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CANALI AL POTASSIO SENSIBILI ALL’ATP
Esistono due tipi di canali al potassio sensibili all’ATP: uno situato sulla membrana del sarcolemma (sarc-KATP) e uno sulla membrana interna del mitocondrio
(mito-KATP). I canali al potassio ATP-sensibili, per la prima volta, vennero descritti da
Noma nel 1983, grazie a studi effettuati sui miociti ventricolari di alcune cavie 1. In seguito sono stati ritrovati in altri tessuti come le cellule β del pancreas, i neuroni, le cellule renali e il muscolo 2-4 sia nella membrana del sarcolemma che in quella mitocondriale. In relazione alla loro struttura, si pensa che il canale sarc-KATP
cardiaco abbia una struttura ottamerica composta da quattro subunità Kir6.2 (sottofamiglia di canali al potassio Kir6.1 e Kir6.2) e quattro subunità SUR2A 5 (recettori delle sulfoniluree SUR1, SUR2A e SUR2B), mentre il canale mito-KATP, la
cui struttura non è ancora ben nota, si pensa sia costituito da una combinazione di subunità Kir6.1, Kir6.2 e SUR2 mentre la subunità SUR1 è assente 6. Numerosi studi hanno dimostrato un legame diretto tra precondizionamento ischemico (IPC) e attivazione di canali al potassio sensibili all’ATP. Sebbene non si possa escludere che i canali sarc-KATP abbiano una loro funzione, il ruolo principale nell’IPC viene
attribuito prevalentemente all’attivazione dei canali mito-KATP 7-9. Nelle cellule del
miocardio il passaggio (gating) attraverso i canali KATP viene inibito dall’ATP e
attivato da nucleotidi difosfato intracellulari. Normalmente il canale è chiuso o inattivato, in condizioni di ischemia o stress metabolico il calo di ATP determina una sua apertura.
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Fig.1 Gating del canale KATP:
A immagine del modello molecolare del canale KATP; B Conformazione aperta e chiusa del canale.
Il canale KATP agisce come sensore e modulatore del metabolismo energetico
cellulare 10,11. L’apertura dei canali sarc-KATP accelera la ripolarizzazione della
membrana dei miocardiociti dopo la depolarizzazione, causando un accorciamento della durata del potenziale d’azione e prevenendo l’inversione dello scambiatore Na+/K+ con una conseguente inibizione dell’entrata di calcio nella cellula. Questi meccanismi portano ad una riduzione del sovraccarico di calcio e aumentano la viabilità cellulare ripostando alla normalità il bilancio domanda-offerta di energia 1. I mitocondri sono responsabili della produzione di energia attraverso la sintesi di ATP. Quando siamo in presenza di una crisi energetica, l’apertura del canale mito-KATP innesca una serie di processi come l’ulteriore estrusione di ioni H+, l’inibizione
dell’incremento di calcio intramitocondriale e la prevenzione della deplezione di fostati, creando un gradiente elettrochimico favorevole alla sintesi di ATP 12-14. Una riduzione del sovraccarico di calcio viene osservata inoltre dopo il trattamento con diazossido, una sostanza che attiva i canali KATP.
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Sebbene si possa ipotizzare un legame tra la resistenza contro il danno ischemico e l’attivazione dei canali sarc-KATP, i canali mito-KATP vengono considerati come i
principali promotori dell’effetto di cardioprotezione anti-ischemico 7-9.
a) canali sarc-KATP
La struttura ottamerica dei canali sarc-KATP è costituita da:
• subunità Kir con due aperture trans membrana che formano il poro del canale • subunità SUR che possiedono tre domini transmembrana addizionali e
contengono sul lato citoplasmatico due domini che legano i nucleotidi.
Questi domini permettono la regolazione mediata dai nucleotidi del canale al potassio e sono importanti sensori dello stato metabolico.
Sebbene tutti i canali sarc-KATP siano costituiti da otto subunità nel rapporto 4:4, la
loro precisa composizione varia in base al tipo di tessuto.
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Il coinvolgimento di questi canali nell’IPC è stato indicato dal momento che HMR 1883, bloccante dei canali sarc-KATP ritarda la caduta del potenziale d’azione e
riduce l’effetto protettivo indotto dal diazossido 15.
