INTRODUZIONE GENERALE

2 Il cancro è un disturbo della crescita e del comportamento della cellula che perde la capacità di regolare e controllare la sopravvivenza, la crescita e la proliferazione determinando l’acquisizione di un potenziale replicativo illimitato. Questo è dovuto essenzialmente ad un’autosufficienza dei segnali di crescita, all’insensibilità ai segnali di inibizione della crescita, all’evasione dall’apoptosi, ad un deficit nella riparazione del DNA, all’angiogenesi protratta, alla capacità di invasione e di formazione delle metastasi.

Il passaggio da cellula normale sana, non cancerogena, a cellula cancerogena è scandito da vari passaggi. La prima fase prevede frequentemente l’esposizione della cellula sana ad agenti ambientali quali composti chimici, radiazioni, virus, in grado di danneggiare il DNA, determinando una mutazione nel genoma. A seguito di questa alterazione si verifica uno squilibrio fra le capacità proliferative e quelle apoptotiche. L’aumento della proliferazione cellulare va a sua volta ad indurre la formazione di una massa tumorale caratterizzata da invasività e capacità di dare metastasi.1

Le mutazioni a carico del DNA che determinano il passaggio da cellula sana a cellula cancerogena sono quelle che avvengono a carico dei geni proto-oncogeni e dei geni oncosoppressori.

I geni proto-oncogeni (ad esempio proteine Ras) sono noti come regolatori fisiologici della proliferazione e della differenziazione cellulare, e basta che un solo allele vada incontro a mutazione affinché si abbia trasformazione del proto-oncogene in oncogene, il quale promuove una crescita autonoma della cellula e quindi la trasformazione in cellula neoplastica(mutazione dominante).

Gli onco-soppressori (ad esempio p53 o PTEN, Tumor Suppressor Phosphatase and Tensin homolog) sono invece geni che regolano in senso negativo la crescita cellulare e la cui mutazione determina il venir meno di un freno alla duplicazione e con conseguente proliferazione incontrollata; affinchè tali geni vengano inattivati è necessario che entrambi gli alleli vadano incontro a mutazione (mutazione recessiva).2 I proto-oncogeni codificano per proteine dette oncoproteine, le quali garantiscono alla cellula l’autosufficienza per la loro crescita; un esempio particolarmente importante di oncogene-oncoproteina è quello delle protein chinasi. Tale classe proteica può essere suddivisa a sua volta in: tirosin chinasi e serin-treonin chinasi. A quest’ultima classe appartengono sia la famiglia delle AGC (protein chinasi cAMP, cCMP, cGMP dipendenti) che delle MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinase). La famiglia delle AGC include chinasi quali PKA (cyclic AMP-dependent Protein Kinase), PKC

(Ca2+-3 activated Protein Kinase), PDK1 (Phosphoinositide Dependent protein Kinase-1) e PKB (Protein Kinase B) anche detta Akt, le quali sono tutte attivate da secondi messaggeri prodotti da RTK (Receptor Tyrosine Kinase) e da GPCR (G Protein-Coupled Receptors).

La famiglia delle MAPK chinasi comprende invece numerose altre proteine (RAF, ERK,etc) che rispondono alla proteina RAS, proteina G attivata dalle proteine mitogene.

In molte forme tumorali si è osservato che questi due tipi di chinasi, sia quelle della famiglia AGC che MAPK, vanno incontro sia a mutazioni nella forma costitutivamente attiva sia ad un’ iper-espressione; è partendo da queste conoscenze che la ricerca ha approfondito lo studio di inibitori delle protein chinasi come possibili farmaci da impiegare nel trattamento farmacologico anti-tumorale sia da soli o in associazione ad un altro chemioterapico.

Con tali presupposti potrebbe quindi rivelarsi utile individuare molecole in grado di bloccare il segnale degenerato del pathway di PI3K (PhosphoInositide 3-Kinase), al fine di inibire la crescita tumorale e le capacità metastatiche del tumore.

In particolare un’attivazione anormale del segnale indotto da PI3K è stata ritrovata in diverse forme di cancro. Tale squilibrio è infatti la causa dell’iperattivazione di molti processi intracellulari, controllati da enzimi coinvolti nella regolazione di sopravvivenza, crescita, proliferazione e migrazione cellulare.

Studi approfonditi su questo pathway hanno dimostrato che i due enzimi chiave nella trasduzione di questo segnale degenerato sono PKB, protein chinasi B (nota anche come Akt), e PLCɣ1 (Phospho Lipase C) la prima è responsabile della fosforilazione di vari enzimi che portano alla proliferazione cellulare, la seconda è invece coinvolta nell’angiogenesi e nella metastatizzazione del tumore.

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MECCANISMO DI ATTIVAZIONE DEL PATHWAY

L’attivazione di PI3K è determinata dalla stimolazione del recettore RTK (Receptor Tyrosine Kinase) da parte di ligandi specifici, quali ad esempio insulina e fattori di crescita; la formazione del complesso ligando-recettore provoca la dimerizzazione del recettore RTK e l’auto-fosforilazione dei residui di serina nella porzione citoplasmatica. Il complesso PI3K (p85-p110) viene reclutato e l’interazione della subunità regolatoria (p85) con i residui di tirosina fosforilati del recettore causa l’attivazione della subunità catalitica (p110), con conseguente formazione del PIP3 nella regione intracellulare. PIP3 determina poi il reclutamento presso la membrana degli enzimi che presentano il dominio di legame PH (Pleckstrin Homology) specifico per il suddetto fosfolipide, fra cui PDK1, Akt e PLCɣ1, regolandone l’attività.

In cellule tumorali provenienti dal colon, polmone, prostata, fegato e cervello sono state rilevate mutazioni a carico del gene PI3KA che codifica per p110α, la subunità catalitica delle chinasi di classe I. Tale gene, oltre ad essere coinvolto nei processi di regolazione del ciclo cellulare e della crescita, acquisisce un ruolo persino più importante a carico delle cellule endoteliali garantendo al tumore l’angiogenesi e quindi la costruzione di un tessuto di irrorazione ad hoc sia per fini nutrizionali che per garantire una via di espansione lontana dalla lesione primaria.

È stato rilevato che in circa il 50% delle cellule tumorali di tessuti, quali polmone, stomaco, prostata, apparato ematopoietico e ovario, si verificano mutazioni a carico dei geni che regolano PI3K.

