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Il gene dell’AR è situato sul braccio lungo del

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(1)

Fig. 5 Legame tra il recettore degli androgeni con il proprio ligando e successiva cascata di reazioni nucleari

Il gene dell’AR è situato sul braccio lungo del

cromosoma X in posizione q11-12. Gli androgeni, in

particolare il DHT, legano l’AR con alta affinità e

stimolano la trascrizione di una cascata di geni bersaglio

sensibili agli androgeni. L’attività trascrizionale del

recettore risiede nel dominio aminoterminale della

proteina, che è codificata dall’esone 1. L’esone 1 dell’AR

(2)

lunghi di ripetizioni CAG dell’AR sono stati associati con una ridotta attività trascrizionale. (8,9)

Un tratto di poliglutammine maggiore di 38 ripetizioni è

causa di un raro disordine neuromuscolare Atassia

spino-bulbare muscolare (SBMA) o Sindrome di

Kennedy, la quale è anche associata ad una diminuzione

della virilizzazione, atrofia testicolare, ridotta

produzione di spermatozoi ed infertilità. (10) Al

contrario, tratti di poliglutammine minori di 9

ripetizioni, sono state associate all’insorgenza precoce di

cancro prostatico.

(3)

Fig.6 Effetti fenotipici correlati al polimorfismo CAG.

Nieschlag 2003

Sono stati condotti ulteriori studi sul polimorfismo CAG

i quali hanno investigato la sua influenza in varie

condizioni cliniche e in parametri influenzati dall’azione

del testosterone, come la densità ossea, (11) la

spermatogenesi, (12) la variazione d’umore, le funzioni

cognitive, le condizioni pre-Alzheimer (13,14) e lo

(4)

Recentemente, Zitzmann et al. (16) hanno dimostrato che in pazienti ipogonadici in trattamento con androgeni esogeni, la velocità di crescita della prostata ed il suo volume finale, dipendono dal numero di triplette CAG con un O.R. di 8 per quelli con numero di ripetizioni CAG minore o uguale a 20. Questo è un brillante esempio di farmacogenetica, in quanto la terapia viene individualizzata sulla base di una condizione del genoma.

E’ stato infine ipotizzato un ruolo del polimorfismo

CAG nella determinazione della androgenicità di un

individuo (16).

(5)

SCOPO DELLA TESI

Lo scopo di questo lavoro è stato di valutare la

lunghezza delle ripetizioni CAG in una popolazione di

controllo di soggetti italiani “sani” ed in varie

condizioni fisiopatologiche ipoteticamente influenzate

dal recettore degli androgeni.

(6)

Materiali e metodi

Consenso informato

Per ogni paziente o soggetto volontario è stato ottenuto il consenso informato in accordo con la Legislazione Italiana.

Pazienti

Sono stati inclusi nello studio 149 soggetti italiani (razza

Caucasica) (Tab. 1). Il gruppo di controllo era costituito

da 91 soggetti fertili (tutti con prole, normale struttura

ossea e muscolare, normale sviluppo e distribuzione del

pilizio). 29 erano soggetti infertili (oltre due anni di

rapporti non protetti, spermiogramma secondo WHO

alterato) (17). L’altro gruppo era costituito da 29 soggetti

ipoandrogenizzati (ridotta peluria facciale o del corpo,

(7)
(8)

ipoplasia della prostata o delle vescicole seminali o degli epididimi, recurvatum). Tra i pazienti di quest’ultimo gruppo, nessuno aveva valori di testosterone plasmatico inferiori a 2,5 ng/ml (8,67 nmol/L) e ridotti volumi testicolari. Nei pazienti con sospetto clinico di ipoplasia prostatica o vescicolare o epididimale veniva effettuata sia l’ecografia scrotale che transrettale.

In questi stessi pazienti veniva effettuata la ricerca di possibili mutazioni o delezioni del gene CFTR.

Come riportato in tabella 1, per i 3 gruppi di soggetti

analizzati è stata valutata l’età, il peso, la distribuzione

del pelo corporeo, il volume bitesticolare e prostatico

(ecografia transrettale), il profilo ormonale e il numero

delle ripetizioni CAG e veniva effettuata l’analisi del

liquido seminale. Nei casi di severa oligospermia o

azoospermia, ai soggetti veniva richiesto il cariotipo e

l’analisi per le microdelezioni del cromosoma Y.

(9)

La distribuzione del pelo corporeo è stata effettuata in accordo con la classificazione proposta da Zitzmann et al. (18) (Femmineo=1, poco maschile=2, uomo normale=3, uomo molto mascolinizzato=4).

