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CONCLUSIONI
In questo studio sperimentale è stata analizzata l’azione antiproliferativa dei chemioterapici gemcitabina e pemetrexed e sono state definite le condizioni per un loro uso combinato sinergico nel trattamento in vitro di linee cellulari umane di carcinoma a cellule transizionali della vescica, nonché le basi molecolari e genetiche della loro interazione farmacologica.
Sono stati inoltre esaminati i livelli di espressione genica dei determinanti molecolari del meccanismo d’azione di gemcitabina e pemetrexed in 12 campioni di tessuto tumorale di vescica umano, ottenuti da pazienti sottoposti a resezione chirurgica.
La gemcitabina appartiene alla classe degli analoghi nucleosidici ed è attualmente utilizzato come farmaco di prima scelta nella terapia del tumore della vescica, in cui sono state registrate percentuali di risposta terapeutica comprese tra il 28%-36% (Chester et al., 2004). Il meccanismo d’azione della gemcitabina consiste principalmente nell’inibizione della sintesi del DNA, ma studi preclinici hanno dimostrato che alcuni dei suoi metaboliti possono incrementarne l’attività citotossica interagendo con sistemi biochimici alla base della sopravvivenza cellulare (Plunkett et al., 1995; van Moorsel et al., 2000). Queste proprietà rendono la gemcitabina un candidato ideale per lo sviluppo di combinazioni con altri chemioterapici capaci di influenzare i processi che regolano la proliferazione cellulare e l’induzione di apoptosi (Peters et al., 2000).
Il pemetrexed è un composto di recente scoperta, appartenente alla categoria dei derivati dell’acido folico. Questo farmaco determina l’inibizione di diversi enzimi, alterando sia il metabolismo dei folati che la sintesi del DNA (Hanauske et al., 2001). Recenti studi hanno inoltre dimostrato il ruolo del pemetrexed nella modulazione del ciclo cellulare e nelle modificazioni dei pools di nucleotidi intracellulari (Giovannetti et al. 2006; Chen et al., 1999). Proprio a causa di questa molteplicità d’azione, il pemetrexed è attualmente oggetto di studio per la terapia di numerosi tumori, tra cui il carcinoma a cellule transizionali della vescica (Fechner et al., 2003).
La conoscenza del meccanismo d’azione e della fase del ciclo cellulare in cui agiscono tali farmaci permette di ipotizzare un vantaggio terapeutico del loro uso combinato. L’associazione tra gemcitabina e pemetrexed è stata pertanto oggetto di recenti studi preclinici, che hanno esaminato vari schemi di trattamento, registrando
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risultati differenti in diverse linee cellulari. In particolare, Adjei et al. (2000) hanno analizzato la citotossicità di questa associazione nelle cellule di carcinoma colico HCT-8 e la sequenza in cui la gemcitabina è seguita da pemetrexed ha dimostrato un evidente sinergismo. Risultati simili sono stati ottenuti in ricerche effettuate su altre linee di carcinoma del colon (LoVo, WiDr, LRWZ) e una di polmone (Calu-1), in cui, oltre allo spiccato sinergismo della combinazione sequenziale gemcitabina→pemetrexed, sono stati registrati anche fenomeni di sinergismo-addittività per la sequenza inversa e sinergismo-addittività-antagonismo nel trattamento simultaneo (Tesei et al., 2002; Giovannetti et al., 2005). Viceversa, Giovannetti et al. (2005) hanno dimostrato che la sequenza in cui il pemetrexed precede la gemcitabina è quella che possiede la maggiore azione citotossica in modelli sperimentali di NSCLC in vitro.
Nel presente lavoro sono stati effettuati studi in vitro su due linee cellulari di carcinoma a cellule transizionali della vescica (T24 e J82), al fine di valutare il tipo di interazione farmacologica e identificare la sequenza ottimale per la somministrazione di questi due farmaci in associazione.
Negli studi di citotossicità in tutte le linee cellulari in esame, la gemcitabina ed il pemetrexed hanno determinato un’inibizione di tipo dose-dipendente della proliferazione cellulare. In particolare, i due chemioterapici, utilizzati in associazione, hanno determinato l'effetto sinergico citotossico più spiccato quando impiegati nella sequenza in cui il pemetrexed precede la gemcitabina nelle cellule T24, mentre nelle cellule J82 entrembe le sequenze hanno mostrato un effetto sinergico comparabile per tutti i valori di frazione inibita.
L’analisi di questi risultati ha costituito un incentivo per ulteriori approfondimenti sull’attività dei due chemioterapici, mediante studi sulle modificazioni del ciclo cellulare, sull’induzione di apoptosi e sull’espressione genica dei determinanti molecolari del meccanismo d’azione.
Ad esempio, lo studio citofluorimetrico ha rivelato la presenza di un incremento della percentuale di cellule in fase S sia dopo l’esposizione al pemetrexed che dopo quella alla gemcitabina nelle cellule T24. Risultati simili sono stati ottenuti sia da Tonkinson et al. (1997), che hanno analizzato gli effetti determinati dal pemetrexed sul ciclo cellulare nelle cellule leucemiche CCRF-CEM, che da Giovannetti et al. (2004), che hanno valutato l’azione della gemcitabina e del pemetrexed su tre linee cellulari di carcinoma pancreatico MIA PaCa-2, PANC-1 e Capan-1. Tale fenomeno potrebbe spiegare l’effetto citotossico sinergico ottenuto con
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le due somministrazioni sequenziali. Infatti, dopo un periodo di 24 ore successivo all’esposizione ai due farmaci, si verifica il reclutamento di un maggior numero di cellule in una fase del ciclo cellulare in cui è presente una maggiore sensibilità all’azione degli antiblastici.