Nei cardiomiociti di ratti, transfettati con un frammento C-terminale della subunità SUR2A, che include l’espressione funzionale dei canali sarc-KATP, si nota un
aumento dell’ischemia indotta dal sovraccarico di calcio e l’abolizione degli effetti positivi del precondizionamento farmacologico. Sebbene queste ultime scoperte supportino un ruolo maggiore dei canali del sarcolemma, non possono però escludere il coinvolgimento dei canali mito-KATP dato che la loro struttura molecolare è ancora
poco chiara 6,16.
b) canali mito-KATP
I canali mito-KATP sono situati sulla membrana interna del mitocondrio. La loro
apertura permette l’ingresso di ioni potassio all’interno della matrice che aumenta di volume. La perdita di tali ioni viene compensata dall’antiporto K+/H+ che rimuove gli ioni K+ sfruttando il gradiente protonico.
L’apertura di questi canali provoca un’alcalinizzazione della matrice con conseguente rilascio di radicali liberi dell’ossigeno (ROS). I radicali attivano le chinasi che, con meccanismo di feedback positivo, causano l’attivazione dei canali mitocondriali 17. Per quanto riguarda la permeabilità della membrana all’ATP e all’ADP, è generalmente bassa in condizioni di normossia, perché gli scambi di energia tra mitocondrio e citosol vengono mediati dalla creatina e dalla creatina-fosfato. In condizioni di ipossia, invece, la cellula ha bisogno di apporto energetico, per cui la conduttanza della membrana esterna aumenta, la matrice si contrae e lo spazio intermembrana si espande: la creatina chinasi si dissocia dal canale e di conseguenza aumenta la permeabilità della membrana esterna 18,19. L’apertura del canale in queste condizioni induce un afflusso addizionale di ioni potassio, accompagnato dalla diffusione dell’acqua e dall’assorbimento di anioni (principalmente fosfati, ma anche cloruri) che portano ad un rigonfiamento della matrice. Questo effetto garantisce la bassa permeabilità della membrana esterna ai nucleotidi, riduce l’idrolisi dell’ATP, crea un gradiente favorevole per la sintesi dell’ATP e induce un trasferimento effettivo di energia tra mitocondrio e ATPasi: viene così migliorata la riperfusione 20. Quando il canale mito-KATP si apre,
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diminuisce la concentrazione di calcio intra-mitocondriale; per cui i livelli intracellulari di calcio risultano molto più bassi di quelli extracellulari. Per mantenere l’omeostasi quindi c’è bisogno di ATP. Durante l’ischemia, il metabolismo energetico è compromesso per cui il calcio extracellulare entra e l’aumento della concentrazione citosolica di ioni calcio viene contrastato dall’uniporto mitocondriale di calcio 21. Viene dunque favorita la formazione di pori di transizione di permeabilità mitocondriale (MitoPTP) che favoriscono il rilascio di calcio dalla matrice durante la riperfusione e innescano la via intrinseca dell’apoptosi perché rilasciano proteine pro-apoptotiche come il citocromo c. Il legame tra l’attivazione dei canali mitocondriali e i MitoPTP non è ancora ben chiaro, anche se l’attivazione farmacologica dei mito-KATP causa una fuoriuscita di calcio dal mitocondrio
precedentemente esposto a precarico e questo coinvolge l’apertura dei pori. L’apertura cardioprotettiva transitoria dei pori MitoPTP viene stimolata anche dal rialzo dei livelli di ROS probabilmente con un meccanismo di feedback positivo.
Fig.3 A livello mitocondriale, l’apertura del canale mito-KATP previene il sovraccarico di
calcio nella matrice mitocondriale. La riduzione dei livelli di calcio induce l’inibizione dei pori MPTP, importanti per la morte apoptotica della cellula.
K+
[Ca++]
MPTP
Prevention apoptosis Restoration membrane potential Reduction Ca+2 accumulation + -PKC K+ R G PLC DAG Adenosine Opioids Bradikinin sarc-KATP PKC translocase NO IPC Ca++ hyperpolarisation + + + + + K+ mito-KATP KCOs ? + NO + ROS IPC mito-KCOs + - K + [Ca++] MPTP Prevention apoptosis Restoration membrane potential Reduction Ca+2 accumulation + -K+ [Ca++] MPTP Prevention apoptosis Restoration membrane potential Reduction Ca+2 accumulation + + --PKC K+ R G PLC DAG Adenosine Opioids Bradikinin sarc-KATP PKC translocase NO IPC Ca++ hyperpolarisation + + + + + + + + + + K+ mito-KATP KCOs ? + + NO + + ROS IPC mito-KCOs ++
--7
Quindi durante la fase ischemica l’attivazione dei canali mito-KATP, attraverso la
depolarizzazione della membrana, determinerebbe la riduzione del sovraccarico di calcio nella matrice mitocondriale. Questa riduzione potrebbe prevenire la seguente apertura dei pori mitocondriali durante la riperfusione. E’ probabile dunque che l’inibizione dei MitoPTP sia il più rilevante meccanismo d’azione responsabile dell’effetto cardioprotettivo degli attivatori mito-KATP. E’ stato visto inoltre che
l’apertura dei canali mitocondriali protegge il cuore dalla fosforilazione ossidativa, e quindi dal rilascio di ROS 22,23-27 .