Analisi del liquido seminale

L’analisi del liquido seminale è stata effettuata dopo liquefazione a 37°C rispettando i criteri WHO del 1999.

(17)

Tutti i campioni seminali erano ottenuti mediante masturbazione utilizzando contenitori sterili per urine.

I pazienti dovevano osservare una astinenza dai

rapporti sessuali di minimo 3 massimo 5 giorni.

(10)

Parametri chimico-fisici

Per ogni campione esaminato venivano valutati il volume dell’eiaculato, il pH (Pehanon, Macherey-nagel MN), l’aspetto, la viscosità, il colore e la liquefazione.

Concentrazione

La concentrazione degli spermatozoi nel liquido

seminale era valutata utilizzando la camera di Makler

(Makler counting chamber, sefi-medical instrument)

osservata con l’obiettivo 20x a contrasto di fase

(microscopio ottico Nikon Eclipse E200).

(11)

Motilità

Per ogni campione, venivano prelevati 10ul di sperma ed osservati al microscopio ottico ( Nikon Eclipse E200).

Utilizzando l’obiettivo 25x per una prima osservazione globale e poi il 40x per la valutazione della motilità, venivano letti almeno tre campi per ogni goccia prelevata e venivano contate in ogni campo le cellule con moto rettilineo veloce, rettilineo lento, con motilità “ in situ” e le cellule immobili.

Morfologia

Per ogni vetrino colorato (Testsimplets, Boheringer

Manheim) era valutata la morfologia di 100 cellule

distinte in forme normali, in anomalie della testa, del

collo, del tratto intermedio e della coda.

(12)

L’indice di teratozoospermia (TZI) era ottenuto dal rapporto tra il numero di difetti (somma delle anomalie della testa, del collo e del tratto intermedio) ed il numero di spermatozoi con difetti. L’indice SDI era invece calcolato dal rapporto tra il numero di difetti ed il numero di cellule contate.

Ecografia testicolare

Le ecografie testicolari sono state effettuate utilizzando una sonda lineare da 7,5-10,0 Mhz (Esaote AU5) nel nostro Dipartimento. Il volume testicolare è stato ottenuto utilizzando la formula dell’ellissoide:

axbxcx0,52 essendo a,b,c i diametri antero-posteriore, latero-laterale e longitudinale (o sagittale) del testicolo.

La valutazione della prostata e delle vescicole seminali

era effettuata con una sonda transrettale 7,5Mhz; è stata

(13)

utilizzata la stessa formula impiegata per l’ecografia con sonda lineare. (19)

Parametri ormonali

I livelli sierici di FSH, LH, T e PRL sono stati misurati

mediante chemiluminescenza (Beckman Coulter Access

FSH, Beckman Coulter Access LH, Beckman Coulter

Access T, Beckman Coulter Access PRL, Unicel

TM

DxI

Access Immunoassay System, Beckman Coulter). I

coefficienti di variazione (%) intraassay e interassay

erano rispettivamente per l’FSH 3,3 e 5,0; per l’LH 5,1 e

6,6; per il T 2,9 e 6,2 e per la PRL 2,8 e 7,0.

(14)

Analisi genetica

Lo screening delle microdelezioni nell’intervallo 5 e 6 del cromosoma Y è stato fatto in accordo con le linee guida dell’Accademia Europea di Andrologia (EAA) (20) revisionato recentemente. (21) Sono stati analizzati i seguenti siti specifici: 84 e 86 (AZFa), 127 e 134 (AZFb), 254 e 255 (AZFc). Come controllo sono stati amplificati i geni SRY (sY14) e ZFX/ZFY. Lo screening delle mutazioni più comuni del gene CFTR (n=31) è stato condotto mediante PCR multiple.

Determinazione del numero di ripetizioni CAG

Il DNA genomico è stato estratto da linfociti di sangue

periferico usando un Kit commerciale (DNA blood mini

Kit, Quiagen, Oslo, Norway). La regione dell’esone 1 del

recettore degli androgeni codificante il tratto di

(15)

poliglutamine di lunghezza variabile è stata amplificata mediante reazione a catena della polimerasi (PCR). Sono stati impiegati i primers AR1 (5’- TGCGCGAAGTGATCCAGAAC-3’) ed AR2 (5’- GCTGTGAAGGTTGCTGTTCCTCAT-3’).

La reazione di PCR è stata fatta in un volume finale di 50 microlitri contenente 0,2-0,5 migrogrammi di DNA, Taq Buffer 10x (promega, Madison, WI, USA), Mgcl2 25 mM (Promega), dNTP 10mM (Promega) 1-25 unità di Taq polimerasi (Promega) e 50 pmol di ogni primer.

