1.1 Premessa
La serotonina, 5-idrossitriptamina (5HT), è un’ amina biogena che svolge numerose funzioni sia nel sistema nervoso centrale che periferico.
Grazie a studi condotti sia sull’uomo che su diversi modelli sperimentali, sono state dimostrate implicazioni di questo neurotrasmettitore in funzioni fisiologiche varie, come la memoria, la regolazione dei cicli sonno-veglia, la secrezione neuroendocrina, il comportamento sessuale, l’attività motoria, la termoregolazione e la modulazione del dolore (Lucky et al.,1990). Nel sistema periferico inoltre la serotonina è implicata a livello del sistema respiratorio, cardiovascolare e del tratto gastrointestinale (Comfield et al.,1991).
Studi condotti sull’uomo hanno dimostrato che alterazioni a carico del sistema serotoninergico sono correlati a numerosi disturbi neuropsichiatrici, quali l’aggressività, l’ansia , i disturbi alimentari e la schizofrenia (Murphy, 1990; Wilkinson e Dourish, 1991).
Le varie attività della 5HT sono mediate dall’interazione con diversi sottotipi recettoriali. I recettori serotoninergici (tranne i sottotipi della classe 3 che sono accoppiati a canali ionici) sono caratterizzati dalla presenza di sette domini transmenbrana altamente conservati (Boess e Martin, 1994; Martin e Humphrey, 1994), e sono accoppiati, nella maggior parte dei casi, a proteine G che attivano nell’elemento post-sinaptico vie di trasduzione del segnale (Boess e Martin, 1994), quali principalmente la via dell’ cAMP (nucleotide adenosina monofosfato ciclico)(Lauder, 1993) e la via della fosfolipasi C.
1.2 Ruolo della serotonina durante lo sviluppo embrionale
Numerosi studi hanno rivelato un coinvolgimento di questo neurotrasmettitore nello sviluppo di molti organismi invertebrati e vertebrati compresi i mammiferi. Infatti sembra che la serotonina giochi un ruolo importante, anche se notevolmente diverso, nei vari organismi.
Ad esempio nella Tetrahymena si riscontra un innalzamento della concentrazione di serotonina durante le fasi di crescita esponenziale dell’organismo (Lauder, 1993), mentre nella Planaria è implicata nei fenomeni di rigenerazione insieme ad altri neurotrasmettitori (Lauder, 1993). Nel riccio di mare, la 5HT, regola vari processi come le prime divisioni cellulari e in fasi più tardive interviene nella gastrulazione e nella migrazione del mesenchima primario (Buznikov et al., 1964, 1968, 1970;
Gustavson et Toneby, 1970; Renaud et al., 1983). Infine nei Vertebrati è noto che la serotonina interviene in numerosi processi durante lo sviluppo embrionale tra cui il differenziamento neuronale (Whitaker-Azmitia et al., 1990).
1.3 Organizzazione dei Nuclei del Raphe e loro proiezioni nel cervello adulto dei mammiferi
I nuclei del raphe sono costituiti da una popolazione eterogenea di neuroni che presentano caratteristiche morfologiche, neurochimiche e proiezioni distinte, di cui i neuroni serotoninergici rappresentano il gruppo più consistente in numero e fisiologicamente il più importante, tanto che adesso comunemente quando si parla di nuclei del raphe ci si riferisce al sistema serotoninergico (Hornung, 2003).
Analisi immunoistochimiche che utilizzano anticorpi contro la serotonina e altri marcatori specifici quali l’enzima triptofano idrossilasi (enzima chiave della via biosintetica della 5HT) e il trasportatore della
serotonina hanno mostrato, in vari modelli sperimentali tra cui i primati e l’uomo, che i neuroni serotoninergici sono localizzati lateralmente alla
“midline” della porzione ventrale del cervello posteriore dell’embrione (Hornung, 2003).
Nei mammiferi, durante la vita adulta, i neuroni serotoninergici sono organizzati in nove nuclei, denominati con le sigle da B1 a B9 che nel complesso sono indicati come nuclei del raphe. I nuclei da B5 a B9 (nuclei del raphe: del ponte, dorsale, centrale superiore, reticolare del tegmento del ponte e regione tegmentale adiacente), detti anche comunemente solo
“raphe dorsale”, rappresentano il raggruppamento più anteriore, le cui proiezioni vanno a innervare le zone più anteriori del cervello tra cui la corteccia, il sistema limbico, lo striato, il talamo, il cervelletto. Gli altri da B1 a B4 (raphe pallido, oscuro, paragigantocellulare, magno), che rappresentano il raggruppamento più posteriore proiettano al midollo spinale (Jakobs e Azmitia, 1992; Sodhi e Sander-Bush, 2004).
Esperimenti di immunoistochimica sono stati utilizzati per identificare i nuclei serotoninergici in topo e ratto (Lidov e Molliver, 1982;
Aitaken e Tork, 1988) e in due vertebrati inferiori quali il pollo e il rospo tropicale Xenopus laevis (Messenger e Warner, 1989).
