ENZIMI DI RESTRIZIONE

ENZIMI DI RESTRIZIONE

Reazione

ligasica di

frammenti di

restrizione

DNA RICOMBINANTE: DUE MOLECOLE DI DNA VENGONO UNITE IN PROVETTA SFRUTTANDO LE PROPRIETA’ DI

ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE DI TIPO II E DELLA DNA LIGASI

CLONAGGIO

-IN BIOLOGIA CLONARE UN ORGANISMO SIGNIFICA OTTENERE UN INDIVIDUO UNA POPOLAZIONE DI ORGANISMI CHE SONO

GENETICAMENTE IDENTICI

-IN BIOLOGIA MOLECOLARE CLONARE UN TRATTO DI DNA SIGNIFICA OTTENERE UNA POPOLAZIONE DI DNA IDENTICHE ALLA MOLECOLA DI PARTENZA

Fig 4.20 separation of poly-A

mRNA

mRNA Purification

1. Total RNA Purification

2. PolyA⁺ RNA purification using oligo(dT)

mRNA

primed mRNA

mRNA/cDNA hybrid

AAAAA_n

AAAAA_n TTTTT

AAAAA_n TTTTT

Anneal oligo dT primer

Reverse Transcriptase and dNTPs

Gubler Hoffman cDNA Synthesis - 1

mRNA/cDNA hybrid

nicked RNA

AAAAA_n TTTTT

AAAAA RNase H

Gubler Hoffman cDNA Synthesis - 2

AAAAA_n TTTTT DNA Pol I

nicked RNA used

2nd strand cDNA in pieces

ds cDNA ^AAAAA_TTTTT

cDNA Library

Clone into vector E. coli DNA

Ligase

Gubler Hoffman cDNA Synthesis - 3

AAAAA TTTTT

cDNA synthesis

TTTTTTTTT

First strand

Nick translation

Vettori e clonaggio

Vettori

Plasmidi Fagi

Cosmidi

YAC

Vettori e clonaggio

Plasmide

Molecola circolare di DNA a doppio filamento, normalmente presente

nella cellula batterica, in grado di replicarsi autonomamente

dal cromosoma.

VETTORI DI CLONAGGIO

Vettori e clonaggio

Replicazione di un plasmide

INSERIMENTO DI UN TRATTO DI DNA ESOGENO IN UN VETTORE DI CLONAGGIO

CLONAGGIO:

-TRASFORMAZIONE -SELEZIONE

-CRESCITA COLONIE

IDENTIFICAZIONE DELLA COLONIA

BATTERICA DI INTERESSE

Bromo-chloro-indoyl--galactopyranosidase or X-Gal (Clear)

Bromo-chloro-indoyl (Deep blue insoluble) +

galactose

-galactosidase

Inserting chromosomal DNA into a vector

GAATTC CTTAAG

GAATTC CTTAAG GAATTC

CTTAAG

GAATTC CTTAAG GAATTC

CTTAAG Vector

Chromosome

Cut with EcoRI and add DNA ligase

Recombinant vector

Ampicillin resistant; -galactosidase negative (White on X-Gal)

Bacteria from ligation plated on ampicillin and X-Gal

Contains wild type plasmd

Contains

recombinant plasmd

Vettori e clonaggio

Vettori e clonaggio

Lunghezza massima del

DNA clonabile in un plasmide:

circa 20 Kb

Amino acid sequence

Met-Asn-Lys-Trp-Glu-Met

ATG AAT AAA TGG GAA ATG ATG AAT AAA TGG GAG ATG ATG AAT AAG TGG GAA ATG ATG AAT AAG TGG GAG ATG ATG AAC AAA TGG GAA ATG ATG AAC AAA TGG GAG ATG ATG AAC AAG TGG GAA ATG ATG AAC AAG TGG GAG ATG

Met = ATG; Asn = AAT or AAC; Lys = AAA or AAG;

Trp = TGG; Glu = GAA or GAG

How many probes must we make?

