata nelle mutazioni
fibrillogenetiche della TTR riscontrate in diverse popolazioni di tutto il mondo ( FAC colpisce in
particolare 3-4 % degli africani e degli americani). Nelle patologie famigliari, l‟aggregazione di
fibrille amiloidi porta a conseguenze molto gravi, come neuropatie e cardiomiopatie sistemiche e
centrali, che implicano difficili condizioni di vita [8].
Figura 3: tabella riassuntiva delle amiloidosi legate alla TTR.
L‟unico approccio clinico consentito per il trattamento delle patologie legate alla TTR è il trapianto
di fegato per bloccare la sintesi di TTR mutate. Tuttavia alcune mutazioni si presentano comunque,
e inoltre non esistono terapie farmacologiche efficaci per combattere la deposizione di TTR mutata
(wild-type) nella SSA [12].
L‟obiettivo è abbandonare questa terapia aggressiva per lasciare spazio
ad una approccio meno invasivo e più affine al paziente [6].
1.3 Mutazioni della Transtiretina
La TTR wild-type (WT) normalmente è stabile a pH neutro; la dissociazione in monomeri e il seguente assemblaggio in fibrina è facilitato da un pH moderatamente acido. La TTR mutata, associata alla patologia, ha una struttura quaternaria meno stabile e più propensa alla dissociazione.
Il processo di formazione delle placche amiloidi, prevede come primo step la dissociazione del tetramero della TTR in monomeri, questi poi subiscono un lieve cambio configurazionale per riorganizzarsi e assemblarsi in fibrina (Fig.4). Studi condotti utilizzando la tecnica dell‟NMR, in cui l‟idrogeno è scambiato con il deuterio, hanno indicato che gli “edge” strands C e D sono sensibili alla denaturazione nel processo di fibrinogenesi della TTR, mentre gli strands A, B, E e G formano un nucleo centrale resistente [8,9].
Figura.4 :Cascata amiloidogenetica della TTR.
Il tetramero può dissociarsi in monomeri seguendo almeno tre possibili strade, tra queste le prime
due procedono attraverso intermedi dimerici distinti. La prima scissione avviene all‟interfaccia del
dimero energeticamente più debole ed è poi seguita dalla dissociazione dei due dimeri risultanti (
sia AB/CD che AC/BD) in monomeri. La terza possibilità, che comprende tre varianti, consiste nella perdita di un monomero che determina la formazione di un trimero, questo a sua volta si dissocia in tre possibili combinazioni di dimeri, quindi poi in monomeri (Fig.5) [13].
Figura.5: Possibili meccanismi di dissociazione della TTR.
Il processo di disgregazione della TTR nei vari monomeri è correlato alla presenza di mutazioni
puntiformi che si verificano sulle catene amminoacidiche che della proteina. La mutazione V30M (
Val
30→Met
30) è la più comune variante nella polineuropatia amiloide famigliare ed è stata
riscontrata in pazienti giapponesi, portoghesi, svedesi. La polinerupatia amiloide famigliare è spesso
trattata con il trapianto di fegato, questo permette la sostituzione del V30M da un allele WT
nell‟organo che poi provvede a tutti i tessuti fatta eccezione del cervello e degli occhi [14]. La mutazione V30M non è l‟unica, infatti altra variante patologica è L55P (Leu
55→Pro
55). In condizioni di pH 7.0 e temperatura di 37°C, sia WT-TTR che V30M sono stabili, mentre L55P- TTR concorre alla formazione di fibrille amiloidi in vitro. La Leu
55è localizzata nei due residui D- strands ( E54 e L55 ), un “edge” di β-sandwich della TTR; mentre la Val
30si trova nel B-strand che forma il nucleo idrofobico [11]. (Fig. 6)
Figura.6: Struttura tridimensionale della WT-TTR. Monomero, dimeno e tetramero.
