3.
MATERIALI E METODI
CONTEXTUAL FEAR CONDITIONING
3.1. SOGGETTI SPERIMENTALI
Come soggetti sperimentali sono stati utilizzati ratti maschi albini, del ceppo Wistar, dell’età di circa 80 giorni, di peso corporeo medio di 340 grammi e non appartenenti alla stessa nidiata per aumentare la variabilità genetica del campione. Gli animali sono stati stabulati singolarmente in gabbie di acciaio inossidabile poste in una stanza nella quale l’illuminazione seguiva il normale ciclo luce-buio diurno, e la cui temperatura era mantenuta costante a 20 ± 1 °C. I ratti avevano sempre libero accesso al cibo e all’acqua. Gli animali sono stati divisi in due gruppi:
• un gruppo di sperimentale, costituito da animali sottoposti a contextual fear conditioning;
• un gruppo di controllo (naϊve), costituito da animali mai entrati nell’apparato di condizionamento.
3.2. APPARATO DI CONDIZIONAMENTO
L’apparato sperimentale di condizionamento da noi impiegato è stato un modello base di Skinner box (Modular Operant Cage, Coulbourn Instruments Inc). Le dimensioni di questo apparecchio erano 29 x 31 x 26 cm. Il soffitto e due lati paralleli erano di pannelli di alluminio. Gli altri due lati, di cui uno apribile, per consentire l’ingresso dell’animale,
acciaio inossidabile, connesse con un dispositivo atto a produrre scosse elettriche (Grid Floor Shocker, Coulbourn Instruments Inc., Model E13-08). L’apparato era connesso ad un sistema per programmare durata e numero degli stimoli (Scatola di comando Arco 2340 – Ugo Basile). L’apparato era posto in una cabina acusticamente isolata (3.5 x 1.8 x 2.1 m), mantenuta a una temperatura costante di 20 ± 1° C. Nella stanza l’intensità dell’illuminazione era di 60 lux.
Fig.8: Rappresentazione dell’apparato di condizionamento.
3.3. PROTOCOLLO DI CONDIZIONAMENTO ALLA PAURA
Ciascuno ratto del gruppo sperimentale è stato sottoposto al test del CFC tra le ore 10.00 e le ore 13.00 per ridurre le influenze circadiane. L’animale è stato estratto manualmente dalla gabbia di stabulazione, posto in un contenitore di plastica a pareti opache e trasportato dalla
stanza di stabulazione all’appropriata stanza acusticamente isolata. Il soggetto è stato introdotto nell’apparato di condizionamento (CS), dove veniva lasciato indisturbato per 3 minuti (vedere Fig.9(A)) . Dopo l’introduzione dell’animale nella Skinner box inizia la seduta di addestramento che dura in totale 8 minuti. Terminato il periodo di esplorazione libera, al soggetto veniva somministrato uno stimolo US consistente in una serie di 7 scosse elettriche (durata di 1 s, intensità di 1mA) intervallate 30 s l’una dall’altra (vedere Fig. 9 (B)). Dopo 2 minuti dal termine della stimolazione, gli animali veniva riportato nella propria gabbia di stabulazione (vedere Fig.9 (C)). Durante l’applicazione del protocollo di condizionamento è stato possibile osservare le risposte di freezing mediante una telecamera a circuito chiuso situata nella stanza.
Fig.9: Schema del protocollo di condizionamento utilizzato.
3.4. ISOLAMENTO E CONSERVAZIONE DEI TESSUTI
Trascorse 48 ore dal condizionamento, gli animali condizionati e i naϊve sono stati sacrificati tramite decapitazione, dopo essere stati anestetizzati con l’etere. Il cervello di questi animali è stato rimosso dalla scatola cranica, mentre, contemporaneamente a questa operazione, veniva versata sul cervello soluzione fisiologica molto fredda. La bassa
temperatura, oltre a rallentare i processi ossidativi, rende il tessuto nervoso più consistente.
Dopo essere stato rimosso dalla scatola cranica, il cervello di ciascun animale è stato posto, in condizioni sterili, su una superficie piana e sono state effettuate due dissezioni utilizzando una lametta ben affilata e sgrassata con alcool etilico al 95%. Sono state ottenute le tre sezioni: una frontale, una comprendente le strutture medio-temporali e una posteriore comprendente il cervelletto e le strutture sottostanti. Tutte le sezioni di tessuto cerebrale sono state poste in criovials e istantaneamente congelate in azoto liquido e trasferite e stoccate a -80° C. Per i successivi esperimenti di biologia molecolare abbiamo utilizzato solo le sezioni medio-temporali, poiché comprendono le strutture dell’ippocampo, dell’amigdala e le aree corticali coinvolte nei fenomeni di apprendimento e memoria in seguito a CFC.
