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RIASSUNTO
Le proibitine (PHBs: PHB1 e PHB2) sono proteine conservate durante l’evoluzione che svolgono ruoli importanti in diversi processi fondamentali come la regolazione del ciclo cellulare, la regolazione trascrizionale, la segnalazione cellulare, l’apoptosi, la senescenza e la biogenesi dei mitocondri.
Studi effettuati utilizzando metodiche di proteomica hanno permesso di ipotizzare in vitro una correlazione tra l’espressione di PHBs e il mantenimento dello stato indifferenziato e proliferante di cellule epatiche staminali (HLS). Al momento non sono però disponibili informazioni circa il ruolo in vivo di fattori PHBs nella biologia delle cellule staminali adulte.
Recentemente è stato dimostrato che un omologo del gene PHB2 umano (DjPHB2) è espresso in planaria (Platelminti) in una popolazione di cellule staminali adulte pluripotenti, i neoblasti. La presenza di queste cellule rende le planarie un sistema modello per lo studio in vivo della biologia delle cellule staminali adulte. I neoblasti, infatti, sono le uniche cellule proliferanti nel corpo della planaria, capaci di autorinnovarsi e differenziarsi in tutti i tipi cellulari.
Questa popolazione di cellule staminali è coinvolta sia nell’omeostasi che nel
2 processo rigenerativo, durante il quale i neoblasti proliferano attivamente per produrre il blastema dove, in seguito a processi di differenziamento, si riformeranno le parti mancanti del corpo.
Scopo di questo lavoro di Tesi è indagare in vivo la funzione del gene DjPHB2. Inizialmente, mediante metodiche di 5’ e 3’ RACE è stata ottenuta la
sequenza completa del gene DjPHB2. Successivamente, è stata analizzata la funzione di DjPHB2 sia in planarie intatte che in rigenerazione mediante la metodica dell’interferenza genica (RNAi).
I risultati ottenuti indicano che il silenziamento di DjPHB2 induce la morte delle planarie sia intatte che in rigenerazione. Mediante l’analisi dell’indice mitotico e l’utilizzo di metodiche di immunofluorescenza, ibridazione in situ whole mount e microscopia elettronica è stato dimostrato che in planarie intatte
si ha una rilevante perdita del numero di neoblasti. In particolare, si riducono i neoblasti sparsi nel parenchima e quelli accumulati in cordoni dorsali laterali, mentre rimangono quelli localizzati lungo la linea mediana dorsale del corpo dell’animale.
Se le planarie silenziate per l’espressione di DjPHB2 vengono tagliate (prima rigenerazione), gli animali sono capaci di rigenerare. Tuttavia, in questi animali si verifica una riduzione del numero dei neoblasti con una dinamica simile a quella osservata nelle planarie intatte: i neoblasti si riducono progressivamente e si ritrovano, a tempi tardivi, esclusivamente a livello della linea mediana dorsale del corpo dell’animale.
Infine, planarie silenziate per l’espressione di DjPHB2 in seconda rigenerazione presentano gravi difetti nella capacità rigenerativa: gli animali in rigenerazione posteriore non sono in grado di formare un blastema rigenerativo, mentre gli animali in rigenerazione anteriore presentano un
3 ritardo rigenerativo e anomalie morfogenetiche rispetto ai controlli. Nonostante negli animali iniettati si verifichi una drastica riduzione del numero di neoblasti, queste cellule sono sempre presenti lungo la linea mediana del corpo degli animali, anche in quelli che non sono in grado di formare un blastema rigenerativo.
In conclusione, i dati ottenuti indicano che DjPHB2 è un marcatore di neoblasti. L’analisi dei fenotipi ottenuti suggerisce che DjPHB2 sia coinvolto nel mantenimento dei neoblasti dispersi e di quelli localizzati lungo i cordoni laterali del corpo dell’animale, ma non nel mantenimento dei neoblasti presenti lungo la linea mediana, che si ritrovano sempre negli animali in cui il gene DjPHB2 è stato silenziato. Considerando che l’analisi dell’espressione
suggerisce la presenza di DjPHB2 in tutti i neoblasti, anche in quelli localizzati lungo la linea mediana, l’ipotesi più plausibile è che DjPHB2 svolga funzioni differenti in cellule diverse. Tuttavia, non è possibile escludere la presenza di una sottopopolazione di neoblasti, presenti lungo la linea mediana del corpo della planaria, che esprima DjMCM2, DjPiwi-1 ma non DjPHB2.