In condizioni fisiologiche la produzione di PIP3 è finemente regolata da due enzimi che lavorano in direzioni opposte: PI3K e PTEN. La chinasi catalizza la formazione del PIP3 (PhosphatidylInositol (3-4-5) trisPhosphate) a partire da PIP2 (Phosphatidylinositol (4-5) bisphosphate) fosfolipide di membrana che svolge un ruolo centrale nella trasduzione del segnale (Figura 1).

5 Figura 1: Rappresentazione schematica dell’attività di PI3K e PTEN.

PI3K

PI3K è una famiglia di enzimi costituita da otto isoforme raggruppate in quattro classi (Ia, Ib, II e III) in base all’ omologia di sequenza e alla specificità di substrato; la classe di maggiore interesse è la classe I.

Le chinasi appartenenti alla classe I sono proteine eterodimere che catalizzano il trasferimento di un gruppo fosforico dall’ATP sul gruppo ossidrilico 3’ dell’anello D del fosfatidilinositolo (4-5) bifosfato (PIP2) portando alla formazione del fosfatidil-inositolo (3-4-5) trifosfato (PIP3), il quale svolge funzione di ligando nel reclutamento di proteine con dominio Pleckstrin Homology (PH) sulla faccia interna della membrana cellulare.

Questa classe di chinasi è ulteriormente suddivisa in sottoclassi:

1- Chinasi di classe IA, attivate da recettori protein tirosin chinasi e costituite da una subunità regolatoria p85α, p85β o p55ɣ che si unisce a quella catalitica rispettivamente p110α, p110β o p110δ a dare il caratteristico eterodimero. I geni che portano l’informazione per la subunità catalitica sono: PI3KCA, PI3KCB e PI3KCD.

2- Chinasi di classe IB, le quali invece sono attivate da recettori accoppiati a proteine G e sono costituite da un'unica subunità catalitica p110ɣ e da una subunità regolatoria, p84 o p101ɣ (Figura 2).

6 Figura 2: Rappresentazione dei diversi meccanismi PI3K delle classi IA e IB.

Le altre chinasi sono quelle di classe II, cui appartengono le forme monomeriche PI3KC2α, β e ɣ, e quelle di classe III, eterodimeri formati anch’esse da una subunità regolatrice ed catalitica.3-4

PI3K α e β sono ubiquitariamente espresse ed hanno un ruolo centrale nella crescita, sopravvivenza e proliferazione cellulare e rappresentano quindi dei bersagli target di farmaci antineoplastici.

Per quanto riguarda le isoforme PI3K ɣ e δ queste svolgono un ruolo cruciale a livello del sistema ematopoietico e sono target farmacologico nelle malattie autoimmuni e disordini infiammatori.5

PTEN

L’enzima PTEN è una fosfatasi lipidica non riduttiva connessa con il pathway oncogeno PI3K-Akt. Questa chinasi defosforila la posizione 3 dell’anello inositolico del PIP3 convertendolo in PIP2: non è altro quindi che l’enzima antagonista di PI3K e modulatore negativo del pathway PIP3K/PDK1/Akt.

La proteina umana PTEN è costituita da 403 amminoacidi e in essa sono individuabili due domini funzionali maggiori (un dominio fosfatasico e un C2 dominio) e tre regioni strutturali (un piccolo dominio N-terminale legante il fosfatidil inositolo 4,5- bifosfato, una sequenza C- terminale, un motivo di interazione con PDZ (PSD95/Dlg/ZO1).6 La funzione tumore soppressiva di PTEN viene meno in seguito a due mutazioni sul dominio fosfatasico: una comporta la perdita dell’attività fosfatasica sia sui lipidi che sulle proteine e l’altra che compromette l’ attività fosfatasica sui soli substrati proteici. Oltre al ruolo nella regolazione della progressione del tumore PI3K-Akt, PTEN ha molti altri ruoli critici in vari aspetti della proliferazione del cancro quali: instabilità genomica, rinnovo delle cellule tumorali, senescenza cellulare, migrazione cellulare e

7 metastasi. PTEN riduce i livelli intracellulari di PIP3 cellulare il quale è critico per la proliferazione, la crescita e l’angiogenesi.7

Infine PTEN ha un ruolo significativo nella regolazione delle microcondizioni ambientali adatte per la crescita del tumore.

PDK1

PDK1 è una proteina ad attività chinasica implicata nel controllo della crescita, della proliferazione, della sopravvivenza e del metabolismo cellulare e appartiene alle famiglia delle AGC chinasi. Le proteine AGC chinasi sono composte da serin e treonin chinasi che mostrano una sequenza del proprio dominio catalitico omologamente correlata a PKA, PKG e PKC; il piccolo lobo ammino-terminale ed il grande dominio carbossi-terminale attaccano una molecola di ATP essenziale per la fosforilazione del substrato. Molte di queste AGC-chinasi possiedono due siti di fosforilazione che regolano la loro attivazione: il loop di attivazione che è localizzato all’interno del dominio chinasi e il sito idrofobico localizzato nella regione adiacente al dominio catalitico. La fosforilazione di entrambi questi siti incrementa l’attività chinasica e garantisce la piena attività all’enzima.

PDK1 è stata scoperta nel 1997 ed è stato subito chiaro essere la chinasi responsabile della fosforilazione attivante di Akt. Da allora è stato scoperto che essa è deputata alla fosforilazione dei propri substrati: PKB (protein kinase B)/Akt, p70, S6K (ribosomial S6 kinase), SGK (Serum and Glucocorticoid-inducible Kinase) ed è solo in tempi più recenti che si sa essere anche attivatrice di PLCɣ1(Phospholipase C gamma 1).8

Recenti studi hanno dimostrato che PDK1 rappresenta un punto di raccordo fra due pathway: PI3K/ PDK1/ Akt e PI3K/ PDK1/ PLCɣ1 entrambi coinvolti nel cancro. In particolare il primo svolge un ruolo centrale nella proliferazione cellulare mentre l’altro è causa della metastatizzazione del tumore; l’interesse oggi della ricerca è quindi di ottenere un buon inibitore di PDK1in grado di inibire entrambi i pathway iper-attivati nelle cellule tumorali.