L‟alfa elica si estende da T75 a T82. La Leu-55 è colorata in rosso, mentre la Val-30 in verde. Nel complesso tetramerico il loop A-B (magenta) nel monomero A è a contatto con il loop G-H (blu) nel monomero D, mentre il loop G-H, nel monomero A, interagisce con il loop A-B nel monomero D. Il monomero B interagisce con il monomero C con gli stessi contatti.
Sebbene i residui 54-55, nella L55P-TTR, appartengono al “surface loop”, si osserva un elevata
uguaglianza strutturale tra la proteina mutata e quella wild-type. Si ritiene che le mutazioni in un
singolo punto accelerino il processo amiloidogenetico, destabilizzando il monomero parzialmente
denaturato allo stato amiloidogenico intermedio, piuttosto che alterando lo stato nativo del
tetramero [11].
1.4 Le amiloidosi
Le amiloidosi sistemiche sono un gruppo di malattie ed evoluzione cronica di amiloidi nei diversi organi e tessuti dell‟organismo. Il coinvolgimento multi organo (fegato, reni, cuore, apparato digerente, SNC, SNP) rende responsabili tali patologie di gravi invalidità e in casi più gravi anche della mortalità. Sono causate dal deposito di proteine alterate nei vari tessuti. In ogni tipologia di amiloide vi è una diversa proteina che acquisisce la proprietà di accumularsi sotto forma di fibrille costituendo dei veri e proprio depositi [15]. Dal punto di vista biochimico sono state definite tre principali forme di amiloidosi. Il primo tipo è denominato AL e si riscontra nella amiloidosi primitiva e in quella associata al mieloma multiplo, ha una sequenza N-terminale analoga ad una porzione della regione variabile delle catene leggere delle immunoglobuline.
Il secondo tipo si riscontra in pazienti con amiloidosi secondaria ed ha una sequenza N-terminale tipica di una proteina non immunoglobulinica. Il terzo tipo denominato amiloidosi ereditarie, associato alla polineuropatia amiloide famigliare, è legata principalmente a mutazioni genetiche o non di una proteina la TTR. Altre amiloidosi ereditarie sono riconducibili a mutazioni di altre proteine come la apolipoproteina A-I, la gelsolina, il fibrinogeno e lisozima. Le analisi biochimiche relative alle varie forme di amiloide hanno portato a una classificazione più raffinata: una sola proteina denominata AP o (AP sierica) è universalmente associata con tutte le forme di amiloide e rappresenta la base di un test diagnostico specifico.
L‟amiloidosi viene classificata come primitiva o idiopatica (forma AI), quando non è associata ad
alcuna malattia; e secondaria, acquisita o reattiva (forma AA), quando è associata a malattie
croniche, sia infettive (tubercolosi, bronchiettasie, osteomielite, lebbra) sia infiammatorie (artrite
reumatoide, ielite granulomatosa). Il terzo tipo di amiloidosi si presenta nelle forme familiari non
associate ad altre patologie, spesso con quadri caratteristici di neuropatia, nefropatia e cardiopatia.
Amiloidosi primitiva (AL) : può interessare il cuore, i polmoni, la cute, la lingua, la tiroide e il
tratto intestinale. Si possono riscontrare nel tratto respiratorio o in altre sedi “tumori” amiloidi localizzati. Sono spesso coinvolti gli organi parenchimali ( fegato, milza, rene) e l‟apparato vascolare, soprattutto il cuore.
Amiloidosi secondaria (AA) : colpisce in modo preferenziale la milza, il fegato, i reni, i surreni e i
linfonodi, anche se poi nessun apparato viene risparmiato e l‟interessamento vascolare può essere ampiamente diffuso. Tutti gli organi interessati aumentano di volume, si presentano duri e di consistenza elastica. La sezione della milza di un paziente affetto da tale patologia si presenta con ampie aree traslucide, ceree, inoltre i normali corpi di Malpighi sono sostituiti da amiloide pallida (milza a “sagù”).
Amiloidosi familiare ereditaria: determina neuropatia periferica sensitiva e motoria, spesso
neuropatia autonomica e deposizione di fibrille amiloidi cardiovascolare e renale. Si possono verificare la sindrome del tunnel carpale e anomalie del corpo vitreo.