3.5. ESTRAZIONE DELL’RNA TOTALE
L’RNA totale è stato isolato dalle sezioni medio-temporali dei cervelli di animali condizionati e dei controlli, come descritto da Traina et al. (2004). Per minimizzare la contaminazione da RNAsi, sono state utilizzate soluzioni trattate con dietilpirocarbonato (DEPC). I campioni sono stati omogeneizzati con un omogenizzatore Ultra-Turrax, immediatamente dopo essere stati immersi nel tampone GITC. L’omogenato è stato caricato su un gradiente di CsCl 5,7M. Il gradiente è stato centrifugato in ultracentrifuga Beckman L8-70M con rotore Kontron TY65 a 40.000 rpm a 20 °C per 24 ore. Il pellet è stato solubilizzato in H20DEPC e precipitato con 0,1 volumi di Sodio Acetato 3
seguito il campione è stato centrifugato a 13.000 rpm in centrifuga con rotore Kontron A8.24 per 30 minuti e il pellet lavato con Etanolo al 70% per eliminare i sali residui. L’RNA è stato quindi solubilizzato in un opportuno volume H20DEPC. I campioni sono stati conservati a -80°C per
le analisi successive. SOLUZIONI UTILIZZATE Tampone GITC: • guanidina tiocianato 4 M • sodio citrato 25 mM, pH 7,0 • β-mercaptoetanolo 0,1 M • N- lauril sarcosinato 0,5% (p/v) Cloruro di Cesio 5,7M • cloruro di cesio 5,7 M • sodio acetato 25 mM, pH 6,4
3.6. ISOLAMENTO DELL’mRNA poliA+
L’mRNA maturo e pronto per la traduzione è caratterizzato dalla poliadenilazione cioè l'aggiunta di una poliA+ ovvero una sequenza poliadenilica di circa 200 nucleotidi, in modo covalente all'estremità 3'-OH. Il poliA+ svolge una funzione molecolare importante: consente infatti l'isolamento dell'mRNA separandolo dall' rRNA e dal tRNA, molto più numerosi.
Per l'isolamento dell’mRNA poliA+ è stato usato il PolyATtract mRNA Isolation Systems (Promega). Il sistema utilizza un primer oligo(dT) biotinilato che ha la capacità di ibridare ad alta efficienza con
la regione poliA+ presente nella maggior parte dei mRNA maturi eucariotici. Gli ibridi possono poi essere recuperati usando particelle paramagnetiche (PMP) associate a streptavidina (che ha la capacità di legarsi alla biotina), ed un supporto magnetico. Circa 1 mg di RNA totale in un volume di 500 µl di H20DEPC è stato denaturato per 10 minuti
a 65°C; sono stati aggiunti 3 µl di Biotinylated Oligo(dT) Probe e 13 µl di SSC 20x (NaCl 3 M; Na-citrato 0,3 M); il tutto è stato incubato a temperatura ambiente fino a raffreddamento per permettere la reazione di appaiamento. Contemporaneamente le particelle PMP sono state lavate e sospese in SSC 0,5X ed aggiunte poi alla reazione di appaiamento lasciando incubare a temperatura ambiente per circa 10 minuti per permettere il legame tra la biotina e la streptavidina. Catturate le particelle PMP e lavate con SSC 0,1X, sono stati in seguito eluiti gli mRNA risospendendo le particelle PMP in H20DEPC e catturandole con il
magnete. La fase acquosa, contenente l’mRNA, è stata recuperata e trasferita, in una nuova provetta priva di RNAsi. L’mRNA è stato poi precipitato e sospeso in 10 µl di H20DEPC e conservata a -80°C per le
successive analsi.
3.7. CONTROLLO DELLA QUALITÀ DELL’mRNA poliA+.
Per la costruzione delle librerie sottrattive di cDNA tramite l’SSH sono stati utilizzati gli mRNA poliA+ isolati sia dai campioni sperimentali che di controllo. Per valutare che le quantità dei campioni in esame fossero paragonabili è stata effettuata una retrotrascrizione a catena della polimerasi (RT-PCR) su una piccola quantità di ciascun mRNA poliA+ utilizzando come primers quelli del gene costituitivo gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (G3PDH). Per valutare l’eventuale presenza del
RNA ribosomale è stata effettuata una RT-PCR utilizzando 3 set di primers specifici per l’rRNA di ratto (5,8 S; 18 S e 28 S), le cui sequenze sono state trovate in banca dati. La RT-PCR è una tecnica che consente di amplificare un DNA partendo da un pool di RNA di un tipo cellulare. Inoltre è una tecnica che viene sfruttata per studiare l'espressione genica in quanto è una tecnica di biologia molecolare che serve a quantificare l’mRNA e mostra se presente o assente un determinato gene nel campione da analizzare. La retrotrascrizione prevede 2 step: la retrotrascrizione dell'RNA e la successiva amplificazione tramite PCR del cDNA ottenuto.