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PATOLOGIE CORRELATE AL CANALE KATP
I canali KATP hanno un’ampia distribuzione tissutale che permette di considerarli
come validi bersagli farmacologici per molte patologie tra cui ischemia, Parkinson ed Alzheimer.
Per di più i loro effetti benefici in anestesia, cardioprotezione e neuroprotezione confermano la loro importanza come agenti terapeutici.
Purtroppo rappresentano anche uno svantaggio nello sviluppo di una terapia, a causa della comparsa di effetti collaterali collegati alla mancanza di selettività.
Molti ligandi di questi canali vengono descritti come vasodilatatori, rilassanti della vescica, broncodilatatori e antiepilettici.
In base alla localizzazione tissutale, il canale KATP è caratterizzato da diverse
isoforme che risultano dall’assemblaggio in diverse combinazioni delle subunità SURx e Kir6.x:
SUR1 negli adipociti, nelle cellule β del pancreas e nei neuroni 28,29
SUR2A e SUR2B rispettivamente nel cuore e nelle cellule della muscolatura liscia 30
Kir6.2 nel muscolo scheletrico, nelle cellule β del pancreas, nel cervello e nel cuore 31
Kir6.1 nel muscolo liscio e negli astrociti
PANCREAS
Nella maggior parte delle cellule eccitatorie, i canali KATP sono chiusi in condizioni
fisiologiche e sono aperti quando il tessuto è metabolicamente compromesso.
L’attivazione dei canali causa l’uscita di potassio e una iperpolarizzazione cellulare, prevenendo l’ingresso di calcio attraverso i canali al calcio voltaggio-dipendenti. Questo meccanismo è coinvolto in diversi processi come: secrezione di insulina da parte delle cellule β del pancreas 32,33, rilascio di glucagone dalle cellula α 34, secrezione di somatostatina dalle cellule D 35. Nelle cellule β i canali al potassio agiscono da sensori influendo sul glucosio stimolato dalla secrezione di insulina 36. Il metabolismo del glucosio crea un aumento del rapporto ATP:ADP che riduce l’attività del canale KATP con depolarizzazione e attivazione dei canali al calcio
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voltaggio-dipendenti. I livelli di calcio aumentano e stimolano la secrezione di insulina. Per cui il mal funzionamento del canale può causare disturbi a largo spettro, legati alla secrezione di insulina 36,37. In pazienti affetti da iperinsulinismo (HI), condizione patologica caratterizzata dalla presenza in circolo di una quantità eccessiva di insulina e quindi anche da ipoglicemia, sono state trovate mutazioni che diminuiscono la corrente KATP 38. Al contrario l’aumento dell’attività dei canali
induce una iperpolarizzazione che causa il diabete. I ligandi di questi canali rappresentano dunque una potenziale cura per il trattamento di malattie correlate al danneggiamento della secrezione insulinica. Le solfoniluree vengono usate come ipoglicemizzanti orali perché bloccano i canali KATP pancreatici; mentre i KCOs
(KATP channel openers) come il diazossido sono impiegati per il controllo
dell’ipoglicemia dovuto a iperinsulinismo 39.
Fig.4 Meccanismo di liberazione dell’insulina nelle cellule β del pancreas mediato dalla chiusura dei canali KATP
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MUSCOLO LISCIO
I canali al potassio ATP sensibili sono ampiamente espressi nel muscolo liscio vascolare e viscerale 40, nel miometrio 41, nei corpi cavernosi 42 e nella prostata 43 dove modulano il tono muscolare e la contrazione di questi tessuti.
A livello bronchiale l’attivazione dei canali porta a iperpolarizzazione che induce una riduzione del tono bronchiale dovuta sia a un rilassamento diretto del muscolo liscio sia ad una inibizione indiretta della neurotrasmissione colinergica eccitatoria. Questo evento è responsabile dell’ipersecrezione di muco coinvolta nelle patologie aeree come asma e iperattività delle vie aeree 44.