Molti studi hanno dimostrato che l’efficacia di vari farmaci chemioterapici è correlata alla capacità di indurre apoptosi, e la possibilità di modulare questo processo rappresenta pertanto uno strumento importante per l’ideazione di nuove strategie atte ad incrementare l’azione degli agenti antitumorali (Hickman et al., 1992). Numerose ricerche hanno dimostrato che la gemcitabina esercita parte della suo effetto citotossico mediante l’induzione di apoptosi sia in cellule leucemiche che nei confronti di neoplasie solide, tra cui i carcinomi polmonari (Huang e Plunkett, 1995; Pace et al., 2000). La presenza di alterazioni nei sistemi di trasduzione del segnale che controllano i processi di morte cellulare programmata può però determinare la comparsa di fenomeni di resistenza nei confronti dell’induzione di apoptosi nelle cellule tumorali.
In particolare, in questa tesi sono stati effettuati studi per valutare la fosforilazione della proteina Akt, enzima chiave della via di trasduzione PI3K/Akt che è in grado di proteggere la cellula dagli stimoli pro-apoptotici (Ng et al., 2001; Fresno Vara et al., 2004). Entrambi i farmaci in studio si sono dimostrati attivi nel ridurre il contenuto cellulare di Akt fosforilata, in modo statisticamente significativo, nella linea cellulare T24. Mentre nella linea J82 solo il trattamento con il pemetrexed ha determinato una riduzione statisticamente significativa del contenuto di AKT fosforilata.
Diversi studi recenti permettono di affermare che la conoscenza dei livelli basali di espressione genica dei determinanti molecolari del meccanismo d’azione di diversi agenti antitumorali e della loro modulazione in regimi polichemioterapici possa predire l'efficacia del trattamento (Bergman et al., 2002; Giovannetti et al., 2004).
Al pari degli altri analoghi nucleosidici la gemcitabina è una molecola idrofila e, per permeare attraverso la membrana plasmatica, necessita di uno specifico sistema di trasporto che è rappresentato dai trasportatori nucleosidici di tipo equilibrativo e concentrativo. In particolare il principale responsabile della captazione della gemcitabina è il carrier denominato trasportatore nucleosidico equilibrativo 1 (hENT1): la presenza e l’attività di questa proteina sono ritenute fondamentali per il realizzarsi dell’effetto citotossico indotto dal farmaco (Mackey et
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al., 1998). Sulla base di recenti ricerche, che hanno dimostrato come gli inibitori dell’enzima timidilato sintasi (TS) possano portare ad un incremento del numero di trasportatori nucleosidici hENT1 sulla membrana plasmatica, (Pressacco et al., 1995; Rauchwerger et al., 2000), nel presente lavoro è stata eseguita l’analisi della modulazione dell’espressione genica di hENT1 indotta dall’esposizione al pemetrexed, ed è stato effettivamente rilevato un significativo incremento della trascrizione di tale gene nelle due linee cellulari in esame.
Un altro determinante del meccanismo d’azione della gemcitabina è l’enzima coinvolto nella sintesi di salvataggio dei nucleosidi, deossicitidina chinasi (dCK); è noto infatti che deficienze nel funzionamento di questa proteina sono responsabili dell’acquisizione di resistenza verso gli analoghi nucleosidici in vitro e in vivo (Kroep et al., 1998; Bergman et al., 2002). In accordo con tali dati, il ruolo cruciale di dCK è stato confermato in questa tesi mediante l’osservazione della riduzione della citotossicità indotta dalla gemcitabina in presenza di 2’-deossicitidina, substrato naturale dell’enzima.
La dipendenza dell’effetto terapeutico dei chemioterapici in studio dall’espressione dei rispettivi determinanti molecolari suggerisce la possibilità di usare questi marcatori per stratificare i pazienti in base alle probabilità di risposta o al rischio di insuccesso tearpeutico. Nel presente lavoro è stata dimostrata la fattibilità di un’analisi accurata dell’espressione genica in tessuti tumorali umani di vescica.
In particolare, sono state effettuate analisi di 12 tessuti tumorali di vescica, a partire da quantitativi di RNA compresi tra 50 e 500 ng. I risultati ottenuti con la metodica di RT-PCR quantitativa in questi campioni hanno evidenziato la presenza di un’ampia variabilità genetica, evidente soprattutto per gli enzimi dCK, CDA, RRM2 e hENT1 che potrebbe essere alla base delle diverse caratteristiche di chemiosensibilità-chemioresistenza nei confronti di gemcitabina e pemetrexed. Infine è stata dimostrata l’esistenza di una correlazione statisticamente significativa tra l’espressione genica di dCK e hENT1 e la risposta al trattamento chemioterapico con gemcitabina.
I dati sperimentali evidenziano l’esistenza di un’interazione di tipo sinergico tra gemcitabina e pemetrexed e costituiscono la base scientifica per lo sviluppo razionale di questa combinazione nella chemioterapia del carcinoma a cellule transizionali della vescica, ottimizzata sulle caratteristiche genetiche del paziente e della neoplasia da trattare.