3.8. COSTRUZIONE DELLE LIBRERIE SOPPRESSIVE SOTTRATTIVE
Per individuare sequenze di mRNA differenzialmente espresse in seguito a CFC è stato utilizzata la tecnica SSH la cui attuazione è stata resa possibile dall’impiego del PCR-Select
cDNA Subtraction Kit (BD Biosciences). Questa metodologia permette di ottenere librerie di cDNA arricchite di trascritti presenti soltanto in uno dei due campioni comparati (Diatchenko et al., 1996) e presenta la peculiarità di riuscire ad isolare anche sequenze poco espresse (Gurskaya et al., 1996). Un vantaggio dell’SSH rispetto alle tradizionali tecniche di rivelazione di sequenze differenzialmente espresse richiede piccole quantità di mRNA (1-2 µg) e il protocollo è relativamente semplice e veloce. L’SSH comprende due ibridazioni sottrattive, seguite da due reazioni di PCR. Nella Fig.10 è rappresentato in modo schematico il protocollo della SSHper la costruzione della libreria forward: ci riferiamo con il termine tester al cDNA ottenuto dall’mRNA isolato dai cervelli di ratti condizionati e con il termine driver all’cDNA ottenuto dall’mRNA isolato dai cervelli di animali naïve. Il cDNA è stato sintetizzato a partire da 2 µg di mRNA di entrambi i campioni ed è stato digerito con l’enzima di restrizione RsaI, che produce frammenti blunt-end. Il cDNA del tester è stato suddiviso in due aliquote ed a ciascuna è stato legato un diverso adattatore: 1 e 2R. Gli adattatori, mancando del gruppo fosfato al 5’, si legano solo all’estremità 5’ del cDNA. Sono seguite due ibridazioni sottrattive successive. La prima è stata effettuata aggiungendo a ciascun tester denaturato, driver denaturato in eccesso. Durante questa fase la maggior parte dei trascritti del tester non differenziali, si lega al driver e la rimanente frazione del tester, che rimane a singolo filamento risulta arricchita di sequenze differenzialmente espresse. Inoltre in questo passaggio la concentrazione delle sequenze poco e molto espresse viene normalizzata, perché, essendo la cinetica di ibridazione di secondo ordine, la riassociazione delle molecole più concentrate è più veloce. La seconda ibridazione è stata effettuata unendo, senza denaturare, i prodotti della prima ibridazione e aggiungendo driver denaturato in eccesso.
Durante questo passaggio, oltre ad arricchirsi di sequenze differenzialmente espresse, la frazione a singolo filamento del tester 1 ibriderà con la stessa frazione nel tester 2R, formando una popolazione di sequenze differenzialmente espresse a doppio filamento caratterizzate dal fatto di essere asimmetricamente fiancheggiate dai due adattatori. Questo, insieme all’effetto soppressivo, rende possibile la loro amplificazione selettiva tramite due PCR successive utilizzando come primers il NESTED primer1 e il NESTED primer2, le cui sequenze
sono complementari a quelle degli adattatori 1 e 2R (vedere tabella 2 pag.47).
Tramite la tecnica della SSH si ottengono due librerie:
• la libreria forward contenente i prodotti dei geni che sono attivati o modulati positivamente in seguito a CFC, ottenuta utilizzando come tester il cDNA ottenuto dai ratti sottoposti a CFC e come driver il cDNA ottenuto dai ratti naive;
• la libreria reverse contente i prodotti dei geni inibiti o modulati negativamente in seguito a CFC, ottenuta utilizzando come tester il cDNA naive e come driver il cDNA ottenuto dai ratti sottoposti a CFC.
Per ciascuna libreria è stata valutata l’efficienza di sottrazione per mezzo di una PCR utilizzando primers della G3PDH, gene costitutivo, come suggerito dal protocollo del PCR-Select
cDNA Subtraction Kit (BD Biosciences). Gli amplificati ottenuti dalla seconda amplificazione sono stati inseriti nel vettore di clonaggio PCR® II-TOPO vector (TOPO TA Cloning® kit, Invitrogen). I cloni sono stati recuperati in microtetraplates da 96 pozzetti contenenti 65 µl di LB A+, sono stati messi a crescere una notte in agitazione orizzontale a 37°C e, dopo l’aggiunta di 50 µl glicerolo, sono stati conservati a –20°C.3.9. SCREENING PRIMARIO DELLE LIBRERIE 3.9.1. PCR da colonia
Per ciascun clone isolato, 1 µl di colonia è stato messo a crescere per 2 ore in 50 µl di LB A+ liquido a 37°C su agitatore orizzontale. La coltura
un volume di 25 µl usando le seguenti condizioni: 1 µl della coltura è stato utilizzato come stampo, poi sono stati aggiunti 2,5 µl di tampone 10x PCR EuroClone; 0,25 µl di dNTP Mix 10 mM; 0,25 µl di Primer M13F 10 µM; 0,25µl di Primer M13R 10 µM (per le sequenze vedere tabella 2, pag. 47); 2,5 µl di soluzione 25 mM di MgCl2; 0,25 µl di
EuroTaq DNA Polymerase, 5U/µl; H2O sterile a volume. La reazione è
stata posta nel termociclizzatore (Applied Biosciences GeneAmp PCR System 2700) ed è stata iniziata l’amplificazione con la denaturazione dello stampo a 94°C per 10 minuti seguita da 30 cicli così composti: 94°C per 30 sec, 55°C per 30 sec, 72°C per 90 sec; al termine dei cicli è stata fatta seguire una estensione finale a 72°C per 10 minuti. I prodotti di PCR sono stati analizzati su gel di agarosio al 2%.