I canali KATP sono espressi anche a livello della vescica e questo ha permesso l’uso
dei KCOs per limitare l’iperattività della vescica 45,46. Alcuni studi provano che il cromakalim migliora il quadro clinico della frequenza urinaria in pazienti affetti da iperattività del muscolo detrusore. La comparsa di effetti collaterali cardiovascolari ne ha però limitato l’uso 46. Sono stati studiati dei KCOs selettivi per la vescica che non influiscono quindi sui canali espressi in altri tessuti. Questi rappresentano una terapia innovativa ed efficace per trattare patologie urinarie come l’iperattività della vescica (OAB overactive bladder), disfunzione erettile e disturbi alla prostata.
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TESSUTO NERVOSO
La modulazione dell’attività del canale mito-KATP è molto importante nei
meccanismi di protezione sia cardiaca che a livello nervoso. In particolare, i mitocondri del cervello contengono un gran numero di canali mito-KATP rispetto alle
cellule del miocardio e questo indica il loro ruolo chiave nella funzionalità e integrità neuronale 47. Nei neuroni l’attivazione dei canali KATP induce una iperpolarizzazione
che inibisce il rilascio di neurotrasmettitori eccitatori come glutammato e aspartato durante l’ipossia, prevenendo quindi il danno neuronale. Attraverso la modulazione del potenziale di membrana interna al mitocondrio e la produzione di ossiradicali, l’attivazione dei mito-KATP suscita un effetto di protezione contro la citotossicità
indotta da β-amiloide nelle cellule endoteliali vascolari 48,49. L’attivazione dei canali al potassio mitocondriali può inoltre fornire una nuova strategia terapeutica per il trattamento del Parkinson. Secondo studi recenti l’iptakalim, un KCO (potassium channel operner) presenta un effetto protettivo contro l’apoptosi degli astrociti indotta dallo ione MPP+ (1-metil-4-fenilpridinio). Questo effetto è collegato alla produzione attenuata di ROS mitocondriali e all’inibizione indotta da MPP+ del rilascio di citocromo c dal mitocondrio.
Tutti questi effetti vengono antagonizzati dal bloccante selettivo dei canali mito-KATP, 5-idrossidecanoato, indicando così il ruolo importante dei canali mitocondriali
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ISCHEMIA CARDIACA E PRECONDIZIONAMENTO ISCHEMICO
L’ischemia, dal greco isch- riduzione e haima sangue, è una assenza totale o parziale di sangue in un tessuto. Nel miocardio si riferisce alla mancanza di ossigeno dovuta ad un’ostruzione a cui consegue la riduzione del flusso sanguigno. Secondo alcune statistiche su 500.000 decessi l’anno circa il 46% è dovuto a disturbi cardiaci di cui poco meno della metà possono essere attribuiti all’ischemia. Bisogna precisare la differenza tra le due forme principali di questa malattia: angina pectoris e infarto del miocardio.
L’angina pectoris è caratterizzata da una riduzione “transitoria” del flusso di sangue arterioso al cuore che comporta una scarsa ossigenazione della parte di miocardio irrorata dalle coronarie. Questo stato è definito come ischemia del miocardio. Nella maggior parte dei casi si manifesta quando un vaso è parzialmente occluso da lesione aterosclerotiche, che impediscono di soddisfare completamente le richieste di ossigeno del muscolo cardiaco.
Fig.6 Occlusione di un vaso coronarico nel cuore colpito da infarto
Nell'infarto del miocardio, invece, si ha l’occlusione dell'arteria coronarica, a cui segue un danno irreversibile della porzione di cuore interessata, con morte del tessuto corrispondente.
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I fattori di rischio che predispongono all’insorgenza della cardiopatia ischemica sembrano attribuibili a :
valori di colesterolo superiori alla norma ipertensione arteriosa
fumo di sigaretta diabete
stress
vita sedentaria.
I sintomi dell’ischemia si manifestano con dolori toracici simili ad una sensazione di peso, possono essere irradiati al collo, alle spalle e agli arti superiori, talvolta accompagnati da sudorazione fredda e svenimenti. I dolori dell’angina durano solo alcuni minuti mentre quelli dell’infarto del miocardio sono più duraturi.