8 STRUTTURA

PDK1 ha un peso molecolare 63 kDa ed è costituita da 556 amminoacidi che vanno a formare (figura 3):

 Un dominio PH C-terminale, di sequenza amminoacidica 459-550, deputato al legame con il PIP3 e quindi responsabile del reclutamento dell’enzima PDK1 in prossimità della membrana. Questo dominio è fondamentale per l’attivazione di Akt ma non per quella degli altri substrati di PDK1: in assenza del dominio PH, PDK1 perde la capacità di fosforilare Akt ma mantiene la capacità di fosforilare S6K, SGK etc.; questo implica che il legame di PDK1 al PIP3 induce un cambiamento conformazionale necessario per l’attivazione del substrato Akt ma non indispensabile per la fosforilazione degli altri substrati.

 Un dominio o nucleo catalitico, di sequenza amminoacidica 71-359, in cui si individuano un piccolo lobo N- terminale, avente un ripiegamento conformazionale a foglietti-β, dove si può individuare la cosidetta HingeRegion (HR), e un grosso lobo C-terminale caratterizzato da una struttura ad α-elica (Figura 3). Contrariamente a quanto ci si potrebbe aspettare, nonostante PDK1 appartenga alla famiglia delle AG chinasi, PDK1 non possiede un motivo idrofobico (HM) C-terminale caratteristico della famiglia di appartenenza nel suo dominio catalitico, ma è stato proposto che possieda un HM pocket nel piccolo lobo.9

9 L’ α C-elica (residui 124-136), situata nel lobo piccolo del dominio chinasico, è un dominio chiave nella regolazione perché presenta un sito di interazione con il substrato (HM pocket); amminoacido fondamentale in questo sito è la Ser241, situata nel loop di attivazione.

Il motivo idrofobico HM presente nel dominio chinasico di PDK1 fu definito PIF pocket (PDK1 interacting fragment) dopo la scoperta che la parte C terminale di PKC, che contiene il motivo HM, interagisce con il dominio chinasico di PDK1. Esso funziona come una piattaforma che abilita la chinasi ad interagire con alcuni dei propri substrati fisiologici.

La struttura cristallina di PDK1 rivela che la fosforilazione della Ser241 è coinvolta nella formazione dei legami ad idrogeno con quattro residui: Arg204 e Lys228 dal lobo C-terminale e la Tyr126 e Arg129 dall’α-elica nel lobo N-terminale. L’Arginina altamente conservata in 204, che immediatamente precede Arg205 nel sito catalitico, ricopre un ruolo importante nel sistema catalitico: Arg204 controlla il ripiegamento del loop di attivazione dopo l’interazione con la fosforilazione della Ser241. Altri studi inoltre evidenziano che Lys228 svolge ruolo chiave nell’allineamento dei residui nel sito catalitico incluso l’Arg223, che interagisce con lo ione magnesio.10

REGOLAZIONE DI PDK1

La fosforilazione della proteina, che gioca un ruolo chiave in molti aspetti della biologia della cellula eucariotica, è un processo reversibile e dinamico che è mediato da chinasi e fosfatasi. Si pensa che PDK1 sia una chinasi costitutivamente attiva e che possieda meccanismi diversi per fosforilare substrati diversi.

L’attività di PDK1 è regolata dalla fosforilazione di diversi siti dovuta sia ad un’ auto-fosforilazione che ad una auto-fosforilazione indotta dai fattori di crescita a livello dei residui di serina nel loop di attivazione (Ser241 nell’uomo e la Ser244 nel topo). A tale fosforilazione segue la dimerizzazione e la trans-fosforilazione (Figura 4). È tutt’oggi dibattuto se PDK1 traslochi presso la membrana dopo la stimolazione del fattore di crescita o se sia costitutivamente localizzata sulla membrana; comunque sia questa localizzazione è indispensabile per la fosforilazione della Thr308 di Akt: i fattori di crescita inducono la traslocazione di Akt dal citoplasma alla membrana cellulare in modo tale da avere una co-localizzazione presso la membrana di Akt e PDK1. Il reclutamento di Akt, dovuto al legame tra PIP3 e il dominio PH, induce un

10 cambiamento conformazionale nell’enzima substrato (Akt) che facilita la fosforilazione di Akt ad opera di PDK1 sulla Thr308.11

Figura 4: Meccanismo di regolazione di PDK1.

Oltre che dall’attività chinasica, le funzioni di PDK1 risultano essere regolate dalla interazione proteina-proteina e dalla sua localizzazione intracellulare.

11 PDK1 NEL CANCRO

Il pathway PI3K/PDK1/Akt svolge un ruolo cruciale nello sviluppo della cellula tumorale, e nei tumori è possibile trovare sia un’iperespressione che un'ipoespressione di questo enzima. L’up-regulation è stata riscontrata anche nei pazienti affetti da leucemia mieloide acuta e da cancro alle ovaie; la down-regulation sembra invece inibire la migrazione e la capacità metastatica del tumore.

In particolare PDK1 ha un ruolo significativo nello sviluppo del cancro al seno. Un aumento del numero di copie di tale chinasi è stato spesso riscontrato nel cancro mammario comparato con in normale epitelio mammario ed è stato correlato all’attivazione a monte del pathway di PI3K.12-13

PDK1, come già detto, fosforila diverse chinasi che intervengono nei processi di regolazione, crescita e sopravvivenza cellulare. Inoltre il pathway PI3K/PDK1/PLCɣ1 svolge un ruolo importante nella progressione tumorale e nella possibilità dello sviluppo di metastasi.

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Akt

Akt è una serina/ treonina chinasi appartenente alla famiglia delle AGC. Sono note tre isoforme che presentano omologia strutturale pari all’ 80%: Akt1/PKBα, coinvolta nella regolazione dell'apoptosi e della sintesi proteica, è espressa ad elevati livelli ed in modo ubiquitario nell'organismo tranne che nel fegato, nella milza e nei reni; Akt2/PKBβ, implicata nell'omeostasi del glucosio, è principalmente espressa nei tessuti muscolare, adiposo ed epatico ed infine Akt3, isoforma la cui funzione è poco conosciuta, è espressa prevalentemente a livello cerebrale e testicolare.

Figura 7: Rappresentazione schematica delle tre isoforme di Akt.

Tutte e tre le isoforme vengono attivate a seguito della fosforilazione di due siti: il primo di treonina e l'altro di serina rispettivamente in posizione 308-473 per Akt1, 309-474 per Akt2 e 305-472 per Akt3.