3.9.2. Spot Blot del prodotto di PCR
1 µl del prodotto di PCR di ciascun clone è stato denaturato (95oC per 1 minuti) e trasferito su membrana Hybond N+ (Amersham Biosciences). Le membrane così ottenute sono state fissate mediante Hoefer™ UVC 500 cross-linker (Amersham Biosciences). Lo screening primario, mediante la tecnica degli Spot Blot, ha permesso di eliminare i cloni falsi positivi, interpretando i risultati secondo il protocollo descritto nel PCR Select Differential Screening kit User Manual (BD Biosciences). Dopo aver individuato i cloni candidati ad essere differenzialmente espressi, si è passati all’isolamento del DNA plasmidico e quindi al sequenziamento, effettuato con sequenziatore automatico.
3.9.3. Marcatura delle sonde
Le membrane sono state ibridate utilizzando come sonde i cDNA che costituiscono le librerie forward e reverse marcate con marcatura non radioattiva, utilizzando DIG DNA Labelling Kit (ROCHE). Per la marcatura del cDNA circa 0,1-1µg del prodotto della seconda PCR sono stati digeriti con Rsa I per eliminare gli adattatori 1 e 2R da ogni sequenza di cDNA . Successivamente gli 0,1-1 µg cDNA digerito sono stati denaturati in 15 µl di H2O (100°C) e dopo averli raffreddati in
ghiaccio sono stati aggiunti: 2 µl di esanucleotidi, 2 µl di dNTP, 1 µl di Klenow. Dopo una incubazione per tutta la notte a 37°C, la reazione polimerasica è stata interrotta aggiungendo 2 µl di Na2EDTA 0,2 M (pH
8,0). Il cDNA è stato precipitato con 2,5 µl di LiCl 4 M e 75 µl di etanolo assoluto freddo; il tutto è stato lasciata per 1 ora a -80°C. Successivamente il cDNA è stato centrifugato a 12.000 g per 40 minuti a 4°C ed il pellet è stato lavato 2 volte con etanolo al 70%. Dopo i lavaggi il pellet è stato asciugato all'aria, è poi solubilizzato in 50 µl di H2O
sterile.
3.9.4 Ibridazione su filtro
La membrana è stata preibridata per circa 2 ore nell'apposito termostato (20 ml di soluzione di preibridazione per circa 100 cm2 di membrana) alla temperatura di 68°C. La sonda marcata è stata denaturata in H2O a
100°C per 10 minuti e poi posta immediatamente in ghiaccio. Successivamente è stata preparata la soluzione di ibridazione aggiungendo la sonda marcata (25 ng/ml) a una nuova soluzione di
preibridazione. Si è proceduto quindi con l’ibridazione. Nella soluzione di preibridazione e in quella di ibridazione sono stati aggiunti i “competitori”, ovvero oligonucleotidi con sequenza complementare a quella degli adattatori utilizzati per la costruzione delle librerie sottrattive ad una concentrazione finale pari a 0,1 µM. Questo è stato necessario al fine di evitare ibridazioni tra eventuali adattatori rimasti nelle sonde forward e reverse ed il cDNA in esame. La sonda è stata recuperata e le membrane sono state sottoposte ad una serie di lavaggi a diversa stringenza, in dipendenza dell'omologia della sonda e della sua composizione (% in G+C). La membrana è stata lavata due volte in SSC 2x/SDS 0,1% per 20 minuti a temperatura ambiente, in agitatore orizzontale. Poi, aumentando la stringenza, è stata lavata due volte in SSC 0,1x/SDS 0,1% per 20 minuti a 68°C, in agitatore orizzontale. Quindi è stata equilibrata per 5 minuti con il tampone 1 e incubata per 1 ora in lenta agitazione con il tampone 2. Successivamente è stata posta per 30 minuti in lenta agitazione in una soluzione contenente l'anticorpo anti-digossigenina, diluito 1:10.000 nel tampone 2. In seguito sono stati effettuati, 3 lavaggi di 15 minuti nel tampone 1 a cui è stato aggiunto Tween20 ad una concentrazione finale pari allo 0,3%; quindi la membrana è stata equilibrata per 5 minuti con il tampone 3. Utilizzando il metodo della visualizzazione chemioluminescente si è proceduto in camera oscura cospargendo la membrana, adagiata in una pellicola trasparente, con Lumigen CPD* (ROCHE) diluito 1:100 nel tampone 3 (circa 1 ml per membrane di 100 cm2). Il tutto è stato lasciato al buio per 5 minuti a temperatura ambiente, dopo di che è stata tolta la soluzione in eccesso. Sulla membrana è stata posta una lastra radiografica Hyperfilm
sviluppata e fissata con le soluzioni Kodak (seguendo le istruzioni fornite dalla ditta). SOLUZIONI UTILIZZATE: Tampone 1 • NaCl 0,15 M • Acido maleico 0,1 M
Portare a pH 7,5 con NaOH e autoclavare
Blocking stock solution
• Sciogliere il Blocking reagent della ditta nel tampone 1 Conservare a –20°C Soluzione di preibridazione • SSC 5X • Blocking reagent 1% (p/v) • SLS 0,1% (p/v) • SDS 0,02% (p/v) Tampone 2
• Blocking Stock Solution, diluita 1:10 nel tampone 1
Tampone 3 • Tris-HCl 100 mM, pH=9,5 • NaCl 100 mM SSC 20x • NaCl 3 M • Na-Citrato 0,3 M
Portare a pH 7,0 con acido citrico e autoclavare
SDS 10%
3.10. PREPARAZIONE DEL DNA PLASMIDICO SU PICCOLA SCALA
Il DNA plasmidico è stato estratto e purificato utilizzando Wizard PLUS SV Minipreps DNA Purification System (Promega).