Screening the Library

ATTAGCGCCTTTACGCA

………TAATCGCGGAAATGCGT…………

Il metodo Sanger

(o metodo a terminazione di catena)

1) Il sequenziamento a terminazione di catena coinvolge la sintesi di nuovi filamenti di DNA, complementari ad uno stampo a singolo filamento

Per la sintesi del DNA si utilizzano DNA polimerasi caratterizzate da

•Elevata processività

•Bassa attività esonucleasica 5’-3’

•Bassa attività esonucleasica 3’-5’

(es. Klenow, Sequenasi)

ori Ap

BamHI Promotore/operatore

Terminatore Shine-Dalgarno

Evoluzione dei vettori d’espressione

lacI

oriC TAG

M13

Denaturazione del vettore Utilizzo di un fago helper

(1) Produzione dello stampo a filamento singolo

Utilizzo della PCR

Utilizzo di fagemidi

Il metodo Sanger

(o metodo a terminazione di catena)

2) un innesco specifico (primer)

3) La marcatura con un dNTP* marcato, di solito con ³⁵S

Nel sequenziamento a terminazione di catena la reazione oltre ad 1) Uno stampo a singola elica

ha bisogno di:

5’-A T C T T T T A G A GT A C C

3’-T A G A A A A T C T C A T G G A C T C T C T A C T A T C T A C A T G T A -5’

PRIMER DNA Polimerasi

5’-A T C T T T T A G A GT A C C T G AG*AGAT GA T AG*A

3’-T A G A A A A T C T C A T G G A C T C T C T A C T A T C T A C A T G T A -5’

DNA Polimerasi PRIMER

(2,3) Sintesi del filamento marcato

Il metodo Sanger

(o metodo a terminazione di catena)

Nel sequenziamento a terminazione di catena la reazione oltre ad 1) Uno stampo a singola elica

2) un innesco specifico (primer)

3) La marcatura con un dNTP* marcato, di solito con ³⁵S ha bisogno di:

4) una miscela di ddNTP, uno per ogni reazione di sequenza

La sintesi del filamento compementare, tuttavia non prosegue indefinitivamente, perché la miscela di reazione contiene, in quattro

distinte reazioni piccole quantità di specifici dideossinucleotidi

trifosfati, ddATP, ddTTP, ddCTP e ddGTP, che bloccano l’allungamento perché posseggono un solo atomo di idrogeno al posto del gruppo -OH in 3’

Terminazione della catena

5’-A T C T T T T A G A GT A C C T G AG*AGAT GA T AG*A

3’-T A G A A A A T C T C A T G G A C T C T C T A C T A T C T A C A T G T A -5’

DNA Polimerasi PRIMER

+ ddNTP ( per es. ddCTP)

5’-A T C T T T T A G A GT A C C T G AG*AGAT GA T AG*AT G T A^ddC

3’-T A G A A A A T C T C A T G G A C T C T C T A C T A T C T A C A T G T A -5’

STOP

Il risultato è una serie di frammenti interrotti ciascuno in corrispondenza di ogni dCTP

DNA stampo a singola elica

3’-GGCTAAC

3’-GGCTAAC

5’ 3’

Ibridazione con Il primer

+

[³⁵S]dATP+dCTP,dGTP,dTT (dNTP) +Sequenasi

ddATP, dNTP ddCTP, dNTP ddGTP, dNTP ddTTP, dNTP

-CCG ddA -ddC

-C ddC -CC ddG

-CCGATT ddG -CCGA ddT -CCGAT ddT

Sequenza: 5’-CCGATTG A C G T

-CCGATT ddG -CCGAT ddT -CCGA ddT -CCG ddA -CC ddG -C ddC -ddC

G T

T A GC C

Schema di sequenziamento a terminazione di catena

Direzione di lettura

Nuovi metodi di sequenziamento

Il sequenziamento a ciclo termico ( PCR asimmetrica) Il sequenziamento automatizzato con marcatori fluorescenti

Il sequenziamento a ciclo termico ( PCR asimettrica)

Vengono effettuate 4 rezioni di PCR, ognuna contiene un solo primer e uno dei 4 dideossi nucleotidi trifosfati. Si generano le consuete famiglie di filamenti a catena terminata che vengono risolti per elettroforesi su gel di poliacrilammide

DNA stampo

ddATP PCR con un solo primer

ddA

ddA

ddA

ddA

ddA

Il sequenziamento automatizzato con marcatori fluorescenti

Coniugando a ciascun ddNTP un diverso marcatore fluorescente, è possibile effettuare le quattro reazioni di sequenziamento in un unico tubo da saggio

e caricare il tutto in solo pozzetto di gel

ddA

ddC ddT

ddG

Le emissioni fluorescenti vengono captate da un rilevatore e le informazioni vengono integrate e trasformate in picchi di colore diverso, con aree proporzionali all’intensità di emissione.

Fluorescent DNA Sequencing

A G T A C T G G G A T C

Gel

Electrophoresis

Detection of Fluorescently Tagged DNA

DNA Fragments Separated by Electrophoresis

Output to Computer

Scanning Laser Excites

Fluorescent Dyes Optical

Detection System

Fluorescent DNA Sequencing

Data

Fluorescent DNA Sequence Trace