É possibile distinguere in tutte e tre le isoforme tre domini caratteristici:

 il dominio N-terminale detto anche dominio PH (Pleckstrin Homology), costituito da 120 amminoacidi ed è la porzione dell'enzima che interagisce con PIP3;

 il dominio catalitico, caratterizzato da un'elevata omologia con le altre chinasi AGC e localizzato nella porzione centrale dell'enzima; è il sito deputato al legame con ATP e contiene inoltre il sito di treonina che deve essere fosforilato per l'attivazione;

 il dominio regolatorio C-terminale contenente la sequenza idrofobica caratteristica della famiglia AGC, è costituito da circa 40 amminoacidi fra cui il residuo di serina che deve essere fosforilato perché l'attivazione enzimatica sia massima.

13 Akt risulta avere un ruolo centrale nella trasduzione del segnale del pathway PI3K/PDK1/Akt.14

In seguito a stimolazione da parte dei propri ligandi (fattori di crescita, insulina, citochine, etc.) il recettore RTK va incontro a dimerizzazione e trans-fosforilazione sui residui di serina. All'attivazione recettoriale segue il reclutamento di PI3K (o meglio del complesso p85-p110) da parte di RTK; il legame recettore fosforilato-subunità regolatoria induce un cambiamento conformazionale tale da attivare la subunità regolatoria, che, a sua volta, fosforila PIP2, fosfolipide di membrana, in PIP3.

Il PIP3 attira e recluta Akt che vi si lega attraverso il dominio PH, dando luogo al cosiddetto reclutamento di membrana.

Akt risulta, quindi, essere nella condizione ottimale per essere attivata: la prima fosforilazione avviene sul residuo Thr308 ad opera di PDK1; la seconda, indispensabile per la completa attivazione, viene effettuata su Ser473 a livello del dominio C-terminale. Non è ancora chiaro con certezza se questa seconda fosforilazione sia effettuata da un' altra chinasi detta PDK2 (non ancora identificata) o dal complesso mTOR2.15

Akt, fosforilata su entrambi i siti, viene traslocata all'interno del nucleo dove va a prendere parte alla regolazione della crescita, della sopravvivenza e della proliferazione cellulare interagendo con i propri substrati e fosforilandone i residui di serina e treonina. Fra i substrati di Akt è possibile menzionare: GSK (Glicogen Synthase Kinase-3); PDE3B (Phosphodiesterase 3B), attivando che è coinvolta nella regolazione della concentrazione intracellulare di AMPc e GMPc; CASPASI 9 e BAD (BCL antagonist of cell death) entrambe coinvolte nell’attivazione della morte programmata, la cui fosforilazione porta all’inibizione dell’apoptosi e quindi alla sopravvivenza della cellula neoplastica; FOXO 1/2/3 (forkhead box transcription factors) e delle proteine inibitrici del ciclo cellulare p21waf e p27Kip1, la cui azione, sia a livello genetico che non, coinvolge proteine come la Ciclina D, il cui accumulo favorisce la progressione del ciclo cellulare.

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PLCɣ1

PLCɣ1, ovvero fosfolipasi C, è l’enzima deputato all’idrolisi di PIP2 che produce due importanti mediatori cellulari: il DAG (Diacilglicerolo), mediatore universale della mobilizzazione del calcio ed Ins3P (inositolo trifosfato), attivatore della PKC (protein kinase C).

PLCɣ1 appartiene alla famiglia delle PLCs, proteine caratterizzate dal presentare più domini con massa compresa fra 85 e 150 kDa ne esistono tredici isoforme classificate in sei famiglie : -β, -γ, -δ, -ε, -ζ ed -η le quali differiscono sia per struttura che nei meccanismi di attivazione e nella distribuzione.

PLCɣ1 è caratterizzata da un core catalitico, (figura 8) formato da un dominio X ed uno Y collegati da circa 400 amminoacidi organizzati a loro volta in due domini SH2 e uno SH3. Il dominio SH2 media l’autofosforilazione dei residui tirosin chinasici nella regione intracellulare del recettore; questa associazione è importante per il reclutamento di membrana e per la fosforilazione dei residui di tirosina di PLCɣ1. In particolare i residui che devono essere fosforilati sono Tyr771, Tyr1254 e Tyr783: la fosforilazione di quest’ultimo è fondamentale per l’attivazione della lipasi. La proteina presenta un dominio C2, indispensabile per l’attività enzimatica in grado di legare ioni Ca2+. Tale legame consente l’ancoraggio alla membrana dell’enzima, in quanto i cationi stabiliscono legami elettrostatici con i fosfolipidi anionici. L’enzima infine presenta un dominio PH che permette il legame al fosfolipide di membrana, deputato quindi, sia a garantire l’interazione proteina-lipidi che proteina-proteina.16-17

Figura 8: Schema della struttura di PLCɣ1.

Alcuni studi hanno dimostrato che PLCɣ1, attivata dai fattori di crescita attraverso la fosforilazione da parte di PDK1, garantisce alla cellula tumorale la capacità di metastatizzare, oltre a giocare un ruolo nei meccanismi di angiogenesi.

15 Figura 9: Pathway PI3K/PDK1/PLC ɣ1.

PLCɣ1 è infatti coinvolta nella dissoluzione dei contatti adesivi cellula-cellula e nell’aumento delle molecole di adesione cellula-matrice al fine di garantire un fenotipo migratorio e invasivo alla cellula tumorale: per ottenere questa autonomia la cellula deve presentare un’attivazione dei recettori RTK (per garantire la migrazione) e l’inattivazione dei CAM cellula-cellula ovvero di quelle glicoproteine transmembranarie che saldano le cellule contigue.18

PLCɣ1, una volta reclutata grazie al dominio SH2 e fosforilata sul residuo Tyr783, inizia a idrolizzare i vari substrati in DAG e IP3, la formazione dei quali provoca un incremento della concentrazione del Ca++ citoplasmatico rilasciato dai mitocondri e l’attivazione della PKC, serina treonina chinasi che ha un ruolo regolatorio fondamentale in molti processi cellulari come proliferazione, differenziamento, apoptosi. Un altro processo innescato da DAG e IP3 è il rilascio di proteine sequestranti PIP2, fattore che promuove la polimerizzazione dell’actina citoscheletrica, presupposto indispensabile per la formazione delle strutture iniziali della migrazione cellulare (lamellipodi e filopodi) (Figura 10).19