I cloni sono stati inoculati in grainer contenenti 10 ml di LB A e fatti crescere a 37°C su agitatore rotante per una notte. Per ogni clone, 5 ml di coltura sono stati centrifugati a 10000 rpm per 5 minuti in centrifuga da tavolo ALC 4226 in un rotore ALC 5531 (questo tipo di centrifuga viene utilizzato per tutta la preparazione). Successivamente le cellule sono state risospese delicatamente in 250 µl di Cell Suspension Solution, fornita dal kit. Sono stati poi aggiunti 250 µl di Cell Lising Solution, fornita dal kit; il campione è stato delicatamente mescolato per inversione, e lasciato a temperatura ambiente per 5 minuti. Sono stati aggiunti 10 µl di Alcaline Protease Solution (fornita dal kit) e il campione è stato delicatamente mescolato per inversione e lasciato a temperatura ambiente per 5 minuti. La Alcaline Protease inattiva le endonucleasi e altre proteine rilasciate durante la lisi delle cellule batteriche che potrebbero danneggiare la qualità del DNA isolato. Al campione sono poi stati aggiunti 350 µl di Wizard Plus SV Neutralization solution (fornita dal kit) ed immediatamente il campione è stato mescolato delicatamente per inversione. Il tutto è stato centrifugato a 14.000 g per 1 minuto. Il surnatante così ottenuto è stato posto delicatamente sulle colonnine fornite nel kit e centrifugato a 14.000 g per 1 minuti. Sono stati aggiunti 750 µl di Column Wash solution, fornita dal kit, e il campione è stato centrifugato a 14.000 g per 1 minuti. La procedura di lavaggio è stata ripetuta utilizzando 250 µl di Column Wash
solution e centrifugando le colonnine a 14.000 g per 2 minuti. Le colonnine sono state poste in provette sterili dove il DNA plasmidico è stato fluito con 75 µl di H2O sterile. L’operazione è stata ripetuta una
seconda volta. L’eluito è stato quantizzato allo spettrofotometro e su gel di agarosio.
SOLUZIONI UTILIZZATE:
Ampicillina
• soluzione stock 10mg/ml solubilizzata in Etanolo 70% LB (Luria-Bertani) liquido • Triptone 1% (p/v) • Yeast extract 0,5% (p/v) • NaCl 1% (p/v) a pH 7,0 con NaOH
3.11. ANALISI DELLE SEQUENZE
Le sequenze nucleotidiche dei cloni selezionati, ottenute con sequenziamento automatico, sono state analizzate mediante comparazione in banca dati (GenBank) con i seguenti programmi disponibili in rete:
• FASTA:(http://www.ebi.ac.uk/fasta33/) • BLAST:
La traduzione delle eventuali sequenze codificanti è stata effettuata con : • ExPASy Translate Tool: (http://www.expasy.org)
Gli eventuali domini sono stati individuati con: • PROSITE : (http://www.expasy.org)
• Pfam : (http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam)
3.12. ANALISI DI ESPRESSIONE GENICA TRAMITE RT-PCR
REAL TIME
La PCR real-time, denominata anche PCR quantitativa o PCR quantitativa in tempo reale (rtq-PCR), è un metodo di amplificazione e quantificazione simultanee del DNA. I metodi comuni di quantificazione includono l'uso delle colorazioni fluorescenti che intercalano con il DNA a doppio-filamento e gli oligonucleotidi modificati del DNA (sonde) che sono flourescenti una volta ibridati con DNA. La PCR real-time è combinata con la PCR Retro Trascrizionale (RT-PCR) per quantificare i livelli di espressione di specifici RNA. La RT-PCR produce del DNA complementare a singolo filamento detto cDNA mantenendo inalterati i rapporti relativi di concentrazione delle diverse specie degli RNA. In questo modo è possibile misurare l'espressione relativa di un gene ad un tempo particolare, o in una cellula o in un tipo particolare di tessuto. Nei nostri laboratori è stato messo a punto un protocollo di PCR real-time basato sul sistema di rilevazione SYBR-Green. L’ottimizzazione di