Se un’occlusione prolungata, in grado di creare un danno ischemico, e' preceduta da un occlusione di qualche minuto, il miocardio risulta essere parzialmente protetto. Infatti dopo vari studi è stato visto che brevi periodi di ischemia inducono una protezione nel miocardio, che acquisisce una resistenza ad un attacco successivo più prolungato, e ne risulta una marcata diminuzione dell’entità dell’infarto. Questo meccanismo endogeno di protezione, noto come precondizionamento ischemico (IPC), si divide in due fasi:
-una prima fase che dura da 1 a 3 ore
- una fase ritardata, detta anche seconda finestra di IPC, che dura dalle 24 alle 96 ore. La protezione che dà il precondizionamento è caratterizzata da:
• una riduzione dell’aritmia da riperfusione 50
• una riduzione del metabolismo energetico durante la fase precoce dell’ischemia 51
• un miglioramento del recupero post-ischemico 52 • una protezione dell’endotelio coronarico 53.
Le molecole che si accumulano nell’interstizio durante l’ischemia, come adenosina, bradichinina, norepinefrina e oppiodi, sembrano essere responsabili di una cardioprotezione. I recettori con cui interagiscono tali agenti sono accoppiati alla fosfolipasi C 54-56, e la loro attivazione catalizza l’idrolisi di fosfatidilinositolo 4,5-difosfato (PIP2) generando secondi messaggeri inositolo 1,3,4-trifosfato (IP3) e
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diacilglicerolo (DAG) che a loro volta attivano la proteina chinasi C (PKC). Quest’ultima sembra essere proprio il mediatore centrale dell’IPC che richiede la sua traslocazione dal citosol alle proteine ancorate al citoscheletro di membrana 57-62.
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PROMOTORI, MEDIATORI ED EFFETTORI FINALI DELL’ IPC
I promotori del precondizionamento ischemico possono essere classificati in due principali categorie:
promotori recettore-dipendenti che necessitano di un legame specifico con il recettore, come adenosina, oppiodi, bradichinina, prostaglandine;
promotori recettore-indipendenti, sostanze endogene come ossido nitrico (NO), radicali liberi (ROS) e calcio che non hanno bisogno di legarsi al recettore per esplicare la loro funzione.
L’adenosina, primo mediatore identificato nell’IPC, migliora il bilancio domanda-offerta di ossigeno, inducendo la dilatazione dei vasi di resistenza e una riduzione dell’inotropismo cardiaco. Questi effetti sono mediati principalmente dai recettori A1
e A3, mentre il coinvolgimento del recettore A2 viene escluso 54,63.
Per quanto riguarda gli oppiodi, una netta rilevanza sperimentale viene attribuita ai recettori ∂ e k nei cardiomiociti, per la produzione di molecole endogene in grado di ridurre l’intensità dell’infarto 64. In particolare risultano importanti i recettori ∂1 la
cui stimolazione induce una cardioprotezione ritardata di 24 ore 65. Anche la bradichinina gioca un ruolo importante e agisce in modo sinergico con l’adenosina 57. Nei promotori recettore-indipendenti NO viene indicato come fattore endogeno coinvolto nella cardioprotezione dato che i suoi livelli aumentano durante l’ischemia; infatti l’inibizione della ossido nitrico sintetasi riduce gli effetti dell’IPC.
I mediatori principali risultano essere le proteine chinasi C attivate dalla stimolazione a proteine G, che segue l’interazione dell’adenosina con i suoi recettori. La parte finale dell’IPC, che risulta essere ancora poco chiara, è caratterizzata da una riduzione dell’accumulo di metaboliti come il lattato 51 e da una riduzione intracellulare dell’acidità che indica una diminuzione della glicolisi anaerobica. Altri effettori finali sono: scambiatore Na+ / K+ , cambiamenti del citoscheletro, down-regulation del TNFα e l’attivazione dei canali al potassio KATP espressi sulla
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RUOLO DEI MITO-KATP NELL’IPC
Il primo farmaco che evidenzia il ruolo dei canali mito-KATP nella cardioprotezione è
il nicorandil che negli anni ’80 ha mostrato un effetto protettivo contro il danno ischemico 68. Successivamente è stato introdotto il bimakalim, KATP-attivatore non
selettivo che suscita l’effetto protettivo sul cuore sia a basse dosi, che non influenzano la durata del potenziale d’azione, sia ad alte dosi; questi risultati indicano la presenza di un sito intracellulare responsabile della cardioprotezione indipendente dalla riduzione della durata del potenziale 69. Risultati simili sono stati ottenuti con un altro attivatore non selettivo, il cromakalim 70-72. La prima prova diretta del coinvolgimento dei canali mito-KATP riguarda il diazossido che, a
concentrazioni più basse di quelle necessarie per indurre l’apertura dei canali sarc-KATP induce l’apertura dei canali mitocondriali. Gli effetti del diazossido e del
cromakalim vengono antagonizzati non solo da glibenclamide ma anche dal 5-idrossidecanoato, bloccante selettivo dei canali mito-KATP.