16 Figura 10: Alcuni processi in cui PLCɣ1 è coinvolta.

Varie ricerche hanno verificato che PLCɣ1 viene attivato dagli FGFs (Fibroblast Growth Factors ) oltre che da PI3K e, nonostante ad oggi la descrizione del meccanismo non sia ancora stata completamente chiarita, questo enzima è considerato un effettore principale di FGF.20

L’enzima deputato all’inattivazione di PLCɣ1 è PTPµ (Protein Tyrosine Phosphatase mu) che antagonizza la migrazione cellulare ed è capace di regolare l’adesione intercellulare attraverso l’induzione e la produzione di proteine come le CAM cellula-cellula. Questo enzima può essere quindi definito un oncosoppressore, ipotesi sostenuta da diversi studi che hanno rilevato una sua downregulation nel glioblastoma umano metastatico (GBM).19

Recentemente è stata osservata una correlazione tra la fosforilazione su PLCɣ1 nei soggetti affetti da carcinoma mammario e lo sviluppo di recidive. Tale evidenza lascia ipotizzare che questo enzima possa rappresentare utile marcatore predittivo dello sviluppo di recidive.

m TOR

L’enzima mTOR, mammalian target of rapamycin, è una serina/ treonina chinasi appartenente alla famiglia PI3 ed è coinvolta nella regolazione di eventi cellulari quali crescita, proliferazione, motilità, sopravvivenza e la sintesi proteica . mTOR umano è formato da 2549 amminoacidi, è codificato dal gene FRAP-1 ed è attivato dagli amminoacidi, dal glucosio, dall’insulina e altri ormoni implicati nella regolazione del metabolismo.

17 m-TOR fa parte del pathway PI3K/Akt ed in particolare rappresenta sia un bersaglio che un attivatore di Akt: mTOR è in grado di associarsi con la proteina RICTOR (Rapamycin-insesitive companion of m-TOR) dando luogo alla formazione di un complesso in grado di fosforilare direttamente Ser473 di Akt. La formazione di questo complesso spiegherebbe il sequestro delle molecole m-TOR non appena formatesi all’interno delle cellule sottoposte a prolungati trattamenti con la rapamicina. Questo farmaco è in grado di indurre l’apoptosi e inibire la proliferazione delle cellule che presentano un’upregolation di Akt perchè interferiscono con il riassemblaggio del complesso entrandone a far parte.20

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STRATEGIE TERAPEUTICHE

Nel corso degli anni il pathway PI3K/PDK1/Akt ha assunto sempre maggiore centralità nella ricerca dei farmaci antineoplastici perché presenta ruolo centrale nella genesi, nella proliferazione e nella metastatizzazione del tumore.

L’inibizione di questo pathway è possibile a diversi livelli; allo stato attuale la ricerca si sta soffermando sempre più sulla validità di PDK1 come target terapeutico nel cancro in quanto è in grado di attivare una ventina di AGC chinasi coinvolte nella genesi della cellula tumorale. E’ proprio a causa di tale ruolo che PDK1 viene indicato come ‘master

kinase’ ,indicando la sua centralità negli equilibri cellulari (Figura 11).

Figura 11: Possibili target farmacologici per inibire il pathway PDK1/Akt.

INIBITORI PI3K

Gli inibitori al momento disponibili presentano un’elevata affinità per le isoforme di PI3K appartenenti alla classe I ovvero quelle che producono il segnale PI3P e svolgono un ruolo chiave nella crescita, sopravvivenza e proliferazione cellulare.(Figura 12) Il primo inibitore di PI3K, Wortmannin, fu isolato nel 1957 da Pennicilium wortmanni e la sua struttura fu chiarita attraverso cristallografia a raggi X dai ricercatori della Sandoz.22

19 C H₃ O O O O O CH₃ O C H₃ O CH3O A B C D Wortmannin O N O O LY294002 C H₃ O O C H₂ N CH₂ O O OH CH₃ O CH3 O C H₃ O PX-866

Figura 12: Strutture dei principali inibitori di PI3K.

L’attività anti-infiammatoria di Wortmannin fu però identificata solo nel 1993 quando è stato scoperto essere attivo su PI3K. Wortmannin ha un IC50 compreso fra 2 e 4 nM e

una struttura furano-steroidea grazie alla quale è in grado di formare un legame covalente irreversibile fra C-20 dell’anello elettrofilico del furano e il residuo di lisina in PI3K. Quest’ultimo è coinvolto nella reazione di trasferimento del fosfato, la cui formazione è stabilizzata dai numerosi legami ad idrogeno che si formano fra alcuni atomi di ossigeno dello scheletro steroidale e l’enzima: ad esempio l’ossigeno chetonico dell’anello D interagisce con il sito di legame per l’ATP.

Poiché tutti questi residui sono conservati nella classe I di PI3K non deve sorprendere che il Wortmannin interagisca con tutte e quattro le isoforme. Anche se è stato ampiamente utilizzato per lo studio dei meccanismi di trasduzione del segnale, il suo impiego terapeutico è praticamente impossibile a causa della scarsa solubilità e stabilità in acqua poichè l’anello furanico viene aperto per idrolisi.22

Dagli studi (Amann et al, 1996) su questa molecola di origine naturale sono stati sintetizzati composti come PX866 i quali presentano una maggiore stabilità e risultano migliori da un punto di vista di applicazione terapeutica.23

Un altro composto da menzionare è sicuramente LY294002, derivato flavonoide, inibitore competitivo e reversibile di PI3K per l’ATP; è stato spesso usato al posto del Wortmannin per chiarire il ruolo di PI3K in vari processi cellulari. Inoltre è stato dimostrato che LY294002 ha attività antiproliferativa e pro-apoptotica in-vitro mentre in-vivo ne è stata dimostrata l’attività nel trattamento metastatico.23

Gli inibitori di PI3K trovano impiego come antitumorali nel trattamento del neuroblastoma, mieloma multiplo e carcinomi del colon e del rene.

Al momento ci sono nove inibitori in fase clinica, con diverso profilo di selettività su diverse isoforme, ma i risultati clinici ottenuti con tali inibitori non hanno soddisfatto

20 l’aumento delle aspettative suscitate dalle promesse pre-cliniche, specialmente se coinsiderati come singolo agente.

Resta ancora da capire perché gli inibitori di PI3K hanno finora fallito, in particolare se sia insufficiente l’inibizione del bersaglio (ovvero gli inibitori non funzionano in modo ottimale) o se è l’inibizione di PI3K che non rappresenta la strategia più adatta nel trattamento antitumorale.