Amiloidosi familiare o ATTR è una rara forma di amiloidosi ereditaria in cui la Transtiretina, se soggetta a mutazioni, precipita formando fibrille amiloidi. Le amiloidosi Transtiretina dipendenti sono legate a mutazioni nell‟omonimo gene ( quattro esoni).
Sono attualmente note oltre 100 mutazioni in questo gene; si tratta di mutazioni puntiformi in cui si verifica la sostituzione di singoli residui aminoacidici.
Il quadro clinico prevede il coinvolgimento sia del sistema nervoso periferico (SNP) che del sistema nervoso autonomo ( SNA).
La penetranza (percentuale di persone che presentano la mutazione e manifestano effettivamente i
sintomi della malattia) è elevata e l‟espressività (modalità di manifestazione della malattia)
variabile.
La diagnosi molecolare delle amiloidosi-TTR è basata sull‟amplificazione genica delle regioni codificanti (esoni 2, 3 e 4) del gene TTR e sul sequenziamento delle regioni codificanti del gene (esoni) in grado di identificare tutte le mutazioni puntiformi.
Per effettuare la diagnosi molecolare è sufficiente un prelievo di sangue periferico.
La amiloidosi-TTR è una patologia autosomica dominante: ad ogni gravidanza, il genitore affetto ha una probabilità del 50% di trasmettere al figlio il gene mutato, e quindi la malattia [16].
E‟ possibile effettuare la ricerca di mutazioni nel gene TTR anche in epoca prenatale. L‟esame viene
effettuato su DNA estratto da villi coriali tramite villocentesi.
1.5 Alzheimer
La patologia di Alzheimer è una malattia neurodegenerativa progressiva in cui si riscontra la formazione di placche beta-amiloidi e di ammassi neurofibrillari a livello dei tessuti celebrali. Si tratta di una forma di demenza che influisce sulla capacità di una persona di portare a termine anche le più semplici attività quotidiane, va a colpire le parti del cervello che controllano la parola, la memoria e il pensiero; il decorso della malattia può durare tra gli otto e i quindici anni. Durante la patologia si riscontra una diminuzione del volume cerebrale in seguito ad una lenta e graduale distruzione dei neuroni (Fig.7). La morte neuronale è legata alla formazione di depositi intracellulari di placche neurofibrillari che derivano dall‟accumulo di microtubuli fosforilati associati alla proteina tau, ma non solo, anche da depositi extracellulari di amiloide chiamati neuriti o placche senili (Fig.8). Entrambe le lesioni si riscontrano nel sistema nervoso centrale, in particolare nell‟ippocampo e nella corteccia.
Figura.7: sezione si un cervello normale e malato. Figura.8: placche neurofibrillari.
Le placche sono formate da un peptide di 40-42/43 amminoacidi, peptide beta amiloide (A-Beta)
che si forma per dissociazione sequenziale di una proteina precursore dell‟amiloide (APP) ad opera
della beta e gamma-secretasi. L‟accumulo del peptide è correlato ad uno scorretto bilanciamento tra
la sua produzione e degradazione [16]. Nei soggetti sani ciò non accade perché la reazione della
APP è catalizzata da un altro enzima, l‟alfa-secretasi che porta alla formazione di un peptide
innocuo p3. Sia il peptide che il suo precursore (APP) giocano un ruolo importante nella funzione
neuronale, così, il controllo dei livelli fisiologici di A-Beta, piuttosto che la completa inibizione,
sembra essere un‟importante strategia per ridurre l‟accumulo di placche neuritiche e rallentare la
progressione della malattia [17]. La TTR circolante del liquido celebrospinale è in grado di legare,
stabilizzandolo, il β-amiloide. Nei soggetti affetti da questa patologia è stato messo in evidenza una
diminuita concentrazione di TTR nel CSF [4].