L’amplificazione è stata effettuata su macchina PTC200

(Peltier Thermal Cycler) e consiste in una denaturazione

a 94° C per 10 secondi, annealing a 60° C per 45 secondi

e un’estensione a 72° C per un totale di 35 cicli. Ogni

reazione di PCR inizia con una denaturazione a 94° C

per 2 minuti e termina con una estensione a 72° C per 10

minuti. Gli amplificati sono stati poi caricati su gel di

(16)

di purificazione commerciale (Jet Quick, Genomed, GmbH, Germany).

I prodotti amplificati sono stati sequenziali con metodo di sequenziamento diretto (BigDye Terminator Sequencing Kit, Applied Biosystem, CA, USA).

Analisi statistica

Tutte le variabili sono state verificate per una distribuzione normale con il test Kolmogorov-Smirnov.

Per comparare i tre gruppi è stata fatta un’analisi di

varianza (Anova) e laddove il p<0.05 è stato applicato il

post-hoc test (Scheffe). Infine, per comparare i parametri

clinici ed ormonali con le (CAGr)n è stata usata una

regressione multipla.

(17)

Risultati

Le caratteristiche dei tre gruppi sono mostrate nella tabella 1.

Confermando i criteri di selezione, la distribuzione del pelo corporeo era diversa negli ipoandrogenizzati rispetto ai controlli. I livelli di testosterone ed in particolare dell’FSH erano marcatamente diversi tra il gruppo di pazienti infertili e gli altri due gruppi; i livelli di LH erano diversi solo tra i pazienti infertili ed i controlli. Questo probabilmente è spiegabile con la presenza di severi danni testicolari nei pazienti infertili.

La media (± SD; SE) del numero di ripetizioni CAG era

21,5 (± 1,7; 0,1) nel gruppo di controllo, 21,4 (± 2,0; 0,3)

nel gruppo di pazienti infertili e 24,0 (±2,9; 0,5) nel

gruppo di soggetti ipoandrogenizzati. Tra l’ultimo

gruppo e gli altri due è evidente una differenza

(18)

sono differenze tra il gruppo di controllo e i pazienti infertili. Per quanto riguarda i soggetti ipoandrogenizzati, la distribuzione di frequenza mostra una tendenza significativa verso un numero più elevato di ripetizioni CAG (Fig.8). I 90° percentili negli ipoandrogenizzati, infertili e controlli erano rispettivamente 29,0, 24,0, e 23,4. Usando un punto di cut-off di 24,9 (2 SD al di sopra della media), la percentuale di pazienti con più di 25 ripetizioni CAG era il 38% nei pazienti ipoandrogenizzati, il 7% nei pazienti infertili ed il 5% nel gruppo di controllo.

Il numero di triplette CAG dei tre gruppo studiati non

correlava con nessuno dei parametri ormonali valutati

(FSH, LH, T e PRL) (tabella 2). In particolare la

lunghezza delle ripetizioni CAG non era associata con i

livelli di testosterone sierico negli ipoandrogenizzati

(Fig. 9). Sempre nell’ambito di questo gruppo è stata

trovata una correlazione inversa tra il numero di

(19)

ripetizioni CAG sia verso il volume testicolare (p=0,04) che prostatico (p=0,05).

Fig. 8 Distribuzione di frequenza del numero di

ripetizioni CAG tra 91 controlli normali, 29 maschi

ipoandrogenici e 29 pazienti infertli. Si osserva uno

spostamento verso un numero maggiore di ripetizioni

CAG nei pazienti ipoandrogenizzati rispetto al gruppo

(20)

Lunghezza CAGn Infertili

Lunghezza CAGn Ipoandrogenizzati

Lunghezza CAGn Controlli

Variabile Unità

Coeff. std P Coeff. std P Coeff. std P

Età anni 0·11 0·63 −0·1 0·62 −0·09 0·6

FSH U/l −0·12 0·69 −0·06 0·84 −0·04 0·9

LH U/l 0·12 0·9 0·25 0·43 −0·08 0·7

PRL µg/l −0·23 0·25 −0·14 0·55 0·16 0·27

T nmol/l −0·09 0·81 −0·09 0·63 −0·2 0·25

Volume

bitesticolare ml −0·31 0·24 −0·5 0·04 0·28 0·07

Volume

prostata ml −0·36 0·10 −0·44 0·05 0·17 0·2

Tab. 2 Correlazione tra la lunghezza delle ripetizioni

CAG e i parametri clinici, ormonali ed ecografici

(refressione multipla).