INIBITORI PDK1

Anche se il ruolo centrale di PDK1 nel cancro è ormai confermato ad oggi sono stati sviluppati solo, pochi inibitori specifici per PDK1. Questa contraddizione è principalmente dovuta alla difficoltà nel mettere a punto un inibitore selettivo per PDK1, dato l’elevato grado di conservazione del dominio di legame per l’ATP nella famiglia delle chinasi.

Il dominio chinasico di PDK1 presenta tre siti di legame: uno per il substrato, un sito chinasico e uno per l’ATP (cofattore fondamentale in quanto donatore del gruppo fosfato): è con quest’ultimo sito che interagisce la maggior parte degli inibitori di PDK1.

Sempre più ricercatori si sono dedicati alla sintesi di molecole in grado di inibire PDK1, al fine di bloccare l’attivazione del pathway PI3K/ PDK1/ Akt, in quanto esso non solo determina il blocco di Akt, ma anche di altre chinasi AGC coinvolte in eventi proliferativi quali l’invasività tumorale, l’angiogenesi e la progressione.

Gli inibitori per il sito dell’ATP sono classificati in base alla struttura chimica in: 1. bisindolmaleimmidi;

2. indoloni;

3. dibenzo[c,f][2,7]naftiridine;

4. derivati dell’acido 3-idrossiantranilico; 5. derivati del celecoxib

6. 1-benzil-2-ossi-1,2-diidropiridin-3-carbossammidi;

Poiché questi inibitori hanno la capacità di mimare l’ATP ed interagire al posto di essa con il sito chinasico presentano il limite di andare ad interagire con le altre chinasi (effetto off-target).

21 1.Bisindolmaleimmidi

I bisoindolmaleimmidi sono caratterizzati da un nucleo bisindolmaleimmidico ed i principali sono LY333531 e staurosporina. Dall’analisi strutturale del complesso di PDK1 con questi inibitori è stato possibile individuare quali parti delle molecole interagiscono con alcuni amminoacidi gettando le basi per sintetizzare altri composti attivi. N O N N CH₃ C H₃ N H O O LY333531 N N N H O CH3 C H₃ O Stauroporina

Figura 13: Strutture dei principali inibitori con nucleo bisindolmaleimmidico.

LY333531 (IC50=0.75µM) è caratterizzata oltre che dal nucleo bisindolmaleimmidico

anche dall’anello dell’immide ciclica dell’acido maleico. L’addotto LY333531-PDK1 è dovuto alla formazione di tre legami ad idrogeno fra i gruppi polari con la regione RH dell’enzima (O5 ••• NH Ala162, N6 ••• Ser160 e O7 ••• Thr222). In questo caso sia O5 ••• NH Ala162 che N6 ••• Ser160 mimano l’interazione dell’ATP con PDK1 (figura 14).24

22 La staurosporina, invece, va ad interagire con gli amminoacidi Val123 e Tyr222 e non ha un grande interesse farmacologico in quanto è poco selettiva.

2.Indoloni

L’interesse verso questi composti nasce a partire dal 2006 quando un gruppo di ricerca Bayer ha brevettato (Arnaizen et al, 2006) 25 una classe di composti indolonici in grado di inibire PDK1; tali composti possiedono una struttura base (3Z)-3-(1H-pirrol-2-metilene)-1,3-diidro-2H-indol-2-one, nucleo che si riscontra anche in un altro inibitore di chinasi, sunitinib (SU11248).26-27

N H N H O F CH₃ C H₃ NH N CH₃ CH₃ O SUNITINIB

Figura15: Struttura di sunitinib (SU11248).

I composti in questione sono in grado di inibire PDK1 con un valore di IC50 a 0.52µM e

di bloccare l’attivazione di Akt nelle cellule tumorali.

N H NH N H2 O N H O BX-517 Figura 16: Struttura di BX-517.

Tra i composti a struttura indolonica, un derivato molto interessante è BX-517, (figura 16) la cui analisi cristallografica a raggi X ha rivelato le interazioni che si formano nel pocket per l’ ATP di PDK1. Il nucleo pirrolo-indolone è coinvolto nella formazione di tre legami ad idrogeno con la HR di PDK1: quello fra l’azoto dell’indolone e Ser160, quello dell’ossigeno e Ala162 ed infine il legame ad idrogeno fra l’azoto ureidico,

23 Lys111e Thr222; è da notare che le interazioni con la pocket avvengono solo se la geometria della molecola è di tipo Z (figura17).

Figura 17: Interaxioni fra BX-517 e il pocket per ATP.

BX-517 presenta una buona selettività per PDK1 ma non può trovare impiego terapeutico in quanto ha un basso profilo ADME (bassa emivita, rapida velocità di metabolizzazione) ed è poco solubile in mezzi acquosi. La solubilità e le proprietà farmacocinetiche sono state migliorate con l’introduzione di gruppi polari in posizione 4’ del pirrolo.28 N H NH N H₂ O O N H R

Figura 18:Modifiche su 4’ del pirrolo di BX-517.

Nel 2004 la Schering AG brevetta alcuni composti con proprietà inibitorie su Chk1(chinasi che fosforila Cdc25), PDK1 e Akt con nucleo base N-fenilpirimidino-2-amminici, come BX-320, BX-795, BX-912.29

24 N N N H CH3 NH NH NH N O S O BX-795 N N N H Br NH NH N O N N H BX-912 N N N H Br NH NH NH N O NH₂ C H₃ CH₃ O _O BX-320

Figura 19: Strutture dei composti BX-320, BX-795 e BX-912.

BX-320 (IC50 =1-3µM) e BX-795 (IC50=0.3µM) sono in grado di inibire Akt quando è

fosforilata su Thr308 nelle linee cellulari di tumore prostatico umano (PTEN-/PC-3) che presentano Akt costitutivamente attivata; questo non vale per BX-912. L’inibizione avviene grazie alla formazione di due legami ad idrogeno (figura 20):

 il nucleo 2-ammino-pirimidinico lo stabilisce con Ala162;

 l’ossigeno dell’amide terminale di 320 con Ser94, mentre nel caso di BX-912 e BX-795 è rispettivamente l’azoto e lo zolfo ibridati sp2 .

25 3.Dibenzo[c,f][2,7]naftiridine

Ricercatori della Wyet nel 2007 studiano e brevettano una nuova classe di inibitori selettivi per PDK1: le dibenzo[c,f][2,7]naftiridine.30

N N MeO MeO NH₂ CH₃ NH2 Composto A

Figura 21: Struttura del Composto A.