1.6 Inibitori della TTR
I primi studi sulla TTR si sono sviluppati analizzando l‟interazione tra la Tiroxina (T4) ligando endogeno e la proteina stessa ed hanno messo in luce come sia l‟ormone tiroideo che suoi derivati (2,4,6-triiodiofenoli) siano in grado di stabilizzare la struttura della TTR wild-type, V30M, e L55P.
La Tiroxina (Fig.9) inibisce il misfolding della TTR stabilizzando la cinetica dello stato nativo. In Figura 10 è riportato il sito attivo della TTR e la sua interazione con il ligando endogeno T4.
HO I
I
O
I
I
H2N COOH
Figura.9:Tiroxina. Figura.10: Complesso TTR-T4.
La porzione idrofilica della T4 è posizionata all‟entrata del sito di legame. Gli alogeni presenti
come sostituenti su le due porzioni aromatiche instaurano legami con le tasche HBP3 e HBP1. Un
contributo significante al legame del T4 con la TTR, deriva da gruppi collocati nella porzione
periferica del sito attivo. Per esempio la Glu-54 e Lys-15 sono posizionate vicino alla tasca HBP1,
favorendo le interazioni elettrostatiche fra ligando endogeno e recettore. Tuttavia le molecole simili
all‟ormone endogeno non possono essere impiegate in ambito terapeutico, come composti in grado
di impedire la formazione di placche amiloidi, a causa della loro attività ormonale, per questo si è
cercato di identificare nuove piccole molecole ad azione inibitoria. Numerosi composti sia naturali
che di sintesi sono stati scrinati, i risultati di questi studi hanno messo in evidenza numerose
molecole in grado di legarsi e stabilizzare il tetramero della TTR, tra queste l‟acido flufenamico
(Flu) (Fig.11) (farmaco antiinfiammatorio non steroideo). Questo farmaco è in grado di inibire in
modo duraturo (72 ore) la formazione di fibrille amiloidi presentando una attività stabilizzatrice
maggiore del ligando endogeno [18]. Per comprendere l‟azione dell‟acido flufenamico nell‟inibire la formazione delle fibrille amiloidi, è stato studiato con studi di diffrazione a raggi X il complesso dell‟acido flufenamico legato alla TTR.
Analogamente alla Tiroxina due molecole di acido flufenamico sono legate nell‟imbuto centrale del tetramero della TTR (Fig.12) e inoltre in ogni sito il ligando può assumere quattro differenti conformazioni. La struttura del complesso binario TTR-Flu definisce chiaramente le interazioni molecolari che permettono al farmaco di legarsi alla TTR. In tutti e quattro i modelli di legame l‟acido flufenamico interagisce con i residui delle due molecole adiacenti di TTR.
HN
CF3 COOH
Figura.11: acido flufenamico.
Figura.12: complesso Flu-TTR.
Il gruppo CF
3occupa la tasca di legame degli alogenuri HBP3 situata nella parte più interna,
stabilisce interazioni di van der Waals con la Ser-117, Thr-119, Leu-110 e Ala-108. Il sistema bi-
fenilico si trova nella conformazione a più bassa energia in un patch idrofobico del sito di legame tra i residui di Leu-17, Thr-106, Ala-108, Thr-119, e Val-121. Il gruppo carbossilico, sull‟altro anello fenilico, è posto all‟entrata della tasca di legame a forma di imbuto, fornendo interazioni elettrostatiche con le altre catene laterali dei residui di Lys-15. Il legame del Flu induce anche cambiamenti conformazionali nella TTR che sembrano avere un effetto stabilizzante nel tetramero, infatti le catene laterali della Ser-117 e Thr-119 si riordinano per facilitare la formazione di un legame ad idrogeno addizionale tra le sub-unità del tetramero. Il legame con Flu fa si che le catene laterali dei residui di Ser-117, di tutti e quattro i monomeri, ruotino di circa 120° portando alla formazione di due legami ad idrogeno tra i residui di Ser-117 delle sub-unità adiacenti (quattro nuovi legami ad H per il tetramero). Similmente il cambio configurazionale ligando-indotto della catena laterale di Thr-119 porta alla formazione di un legame ad idrogeno con una molecola di acqua. Grazie alle interazioni che il Flu stabilisce con la TTR è impedita la dissociazione della proteina in monomeri [19]. Il modo in cui l‟acido flufenamico si lega alla TTR è simile al legame che instaura l‟ormone tiroideo ed è detto: “forward binding mode”. Negli anni sono stati condotti numerosi studi che hanno come scopo l‟individuazione di piccole molecole, tutte strutturalmente simili, in grado di stabilizzare lo stato nativo della proteina senza provocare effetti collaterali relativi al coinvolgimento del T4. Altri farmaci NSAID
Scome diclofenac (Dic), diflunisal, furbiprofene che sono in grado di aumentare la barriera cinetica di dissociazione del tetramero legando e stabilizzando lo stato fondamentale della TTR [20]. Il diclofenac (Fig.13) presenta uno scaffold bifenilamminico
HN
CL
Cl O
OH
Figura.13:Diclofenac.