E’ stato osservato che il diazossido attiva il canale mitocondriale al potassio e il 5-HD blocca i suoi effetti. Inoltre il nicorandil, agonista dei canali KATP, apre con una
potenza dieci volte maggiore il canale mitocondriale rispetto al canale del sarcolemma 73.
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Meccanismi coinvolti nella fase acuta di IPC, indotti dai canali mito-KATP
L’attivazione e la traslocazione di isoforme specifiche della PKC sembra avere un ruolo centrale per l’apertura dei canali mito-KATP. La protezione indotta attraverso
l’apertura dei canali mitocondriali potrebbe essere abolita dagli antagonisti della PKC e la protezione mediata dall’attivazione della PKC potrebbe essere inibita dai bloccanti dei mito-KATP: pertanto PKC e i canali mito-KATP sono entrambi necessari
e codipendenti per l’effetto protettivo 74. Studi successivi hanno evidenziato che la proteina chinasi è a monte dall’attivazione dei canali mitocondriali, dato che glibenclamide e 5-idrossidecanoato attenuano il precondizionamento mediato dalla PKC 75. Inoltre il pretrattamento con diazossido riduce l’entità dell’infarto senza accelerare la traslocazione della PKC e il 5-HD elimina gli effetti del precondizionamento senza bloccare la traslocazione della PKC 76,77.
Risultati controversi sono osservabili anche sulle interazioni tra i canali mito-KATP e
la proteina chinasi p38 attivata da mitogeni (MAPK): l’apertura dei mito-KATP
sembra essere conseguente all’attivazione della proteina p38, anche se altri dati sperimentali evidenziano il contrario 78,79.
Un altro meccanismo importante coinvolge l’ossido nitrico: questo migliora l’apertura dei canali mitocondriali; infatti il diazossido induce entrambe le fasi del precondizionamento ischemico attraverso una via NO-dipendente.
Per quanto riguarda le specie reattive dell’ossigeno, da un lato le generazioni di ROS sembrano essenziali per l’effetto cardioprotettivo, perché attivano la cascata della proteina chinasi C e incrementano le probabilità di apertura del canale; dall’altro il rilascio di ROS favorisce l’apertura dei pori MitoPTP durante la fase di riperfusione
80
. Sebbene l’apertura di questi pori porti a morte cellulare per apoptosi, il rilascio di specie reattive dell’ossigeno e l’apertura transitoria dei MitoPTP sono molto importanti sia come promotori di IPC che per l’effetto protettivo sul cuore. L’apertura transitoria dei pori ad uno stato di bassa conduttanza evita il precarico di calcio, prevendendo così l’attivazione sostenuta e dannosa dei MitoPTP indotta da calcio 81.
Studi sui mitoplasti hanno reso possibile ipotizzare la presenza di un ulteriore tipo di canale al potassio sulla membrana interna del mitocondrio. Questi canali sono attivati dal calcio a grande conduttanza e sono voltaggio-dipendenti (BKCa) 82. Sebbene non
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mitocondrio, la loro presenza viene confermata con un attivatore NS1619, in grado di conferire cardioprotezione associata ad una riduzione dell’infarto. Infatti la Paxillina, bloccante dei canali BKCa inibisce questo effetto protettivo 83,84. Nuovi studi
dimostrano che NS1619 riduce il sovraccarico di calcio, stimola la proteina chinasi A e di conseguenza si dimostra cardioprotettivo. L’effetto è analogo a quello del diazossido ma indipendente da esso; la paxillina antagonizza gli effetti del NS1619 e il 5-HD antagonizza l’azione del diazossido ma non il contrario 85.
Tutti questi risultati indicano quindi il coinvolgimento dei canali mito-KATP e BKCa
nel meccanismo di protezione, la loro apertura depolarizza il potenziale di membrana mitocondriale e riduce l’afflusso di calcio all’interno del mitocondrio.