Il lead compound di questa classe è il composto A che presenta un IC50 di 0.06µM.

L’analisi strutturale a raggi X ha evidenziato che il nucleo dibenzo[c,f][2,7]naftiridinico interagisce con la parte dell’ enzima che va da Leu212 a Leu88 e forma tre legami ad idrogeno con la HR (figura 22) : l’azoto in posizione 8 interagisce con di Ala162, il gruppo amminico in posizione C 6 con Ser160 e infine l’azoto in posizione 5 con di Thr222. Inoltre la funzione amminica legata al carbonio in 3 interagisce con la proteina tramite una molecola d’acqua: i residui amminoacidici coinvolti non sono stati ancora identificati ma sembra che questa interazione conferisca al composto la selettività verso PDK1.

26 4.Derivati dell’acido 3-idrossiantranilico

Uno studio pubblicato nel 2007 (T. Hayashi et al, 2007) ha dimostrato che l’acido 3-idrossiantranilico (HAA) inibisce l’autofosforilazione di PDK1 su Ser 241 in un intervallo di concentrazione fra 50-200µM. Questo derivato va ad occupare il sito di legame per ATP e il complesso è stabilizzato dalla formazione di tre legami ad idrogeno (figura23) : funzione ossidrilica e amminica interagiscono con della Ser160, l’ossigeno della funzione ossidrilica con Ala162 e il gruppo carbonilico di HHA con Thr222.31

Figura 23: Interazioni fra il composto HHA ed il pocket dell’ATP.

5.Derivati del celecoxib

La ricerca guarda con interesse anche agli inibitori COX2 selettivi in quanto è stato dimostrato che celecoxib ha attività inibitoria nei confronti di PDK1. Esso si lega al sito per l’ATP e presenta un IC50 di 48µM (J. Zhu et al, 2004).32 Sulla base di queste

conoscenze sono stati sintetizzati composti come OSU-03012 (IC50=5µM) e

OSU-03013 (IC50=2 µM). Celecoxib N N F F F NH N H2 NH OSU-03013 N N C H3 F F F S O N H2 O N N F F F NH O N H2 OSU-03012

27 Dati biochimici e strutturali sul meccanismo di attivazione di PDK1 indicano che altre due classi di inibitori per PDK1 potrebbero essere esplorate come possibili farmaci: i ligandi allosterici per il PIF pocket ed i competitori per il dominio PH.

È stato recentemente identificato un derivato del composto naturale inositolo 1,3,4,5,6 pentafosfato (InsP5), chiamato 2-O-Bn-InsP5, che possiede una maggiore attività pro-apoptotica e anti-tumorale se paragonata alle altre molecole InsP5. Analisi dei profili su più di 60 differenti chinasi rivelano che questo composto inibisce in modo efficace e specifico PDK1 in vitro e la fosforilazione del residuo Thr308 di Akt nelle linee cellulari in vivo.33 OPO₃ 2-OPO₃ 2-OPO₃ 2-O₃2-PO O₃2-PO 2-O-Bn-InsP5

Figura 25: Struttura di 2-O-Bn-InsP5.

Altri inibitori nuovi, specifici e potenti come GSK22334470 e i composti con base piridinonica stati recentemente caratterizzati e mostrano un’elevata selettività ed un’alta potenza nell’inibizione di PDK1. Interessatamente, GSK22334470 (IC50= ~10 nM)

inibisce S6K (p70 ribosomal S6 kinase ) e SGK (the serum and glucocorticoid induced proteinkinase) più potentemente di Akt.34-35

N N H N N N O NH NH C H3 CH₃ NH₂ GSK22334470 Figura 26: Struttura di GSK22334470. 6.1-benzil-2-ossi-1,2-diidropiridin-3-carbossammidi

Un gruppo di ricerca della Sunesis Pharmaceutical/ Biogen Idec Inc (K.E. Lind et all, 2008) ha brevettato una serie di inibitori di PDK1 appartenenti alla classe chimica dei piridonici (1-benzyl-2-oxo-1,2,-dihydropyridine-3-carboxammide).

28 Figura 27: Rappresentazione del nucleo 1-benzil-2-oxo-1,2,-diidropiridin-3-carboxammide.

La struttura base di questi composti è data da un linker flessibile (L) fra il nucleo carbossammidico e un raggruppamento donatore (HD) /accettore (HA) di legami ad idrogeno, che interagisce con Ala162 e Ser160 della HR di PDK1. La distanza tra la porzione HD e l’atomo di azoto dell’ammide deve essere circa di sei unità di carbonio (7-8 Å), mentre la distanza tra la porzione HA e l'azoto ammidico deve essere di otto unità di carbonio (8,5-9,5 Å). Il raggruppamento piridonico pare si leghi in modo specifico alla proteina.

O NH N N H N H O O O F F MP 7 Figura 28: Struttura di MP7.

Un recente studio (Nagashima et al, 2011) ha effettuato un raffronto fra l’attività di alcuni inibitori classici di PDK1 che si legano al sito dell’ATP ed il composto piridinonico della Sunesis chiamato MP7. Questo studio ha dimostrato che l’attività degli inibitori per il sito dell’ ATP (DFG-in) non è dovuta esclusivamente all’interazione con PDK1. Un analisi di tipo “chimico-genetico” ha infatti evidenziato che mentre BX795 (inibitore pirimidinico di PDK1) è in grado di causare l’arresto della proliferazione tra la fase G2 e la fase M del ciclo cellulare, indipendentemente dalla presenza dell’enzima PDK1, MP7 è in grado di associarsi alla forma inattiva di PDK1, inducendo dei cambiamenti conformazionali esclusivi. MP7 non svolge infatti la medesima attività nei confronti di altre chinasi appartenenti alla famiglia AGC: è possibile quindi definirlo inibitore altamente selettivo per PDK1, con un valore di IC50=1nM.36

29 Figura 29: Interazioni tra PDK1 rispettivamente con BX-795 e MP7.

In particolare la cristallografia a raggi X ha evidenziato che se BX795 (DGF-in) è in grado di formare legami ad idrogeno con la regione cerniera dell’enzima andando ad interagire con i residui di Ala161 e Ser160, dall’altra parte MP7 è invece in grado di inibire l’enzima; in particolare: l’urea ciclica forma due legami ad idrogeno uno con Ser160 e Ala162; il sostituente fenilico del linker con Lys111 del sito catalitico mentre il nucleo centrale piridinonico interagisce con i residui Leu159 e Val143; infine l’anello terminale difluoro benzilico è coinvolto nella formazione nel pocket allosterico DFG-out con i residui Met134, Leu137, Phe142, Leu196 e Ile221.