come l‟acido flufenamico; studi in vitro hanno dimostrato che il Dic manifesta attività inibitoria verso la TTR ed inoltre ha una tolleranza gastrointestinale superiore al Flu e a molti anti- infiammatori. La strutture 3D del complesso TTR-Dic rivela che il Dic si lega nelle cavità del sito attivo della TTR in modo simile al Flu (Fig. 14). Il gruppo carbossilico del Dic è collocato all‟entrata della cavità legante l‟ormone, formando interazioni elettrostatiche con la catena laterale della Lys-15 (HBP1). Le stesse interazioni sono presenti tra la Lys-15 e il gruppo carbossilico della T4. Tuttavia lo studio ai raggi X per il complesso TTR-Flu ha messo in evidenza nel diclofenac un altro orientamento della molecola nel sito, infatti il gruppo carbossilico è collocato verso la parte esterna del sito di legame ed instaura interazioni con la Ser-117/117‟. Questo diverso modo di legare è stato chiamato “reverse binding mode” e come si può vedere il diclofenac in questo complesso è ruotato di 180°.
A. B.
C.
Figura 14: A. TTR-Dic ‘forward binding mode’; B. TTR-Dic ‘reverse binding mode’; C. complesso TTR-Dic.
Studi di relazione struttura attività (SAR) effettuati sugli analoghi del diclofenac hanno indicato che per una buona attività inibitrice il gruppo acido deve essere libero, la sua esterificazione riduce l‟efficacia di un fattore 10. Per l‟attività è importante la funzione acetica, la sua sostituzione con gruppi più ingombranti porta a composti meno attivi [21,22]. Il diclofenac si è mostrato un modesto inibitore della formazione di fibrille in vitro verso la TTR WT e V30M, tuttavia il suo basso livello di concentrazione terapeutica massima e lo scarso legame con la TTR nel plasma umano ne limita l‟uso clinico. Il Diflunisal ha una migliore inibizione nella formazione di fibrille rispetto al diclofenac verso la WT TTR ma l‟acido flufenamico resta comunque l‟inibitore migliore [23].
Un altro farmaco anti-infiammatorio non-steroideo (FANS) capace di stabilizzare la TTR è il diflunisal (Fig.15).
F F
OH COOH
Figura.15: diflunisal.
Recentemente il diflunisal è stato approvato dalla Food and Drug Administraction (FDA) per il suo utilizzo nelle neuropatie sostenute da TTR amiloidosi [24, 25].
Anche il diflunisal si lega alla TTR in due diversi modi “forward binding mode” e “reverse binding
mode”. Nel “forward binding mode” (Fig.16 A) in gruppo carbossilico instaura interazioni con la
Lys-115/115‟, e gli atomi di fluoro, sull‟altro anello aromatico, interagiscono con la TTR.
Figura.16: TTR-diflunisal A ‘forward binding mode’, B ‘reverse binding mode’