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KCOs : ATTIVATORI DEI CANALI AL POTASSIO ATP-SENSIBILI
Lo strumento più importante per identificare le funzioni dei canali KATP cardiaci e
per studiare il ruolo dei mito-KATP e dei sarc-KATP nel precondizionamento
ischemico, è rappresentato dall’uso di attivatori e bloccanti dei canali KATP; tuttavia
le sostanze che aprono i canali mitocondriali nelle cellule cardiache e nella muscolatura liscia dei vasi, agiscono anche sui canali del sarcolemma: questa azione è responsabile della vasodilatazione periferica e della riduzione della durata del potenziale d’azione.
E’ stato dimostrato che le caratteristiche cardioprotettive dei KATP openers sono
indipendenti dall’attività di vasodilatazione, perciò l’interesse dei ricercatori è rivolto alla sintesi di KCOs privi dell’attività sui sarc-KATP.
Considerando l’ampia distribuzione di questi canali, le sostanze che vi si legano possiedono un ampio potenziale terapeutico. Possono essere utili in patologie quali asma, incontinenza urinaria, ipertensione, ischemia cardiaca e patologie del sistema nervoso centrale. Attraverso l’attivazione dei canali KATP presinaptici, i neuroni
vengono protetti dall’ipereccitazione e dall’eccessivo rilascio di neurotrasmettitore. I canali vengono quindi considerati come neuroprotettori endogeni nell’epilessia e nell’ischemia cerebrale 86.
Studi recenti suggeriscono un possibile ruolo dei KCOs come analgesici nel trattamento del dolore cronico e nella gestione della sindrome di astinenza indotta da morfina 87. L’effetto antinocicettivo viene mediato dal rilascio di endorfine e encefaline e dall’attivazione di recettori oppiodi. L’antinocicezione indotta dalla morfina viene antagonizzata dalla glibenclamide, bloccante dei KATP e potenziata
dall’uso di due KCOs, cromakalim e diazossido. La glibenclamide inoltre abolisce il potenziamento dell’effetto antinocicettivo dei KCOs. Questi risultati supportano il ruolo dei canali KATP nell’antinocicezione indotta da morfina 88.
Un altro potenziale campo terapeutico per gli attivatori dei canali KATP è il
trattamento dell’obesità. I sarc-KATP controllano la spesa di energia non solo durante
condizioni di stress metabolico ma anche in condizioni normali. La modulazione dei canali al potassio porta ad un’ottimizzazione dell’energia e può quindi fornire un valido aiuto per il controllo
21
del peso. Studi recenti supportano l’esistenza di una stretta correlazione tra l’attività dei mito-KATP e i livelli di colesterolo, questo potrebbe rappresentare un nuovo
bersaglio per lo sviluppo di ligandi utili per il trattamento di malattie metaboliche.
STRUTTURA E MECCANISMO D’AZIONE DEI KCOs
Tra i KATP “openers” di prima generazione, il cromakalim, sintetizzato nel 1980 e
sottoposto a modifiche strutturali, rappresenta il prototipo della classe dei benzopirani. Sebbene sia privo di selettività verso i canali mito-KATP, viene usato
come sostanza cardioprotettiva per approcci sperimentali; è responsabile di una marcata vasodilatazione e una riduzione della durata del potenziale d’azione (ADP)
89 . O NC N O OH cromakalim
Il pinacidil e i suoi derivati cicloguanidinici sono stati sviluppati da una serie di N-alchil-N’-piridiltiouree con proprietà antiipertensive 90.
Il derivato più potente è il P-1075; si lega con alta affinità alle subunità SUR2A e SUR2B e di conseguenza è proposto come attivatore dei canali sarc-KATP. Questo
composto riduce la disfunzione contrattile e il sovraccarico di calcio nei miociti dopo inibizione metabolica.
Gli effetti del P-1075 vengono completamente invertiti dalla glibenclamide ma non dal 5-idrossidecanoato 91. N N NH CN N H t-Bu N NH N CN N H pinacidil P-1075
22
Nicorandil è il primo composto rappresentativo della classe dei piridilnitrati. La sua azione è dovuta principalmente alle proprietà di donatore di N-ossido 89.
Da una parte il nicorandil aumenta la fluorescenza della flavoproteina, dall’altra il suo effetto cardioprotettivo risulta sensibile a HMR 1098 (bloccante dei sarc-KATP) 86,92 . N NH O ONO2 nicorandil
Il diazossido, prototipo della classe delle benzotiazine è capace di aprire i canali mito-KATP con una buona selettività, senza interagire con i canali sarc-KATP 69.