genica di trascritti individuati in seguito allo screening delle librerie costruite tramite la tecnica dell’ SSH (vedere paragrafo 3.9.). Come materiale di partenza è stato utilizzato l’RNA totale isolato dalle sezioni medio-temporali di cervelli di ratti sottoposti a CFC e di ratti naїve come descritto nel paragrafo 3.5. Per rimuovere eventuali tracce di DNA genomico i campioni di RNA sono stati trattati con la DEOXYRIBONUCLEASE I Amplification Grade (Sigma) e successivamente quantificati tramite l’analisi spettrofluorimetrica. Per testare la qualità dell’RNA totale estratto, prima di procedere alla successiva analisi tramite la PCR real-time, è stato analizzato su gel denaturante di agarosio. Ogni reazione di sintesi del cDNA è stata eseguita a partire da 1 µg di RNA totale utilizzando iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad) in un volume finale di 20 µl in accordo con le istruzioni fornite dalla ditta. La PCR real-time è stata eseguita utilizzando il SYBR Green e il termociclizzatore MiniOpticon System (Bio-Rad). La mix finale di reazione conteneva 1 µl di cDNA, 300 nM di ciascun primer, 7,5 µl di iQ SYBER Green Supermix (Bio-Rad) e H2O
RNAse-free fino a raggiungere un volume finale di 15 µl. Le sequenze dei primers utilizzati sono mostrati in tabella 2. Come controlli negativi sono state eseguite reazioni in cui il cDNA stampo è stato sostituito da un ugual volume di acqua sterile. Tutte le reazioni sono state eseguite in triplicato. Per ciascuna reazione l’amplificazione è iniziata con la denaturazione dello stampo a 95°C per 3 minuti, seguita da 40 cicli così composti: a 95°C per 10 secondi, a 60°C per 20 secondi. Al termine di ciascuna reazione è stata eseguita la curva di dissociazione (o curva di melting) per valutare la qualità dei prodotti ottenuti. L’efficienza di amplificazione è stata valutata per ciascuna coppia di primers, ed è
risultata essere del 100% sia per i primers del clone 2VG1 che per quelli del clone 5VD5 e del 99,5% per i primers della G3PDH.
Primer utilizzati per la costruzione delle librerie
Nome Sequenza
NESTED primer 1 5’–TCGAGCGGCCGCCCGGCAGGT-3’ NESTED primer 2 5’–AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3’
Primer utilizzati per la PCR da colonia
M13 L 5’-GTTTTCCCAGTCACGAC-3’ M13 R 5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3
Primer utilizzati per la real-time PCR
Nome Sequenza Bp Efficienza
2VG1 F 5’-AGGCTTGGAGCACTTGTGAG-3’ 2VG1 R 5-GTGAACCGTTTCTGCCCTTA-3’ 148 100% 5VD5 F 5’-GCAGCCTCTCCCATCTACCT-3’ 5VD5 R 5’-ACCCTTGGGAATCATGACAG-3’ 239 100% G3PDH F 5’-CCAGTAGACTCCACGACATAC-3’ G3PDH R 5’-CTACCCACGGCAAGTTCAAC-3’ 153 99,5%
Tabella 2: Nome e sequenze dei primer utilizzati per la costruzione delle librerie, per
3.13. QUANTIZZAZIONE DEI LIVELLI DI ESPRESSIONE GENICA: METODO DEL 2-∆∆CT
La valutazione relativa dei cambiamenti nell’espressione genica è stata effettuata tramite il metodo del 2-∆∆CT normalizzando i livelli di
espressione dei geni di interesse rispetto al gene della G3PDH, il cui trascritto non varia nelle nostre condizioni sperimentali.
Come descritto da Livak e Schmittgen (2001), questo metodo permette di calcolare il ciclo della PCR in cui i segnali di amplificazione specifici sono separabili da quelli del rumore di fondo del sistema. Il numero dei cicli necessari perché un campione raggiunga il suo CT è inversamente
proporzionale al numero di copie target presente inizialmente. Il vantaggio in termini di precisione e di intervallo di quantificazione rispetto alle PCR tradizionali, è dovuto alla possibilità di quantificare il DNA al ciclo soglia, che è sempre calcolato nella fase esponenziale della reazione PCR, fase in cui i reagenti sono ancora lontani dall’esaurimento e gli elementi di variabilità sono così ridotti al minimo.