(21)

Fig. 9 Relazione tra i livelli di testosterone e la

lunghezza delle ripetizioni CAG del gene dell’AR nei

pazienti ipoandrogenizzati. Regressione semplice

(p=0,63)

(22)

Discussione

Studi recenti hanno sottolineato l’importanza

dell’influenza del polimorfismo dell’AR [(CAGr)n] nella

codeterminazione di alcune condizioni fisiopatologiche,

così come il metabolismo dell’osso, lo sviluppo della

prostata ed il cancro prostatico, lo sviluppo del pelo

corporeo ed i disordini neurologici (22). L’AR agisce

come un fattore di trascrizione ligando-dipendente che

media l’espressione dei geni bersaglio in risposta a

specifici ligandi. Il dominio aminoterminale è il più

variabile tra i recettori nucleari in termini di lunghezza e

sequenza. In particolare, tale dominio contiene due

regioni che contribuiscono alla transattivazione. Il

recettore completo richiede una regione primaria

localizzata tra gli aminoacidi 141 e 338 per una piena

attività trascrizionale ligando-inducibile (23,24). Questa

regione contiene un tratto polimorfico di poliglutamine

(23)

di lunghezza variabile che si estende da un minimo di 8 ad un massimo di 31 ripetizioni in individui normali, con una lunghezza media di 20 ripetizioni (25,26). Tratti di poliglutamine più lunghi risultano in una diminuzione dell’attività trascrizionale in vitro dell’AR (27,28).

La lunghezza delle ripetizioni CAG determina modificazioni di legame tra il recettore ed i propri coattivatori, fattori di trascrizione e corepressori. Il tratto di poliglutamine forma parte della interfaccia di interazione per un coattivatore del recettore degli androgeni, in particolare l’ARA24; una espansione del tratto di poliglutamine da 25 a 49 ripetizioni risulta in una riduzione di interazioni tra l’AR e l’ARA24, probabilmente tutto ciò comporta una conformazione anomala della regione aminoterminale dell’AR (29,30).

La media, la mediana e la distribuzione di frequenza

(24)

sovrapponibile alla serie di Harkonen et al. (31) nella popolazione finnica, laddove il nostro range era più ristretto (22,30). La popolazione italiana (in questo caso Italia Centrale) è comparabile alle altre popolazioni europee per quanto riguarda questo specifico aspetto genetico (32,33).

I nostri dati dimostrano per la prima volta che i tratti

ipoandrogenici, come l’ipoplasia della prostata e delle

vescicole seminali e la ridotta distribuzione del pelo

corporeo, sono caratterizzati da uno spostamento nella

distribuzione di frequenza delle (CAG)n verso una

prevalenza di ripetizioni più lunghe ad indicare che a

parità di testosterone circolante, nella nostra

popolazione di ipoandrogenizzati e nel gruppo di

controllo, gli effetti fenotipici finali androgenici sono

mediati dal polimorfismo dell’AR. Quanto affermato

potrebbe supportare l’ipotesi che non è il ligando, quale

il testosterone, a determinare l’androgenicità, ma

(25)

l’interrelazione tra l’interfaccia di poliglutamine dell’AR

ed i coattivatori , in particolare l’ARA24 (30). Il lavoro di

La Spada et al. ha mostrato una associazione tra tratti

ipoandrogenici e ripetizioni CAG molto lunghe, nel caso

di pazienti affetti dalla sindrome di Kennedy. (10)

Conclusioni simili sono state descritte recentemente

anche da Zitzmann et al. nei pazienti con sindrome di

Klinefelter (18). In questi pazienti il numero di

ripetizioni CAG molto elevato era associato con ridotta

densità ossea, incremento dell’altezza, ginecomastia e

ridotta tendenza a formare una stabile relazione di

coppia. I nostri dati hanno parzialmente confermato la

correlazione inversa tra il numero di ripetizioni CAG ed

il volume testicolare già mostrato da Zitzmann. In

presenza di normali livelli di gonadotropine e

testosterone circolanti, il volume testicolare dipende dal

numero di CAG; essendo anche il testicolo un organo

(26)

precedentemente ipotizzato da Zitzmann et al. (18). Un altro bersaglio specifico dell’azione degli androgeni, quale il volume prostatico, mostra una differenza significativa tra i pazienti ipoandrogenizzati ed i controlli. E’ probabile che questa differenza non sia dovuta alla variabile livelli sierici di testosterone, ma dipenda dal polimorfismo CAG. Il basso livello di correlazione tra il numero di CAG ed il volume prostatico nei soggetti ipoandrogenizzati probabilmente è dovuto al ridotto numero di casi analizzati. Per quanto riguarda la popolazione infertile, i nostri dati, seppur in un ridotto numero di pazienti, supportano l’ipotesi che questa condizione clinica, così eterogenea, non correli con la lunghezza delle ripetizioni CAG, come dimostrato precedentemente da Rajpert-De Meyts et al.