Questo composto viene generalmente usato a basse dosi per rilevare il coinvolgimento dei mito-KATP nel precondizionamento ischemico; tuttavia attiva
anche le isoforme del canale KATP endoteliale e del muscolo liscio e debolmente
attiva i canali sarc-KATP cardiaci 93,94.
Studi recenti dimostrano che il trattamento con diazossido può aumentare la probabilità di apertura dei canali sarc-KATP durante l’inibizione metabolica: questo
effetto non è necessariamente dovuto ad un’azione diretta sul canale ma molto probabilmente al disaccoppiamento mitocondriale o all’inibizione della succinato-deidrogenasi 15,95,96.
Il diazossido è l’unico KATP opener che si lega con analoga affinità alle subunità
SUR1 e SUR2b ed è responsabile sia della risposta di vasodilatazione sia dell’inibizione della secrezione di insulina. Di conseguenza l’uso a lungo termine di questa benzotiazina è collegato a effetti ipoglicemici 97,98.
Cl N N H S O O diazossido
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BLOCCANTI DEI CANALI KATP
Tra i bloccanti dei canali KATP, HMR 1098 mostra selettività verso i sarc-KATP e
antagonizza gli effetti del P-1075. Questo bloccante causa un accorciamento della durata del potenziale d’azione con un IC50 di 37nM e la sua azione è sensibile alla glibenclamide. NH S NH NH Cl OMe O OMe O O O HMR 1075
PNU-99963 e PNU-94750 sono derivati cianoguanidinici che mostrano interessanti proprietà di bloccanti dei canali KATP99.
Cl NH N CN N H N N NH N CN N H PNU-99963 PNU-94750
Glibenclamide viene generalmente usata come bloccante dei canali KATP e per
dimostrare la selettività. Questa solfonilurea mostra proprietà bloccanti verso le subunità SUR1 (espresse a livello del pancreas)
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ATTIVATORI SELETTIVI DEI CANALI MITO-KATP
Sono stati sviluppati alcuni composti ibridi tra l’anello benzopiranico e le catene cicloguanidiche, per migliorare la selettività cardiaca dei KCOs 89,100.
Il BMS 180448, primo di questa classe, è caratterizzato da una scarsa azione vasodilatante anche se conserva comunque l’azione di protezione sul cuore 100. Questo composto migliora gli indici dell’attività antiischemica allo stesso modo del cromakalim aumentando la riperfusione e il ripristino della funzionalità contrattile, incrementando il tempo di contrazione (definito come il tempo necessario durante l’ischemia per aumentare la pressione diastolica di 5 mmHg) e diminuendo il rilascio di lattato-deidrogenasi. Questi effetti vengono aboliti dal trattamento con gliburide. Inoltre il cromakalim produce un aumento significativo del flusso coronarico mentre riduce la durata del potenziale d’azione e l’intervallo QT. Il BMS 180449 non influenza tali parametri 70-72.
NH NH O NC OH N NC Cl BMS 180448
Per ridurre la rimanente azione vasodilatante del BMS 180449 sono stati sintetizzati derivati del benzopirano 4-(N-aril)-sostituiti e il composto con la maggiore potenza anti ischemica e selettività cardiaca è il BMS 191095 circa 30 volte più selettivo del primo derivato 101.
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O
OH
N NH Cl
BMS 191095
La caratterizzazione farmacologica in vitro di questo composto rivela un’attività cardioprotettiva sensibile al 5-HD e alla gliburide; migliora la funzione cardiaca post-ischemica, diminuisce il rilascio di LDH e aumenta il tempo di contrazione. Inoltre mostra anche un modesto effetto sulla durata d’azione del potenziale, sull’intervallo QT e una bassa azione vasodilatante. E’ stato osservato grazie a studi sperimentali che il BMS 191095 induce l’apertura dei canali KATP mitocondriali e
che sia la glibenclamide che il 5-HD inibiscono la sua attività 101.
Sfortunatamente non può essere sottoposto ad ulteriori studi per l’uso clinico per via della tossicità neuronale, rimane comunque uno strumento di interesse farmacologico
102
.
Recentemente sono stati scoperti altri derivati benzopiranici indolo-sostituiti e in particolare è stata osservata l’attività farmacologica degli esteri etilici dell’acido 6-nitro-benzopiranil-indolin-2-carbossilico. Il derivato bepiridil, anche se è un bloccante dei canali sarc-KATP cardiaci induce un effetto protettivo antiischemico che
viene antagonizzato dal 5-HD 103.
N
BuO N