30 Riassumendo i tre frammenti della molecola MP7 vanno ad interagire con siti specifici, in particolare, la parte idrofobica che occupa un pocket presente nella sola conformazione inattiva di PDK1, va ad occupare residui esclusivi di questo enzima. Questo effetto e l'induzione al cambiamento conformazionale nella αC elica (alterante l’integrità strutturale del PIF pocket) potrebbe spiegare l’attività di questo derivato. 37

INIBITORI Akt

Gli inibitori disponibili al momento su Akt possono essere così classificati: 1. inibitori competitivi per il sito dell’ATP, ovvero antagonisti del sito chinasico; 2. inibitori a struttura fosfatidil-inositolo simile, ovvero antagonisti del dominio PH 3. inibitori allosterici.

1.Inibitori competitivi per il sito ATP

Diversi gruppi di ricerca hanno sintetizzato piccole molecole in grado di legarsi al sito chinasico di Akt; il limite principale riguardo a questi inibitori è legato alla scarsa selettività dovuta all’alto grado di omologia strutturale del sito di legame in altre chinasi. Solo con la scoperta della struttura e della sequenza amminoacidica è stato possibile sintetizzare molecole selettive per una certa chinasi piuttosto che per una particolare isoforma. N N N H CH₃ O N H NH₂ A-443654 N N N H CH₃ O NH₂ A-674563

Figura 31: Strutture di A-443654 e A-674563.

La Abbott ha studiato le piridine -3,5- disostituite che presentano una buona attività inibitoria: in particolare un composto di grande interesse è A-443654 (IC50=0.16µM)

che presenta una buona attività anti proliferativa; esso viene associato ai chemioterapici classici ed è un buon induttore dell’apoptosi. A-443654 presenta bassa biodisponibilità per cui non è somministrabile per via orale pertanto al fine di superare questo limite

31 sono state apportate delle modifiche che hanno permesso di sviluppare A674563,nel quale,l’attività risulta essere compromessa benchè vi sia un incremento biodisponibilità. La GlaxoSmithKline ha invece sviluppato una molecola GSK 690693 che presenta un’alta attività enzimatica cellulare ed è in grado di inibire la crescita delle metastasi in vari tumori; è inoltre un potente inibitore di tutte le isoforme ed è attualmente in Fase I della sperimentazione.38 N N N N _N O NH₂ O NH C H₃ OH CH₃ C H₃ GSK690693 Figura 32: Struttura di GSK690693.

2.Inibitori del dominio PH

Appartengono a questa classe di inibitori quei composti che legandosi al dominio PH di Akt impediscono il reclutamento di membrana e quindi l’attivazione.

Sono stati inizialmente sviluppati analoghi di PIP3 fra cui il derivato DPI (1D3-deossifosfatidil-inositolo) il quale manca di un gruppo ossidrilico rispetto al composto endogeno ed in vitro non presenta attività verso PI3K a concentrazioni inferiori a 250µM.

Sono stati poi sintetizzati gli analoghi eterei fosfoinositolici il cui più attivo è PX-316 che sembra essere un potente inibitore 10 volte più selettivo per Akt (IC50=1.5µM)

rispetto a PI3K (IC50=14.8 µM); questo derivato ha una buona attività antiproliferativa

in numerose le linee cellulari di cancro umano.

N+ O P O C18H37 O H O Me Me PERIFOSINA

32 Anche la perifosina è una molecola sviluppata tenendo conto della struttura dei fosfolipidi. Ha una buona biodisponibilità ed è somministrabile per via orale; è studiata per i tumori solidi in fase avanzata come sarcoma, gliomi maligni, NSCLC, tumori metastatici alla mammella e melanoma. La perifosina non presenta i tipici effetti collaterali dei chemioterapici quali mielosoppressione, trombocitopenia, rush cutaneo, alopecia e sintomi simil-influenzali, anche se rimangono la nausea, vomito, diarrea e senso di affaticamento.

3.Inibitori allosterici

Il meccanismo d’azione di queste molecole non è stato ancora chiarito ma si ipotizza che questi inibitori si leghino o ad un sito nel dominio PH o al dominio chinasico in un sito diverso da quello deputato a legare l’ATP; il complesso che si forma stabilizzerebbe l’enzima in una forma ‘chiusa’ di Akt tale da non poter essere attivata da PDK1.

Questa classe di composti ha mostrato un notevole livello di specificità: non solo sono selettivi per la chinasi Akt ma addirittura per le isoforme. I principali inibitori sono il composto B attivo solo su Akt1 (IC50=4.6µM) ed il composto C con nucleo

chinossalinico che è attivo sia su Akt1 che Akt2 (rispettivamente IC50=2.7 µM e

IC50=21 µM). N N NH2 CH3 C H3 N N N N NH N CH3 C H3 C H3 C H3 composto B composto C

Figura 34 : Strutture dei composti B e C.

L’inibitore MK-2206 è invece attivo su tutte e tre le isoforme con un IC50 dell’ordine del

nano molare, è attualmente in sperimentazione per il trattamento di tumori solidi come quello pancreatico, neuroendocrino e melanoma.

33 N N N N H NH₂ O MK-2206 Figura 35 : Struttura di MK-2206.

In conclusione, nonostante in passato PDK1 sia stata studiata esclusivamente come attivatore di Akt, considerato il ‘bersaglio principe’ nei possibili target farmacologici antineoplastici, le recenti scoperte hanno spostato l’attenzione su PDK1 in quanto attiva molti enzimi della famiglia AGC coinvolti non solo nello sviluppo della cellula tumorale ma soprattutto nell’angiogenesi e nella metastatizzazione del tumore. Evidenza ancora più importante è che fenomeni come appunto angiogenesi e formazione delle metastasi sono controllati da segnali PDK1 dipendenti ma Akt-indipendenti. Quindi la scoperta di inibitori di PDK1 nuovi e più selettivi potrebbe rappresentare uno strumento utile per comprendere in pieno il ruolo di tale enzima nell’inibizione del cancro e delle metastasi.39