3.14. ANALISI STATISTICA
L’analisi statistica dei dati ottenuti con il metodo 2-∆∆CT (vedi paragrafo
precedente) è stata eseguita tramite l’unpaired t test. Le differenze sono state considerate significative con una p< 0.05. Per effettuare l’analisi statistica è stato usato il software PRISM (versione 4.0, Graph Pad Software Inc., San Diego, CA).
ACETIL-L-CARNITINA
3.15. SOGGETTI SPERIMENTALI E TRATTAMENTO
Ratti Wistar sani di 50 giorni, provenienti dalla stessa nidiata e cresciuti in ambiente a temperatura costante di 22°C, sono stati trattati giornalmente con iniezioni intraperitoneali di Acetil-L-Carnitina (ALC, Laboratori Sigma Tau, Pomezia, Italia; 100 mg/kg di peso corporeo) solubilizzata in soluzione salina (0,9% NaCl) per 21 giorni. Ratti di controllo sono stati trattati con equivalenti volumi di soluzione salina. Gli animali sono stati tutti sacrificati tramite decapitazione. I loro cervelli sono stati isolati in condizioni sterili a bassa temperatura e, dopo asportazione del cervelletto, sono stati immediatamente congelati in azoto liquido e conservati a –80°C per le successive analisi.
3.16. ESTRAZIONE DI PROTEINE DA TESSUTO
Le proteine totali sono state isolate sia dai cervelli di animali trattati con ALC sia da quelli di controllo. I tessuti sono stati omogeneizzati con un omogenizzatore Ultra-Turrax, immediatamente dopo essere stati immersi in 10 ml di buffer di lisi. L’omogenato proteico è stato incubato a temperatura ambiente per 1 ora e poi centrifugato a 4°C per 30 minuti a 4000 g per ottenere una divisione fisica in precipitato e surnatante. Il surnatante (contenente le proteine) è stato recuperato e trasferito in nuovi tubi sterili precedentemente raffreddati in ghiaccio. Le proteine sono state quantizzate utilizzando il Biorad Protein Assay (Bio-Rad) e
successivamente i campioni sono stati conservati a -80°C per le analisi successive. SOLUZIONIUTILIZZATE: BUFFER DI LISI • EDTA 1 mM • TRITON x-100 0,5% • NaF 5mM • Urea 6M • Na-ortovanadato attivato 1mM • Na-pirofosfato 2,5 mM
Preparazione:Sciogliere il tutto in PBS a pH pari 7,2-7,4; filtrare Ø=0,22 µm e stoccare a -20°C. Al momento dell’utilizzo per l’estrazione delle proteine aggiungere un cocktail di inibitori delle proteasi. Nei nostri esperimenti è stato utilizzato il Protease Inhibitor Cocktail for use with mammalian cell and tissue extracts (Sigma).
3.17. WESTERN BLOT
Il Western blot è una tecnica biochimica di individuazione e quantizzazione delle proteine che si serve di un elettroforesi su gel, del trasferimento delle proteine separate su filtro e della rilevazione delle proteine mediante anticorpi. Il segnale viene poi rilevato impressionando una lastra fotografica.
3.17.1. SDS-PAGE
3.17.1.1. Composizione dei gel elettroforetici
I gel di elettroforesi di 0,75 mm di spessore sono stati ottenuti facendo polimerizzare una soluzione al 12 % di acrilamide. Ad ogni gel ben polimerizzato, viene aggiunto lo stacking gel in cui vengono modellati dei pozzeti del volume di 25 µl con l’ausilio di un apposito pettinino.
3.17.1.2. Preparazione dei campioni
La separazione delle proteine prevede che queste abbiano, dopo il trattamento, acquisito una carica negativa complessiva che permette loro di essere separate solo in base alla loro dimensione. A tale scopo a ciascun campione sono stati aggiunti 5 µl di Sample Buffer 5X contenente β-mercaptoetanolo, e successivamente scaldati a 65°C per 15 minuti. Il β-mercaptoetanolo, un riducente dei gruppi disolfuro, ha lo scopo di scindere i legami disolfuro eventualmente presenti nelle proteine. L’alta temperatura ha lo scopo di facilitare la denaturazione proteica.
3.17.1.3. Separazione elettroforetica e trasferimento
Nei gel sono stati caricati 60 µg di proteine per ciascun pozzetto e un marker di peso molecolare noto per monitorare sia la corsa elettroforetica che il successivo trasferimento delle proteine su
cameretta (Bio-Rad Mini PROTEAN 3 system) contenente electrode buffer in presenza di una corrente di 200 V. Al termine della separazione elettroforetica (circa 45 minuti) sia il gel che la membrana di nitrocellusa
(Amersham Biosciencies, Milano, Italia), sono stati equilibrati nel blotting buffer. Il trasferimento è stato eseguito a 90 V per 60 minuti mantenendo la cameretta in ghiaccio per evitare il surriscaldamento del campione.