(34) e Thangaraj et al. (35) mentre non concorda con Tut

et al. (36). Infatti la nostra popolazione infertile mostra

una frequenza di distribuzione eterogenea (Fig.1), con

(27)

picchi a 20 e 24-25 ripetizioni CAG. E’ plausibile che all’interno di questo gruppo di pazienti, casi singoli possano essere messi in relazione con il polimorfismo dell’AR, ma ciò non sembra essere il maggior determinante dell’infertilità maschile.

In prospettiva, la determinazione del numero di

ripetizioni CAG in tutti i pazienti con malattie

andrologiche, può fornire ulteriori indicazioni delle

cause fisiopatologiche ad esse correlate. Come mostrato

da Zitzmann et al. (16) (nel lavoro sui pazienti

ipogonadici e sulla correlazione tra il volume prostatico

ed il numero di CAG), la determinazione del numero di

CAG può fornire un ulteriore informazione sulla terapia

(così come lo sono la quantità di androgeni esogeni). Per

esempio, la prescrizione di testosterone esogeno ad un

paziente con livelli sierici di testosterone ai limiti bassi o

al di sotto del range di riferimento ma con numero di

(28)

paziente trattato, in particolare può non influire sulla densità ossea o sulla disfunzione erettile e anzi dannoso a livello prostatico. Al contrario, come suggerito da Zitzmann et al. (18) il trattamento precoce di pazienti con sindrome di Klinefelter e con numero di CAG elevato, può aiutarli ad avere una adeguata androgenicità durante lo sviluppo puberale quando alcuni parametri fisiologici sono fortemente influenzati dal milieu androgenico. Lo stesso Nieschlag et al.

(Dicembre 2005) pone l’attenzione sulla importanza della determinazione del numero di ripetizioni CAG al fine di individuare la dose terapeutica individuale di testosterone esogeno (37).

(29)

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35) Thangaraj, K., Joshi, M.B., Reddy, A.G., Gupta, N.J., Chakravarty, B. & Sing, L. (2002) CAG repeat expansion in androgen receptor gene is not associated with male infertility in Indian populations. Journal of Andrology, 23, 815-818.

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37) Zitzmann, M., Gromoll, j., & Nieschlag, E.(2005) The androgen receptor CAG repeat polymorphism.

Andrologia, 37, 216

(41)

Indice

Riassunto

pag. 1

Introduzione:

Testicolo: generalità pag. 4

Biologia della spermatogenesi pag. 12 Struttura dello spermatozoo pag. 17 Funzione endocrina del testicolo pag. 22

Introduzione polimorfismo CAG:

Struttura dell’AR pag. 28

Scopo della tesi

pag. 36

Materiali e metodi:

Consenso informato pag. 37

Pazienti pag. 37 Analisi del liquido seminale:

pag. 39 Parametri chimico-fisici

pag. 40 Concentrazione pag. 40 Motilità pag. 41 Morfologia pag.41 Ecografia testicolare pag. 42

(42)

Determinazione del n° di ripetizioni CAG pag. 44 Analisi statistica pag. 46

Risultati

pag. 47

Tabella 1

pag. 50

Tabella 2

pag. 51

Discussione

pag. 53

Bibliografia

pag. 60

Ringraziamenti

pag. 74

(43)

RINGRAZIAMENTI

Desidero ringraziare il Prof. Martino ed il Prof. Macchia per avermi dato l’opportunità di realizzare questo lavoro.

Un grazie particolare va al Dott. Canale per la attenta supervisione critica e soprattutto per la disponibilità e gli utili consigli necessari alla stesura di questa tesi.

Un ringraziamento speciale va alla Dott.ssa Caglieresi, ottima collega ed amica, per la disponibilità e l’aiuto dimostratomi durante gli anni di dottorato.

Ringrazio la Dott.ssa Russo e la Dott.ssa Ultimieri per aver condiviso con me questi anni di formazione professionale.

Un grazie speciale a mio marito Mauro e alla mia

famiglia per avermi sempre sostenuta ed incoraggiata.

(44)

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