Per verificare la buona riuscita del trasferimento delle proteine dal gel alla membrana, il gel è stato colorato con Bio-Safe Coomassie e poi decolorato con metanolo al 50%; la membrana, invece, è stata colorata con rosso Ponceau per visualizzare le bande e il marker di peso molecolare.
3.18. Immunoblotting
Le membrane sono state prima sottoposta ad un rapido lavaggio in PBS e poi a tre lavaggi, ciascuno di 10 minuti, in PBS-0,05% Tween 20. Successivamente sulle membrane sono stati bloccati tutti i siti di legame che potevano interferire con il successivo legame degli anticorpi specifici per le proteine da analizzare con una soluzione contenente latte in polvere al 1% (Gogo) in (PBS–0,05% Tween 20) per 3 ore su un oscillatore orizzontale. Dopo quattro lavaggio uguali a quelli descritti precedentemente, le membrane sono state incubate a 4° C over night con gli anticorpi primari specifici opportunamente diluiti. Per la catena leggera della chinesina, l’anticorpo primario (Santa Cruz Biotechnology Inc., CA, USA) è stato diluito 1:20 in PBS-Tween20. Per la proteina basica della mielina, l’anticorpo primario (Santa Cruz Biotechnology Inc., CA, USA) è stato diluito 1:1000 in PBS-Tween20. Per la subunità D
del settore V1 della H+/ATPasi lisosomiale, l’anticorpo primario (Abnova Corporation, Taiwan) è stato diluito 1:3000 in PBS-Tween20. Per la gliceraldeidetrifosfatodeidrogenasi (G3PDH), proteina utilizzata come controllo quantitativo, l’anticorpo primario (Santa Cruz Biotechnology Inc., CA, USA ) è stato diluito 1:500 in PBS-Tween20. Dopo l’incubazione con l’anticorpo primario, le membrane sono state sottoposte ad un rapido lavaggio in PBS, a tre lavaggi in PBS-0,05% Tween20 ciascuno di 10 minuti e poi incubate con l’anticorpo secondario diluito 1:1000 in PBS-0,05% Tween 20 a temperatura ambiente per 2 ore.
3.19. Chemioluminescienza
Dopo l’incubazione con l’anticorpo secondario, le membrane sono state nuovamente lavate con PBS-0,05%Tween 20. La rilevazione delle specifiche bande proteiche è stata effettuata mediante chemioluminescenza utilizzando il Kit Super Signal West Pico Chemioluminescent Substrat (Rockford, IL, USA) seguendo le istruzioni fornite dalla ditta. Sulla membrana è stata posta una lastra radiografica Hyperfilm
β
-max (Amersham Biosciences). Successivamente la lastra radiografica è stata sviluppata e fissata con le soluzioni Kodak (seguendo le istruzioni fornite dalla ditta). Le membrane ibridate con gli anticorpi delle proteine da quantificare, sono state sottoposte a strippaggio e ibridate poi l’anticorpo per la G3PDH.3.20. Analisi statistica
Le lastre radiografiche sono state scannerizzate tramite il sistema di analisi dell’imagine UVP Image Store 5000. La densità ottica delle bande è stata misurata tramite il programma Quantity One® Software (Bio-Rad, Milano, Italia). Per quantificare l’espressione delle proteine di interesse sono stati calcolati i rapporti tra le intensità delle loro bande e quelle della G3PDH. Questo rapporto è stato calcolato per almeno quattro esperimenti indipendenti. L’analisi statistica è stata poi effettuata tramite Mann-Whitney test.
Reagenti e soluzioni utilizzati
Sample Buffer 1x: • TRIS pH6,8, 0,0625 M • SDS 2% • β-mercaptoetanolo 5% • glicerolo 10% • Blu di Bromofenolo 0,02% Resolving gel: • H2O distillata 1.6 ml • Soluzione di acrilammide (30% acrilammide e 0,8% bisacrilammide) 2 ml • TRIS-HCl pH 8,8 1,5M 1,3 ml • SDS 10% 50 µl • APS 10% 50 µl di • TEMED 2µl
Stacking Gel: • H2O distillata 550 µl • Soluzione di acrilammide (30% acrilammide e 0,8% bisacrilammide; 170 µl • TRIS-HCl pH 6,8 0,5M 260 µl • SDS 10% 10 µl • APS 10% 10 µl • TEMED 2µl Electrode buffer (1000 ml) • TRIS 3 gr • SDS 1 gr • Glicina 14,14 gr
Sciogliere inizialmente in 800 ml di H2O e poi portare a volume finale.
Blotting buffer (1000 ml)
• TRIS 3 gr
• Glicina 14,14 gr
• Metanolo 200 ml
Sciogliere i sali in H2O, aggiungere il metanolo e portare a volume.
Bio-Safe Coomassie: • Blu di Coomassie 0,02% • Metanolo 50% Soluzione si strippaggio (100 ml): • SDS 2% 20 ml • TRIS-HCl pH 6,8 0,5 M 12,5 ml