Le proiezioni dei nuclei serotoninergici innervano nel complesso l’intero sistema nervoso centrale andando a contattare zone molto diverse del cervello e del midollo spinale a conferma del coinvolgimento di questo sistema neurale nei numerosi processi sopradescritti.
Figura 1: Organizzazione dei nuclei del raphe dei mammiferi nell'adulto. Suddivisione nei due raggruppamenti rostrale (in rosso) e caudale (in giallo) e rispettive innervazione (Maroteaux, et al.,2003).
1.4 Importanza del sistema serotoninergico nella neurogenesi e nel differenziamento neurale
Il sistema serotoninergico del raphe è uno dei sistemi monoaminergici che si sviluppano per primi durante lo sviluppo embrionale. I precursori dei neuroni serotoninergici sono fra le prime cellule a lasciare l’epitelio ventricolare proliferativo del tubo neurale, per raggiungere le loro localizzazioni finali, dove poi si differenzieranno. La precoce presenza della 5HT già a partire da fasi molto precoci dell’embrione fa pensare che questa monoamina possa essere coinvolta per un corretto sviluppo del sistema nervoso centrale (Whitaker-Azmitia et al., 1990). Studi condotti in vivo dimostrano, inoltre, che la 5HT può influenzare la maturazione di quelle aree con cui i neuroni serotoninergici stabiliscono contatti sinaptici. Infatti, trattamenti con sostanze inibitrici della sintesi di questo neurotrasmettitore, come la paraclorofenilalanina, portano ad un ritardo nel differenziamento dei neuroni normalmente innervati dalle fibre serotoninergiche (Lauder e Krebs, 1976). Ulteriori dati indicano che la serotonina possa funzionare anche da “autoregolatore”
mediando la formazione e la crescita degli assoni delle cellule serotoninergiche stesse fino alle zone bersaglio (Whitaker-Azmitia et al., 1986, 1987), come confermato anche da osservazioni di mutanti di Drosophyla (Budnik et al., 1989) e da studi nella lumaca Helisoma (Haydon et al., 1984, 1987).
1.5 Come si origina il sistema serotoninergico
I segnali che portano alla formazione del sistema serotoninergico a partire dal tubo neurale sono molteplici e derivano da vari distretti del sistema nervoso embrionale.
Sono stati identificati fattori diffusibili che sembrano essere importanti per la formazione dei neuroni serotoninergici, fra cui Sonic Hedgehog (Shh), (prodotto dalla notocorda e dal pavimento del romboencefalo), FGF8 (rilasciato dall’istmo al confine fra mesencefalo e romboencefalo) e FGF4 (secreto dalla “stria primitiva”)(Hynes e Rosenthal, 1999).
L’importanza di Shh è stata messa in evidenza da esperimenti in cui questo fattore è bloccato attraverso l’uso di anticorpi specifici. In queste condizioni sperimentali si ha un mancato sviluppo dei neuroni serotoninergici. L’importanza di questo fattore diffusibile è stata inoltre confermata, in espianti coltivati in presenza di Shh stesso, dall’induzione di neuroni serotoninergici ectopici nella zona più dorsale del romboencefalo, ma non in altre localizzazioni (Hynes e Rosenthal, 1999).
Per quanto riguarda il ruolo di FGF8 è stato dimostrato in topo che anche una deplezione di questo fattore provoca una diminuzione di cellule 5HT nel romboencefalo (Hynes e Rosenthal, 1999).
La scoperta del coinvolgimento di FGF4 deriva, invece, dal fatto che è stato dimostrato che da soli Shh e FGF8 non sono sufficienti per la formazione di neuroni serotoninergici ectopici. Questo ha portato a ipotizzare che fosse necessario un ulteriore fattore. Da esperimenti condotti in colture di espianti di mesencefalo ventrale, dove è contenuto FGF4 in grandi quantità, è stato visto che somministrando Shh e FGF8 si ha formazione di neuroni che sintetizzano 5HT. Questo ha portato a concludere che probabilmente FGF4 genera un pre-segnale all’interno del romboencefalo che porta, con la secrezione di Shh e FGF8, alla conversione dei precursori neurali in neuroni serotoninergici nella zona più ventrale del romboencefalo (Hynes e Rosenthal, 1999). I fattori diffusibili, sopra citati, innescano vie di trasduzione intracellulari che portano all’attivazione trascrizionale di geni coinvolti nel differenziamento dei neuroni serotoninergici.
Studi condotti principalmente in topo hanno dimostrato che i neuroni serotoninergici si generano a partire dagli stessi precursori neurali da cui, in fasi più precoci dello sviluppo embrionale, si originano i motoneuroni sia somatici che viscerali (Pattyn et al., 2003).
Infatti, dalle analisi condotte su embrioni di topo, fra il nono e il decimo giorno di gestazione (stadio E9 - E10.5 dello sviluppo embrionale di topo) è risultato che, a livello del pavimento del romboencefalo, si esprimono geni indispensabili per la generazione dei motoneuroni quali principalmente Nkx2.2, Nkx2.9 e Phox2b. A 10.5 giorni di gestazione nel topo, la trascrizione dei geni Phox2b e Nkx2.9 viene spenta (Pattyn et al., 2000).
Contemporaneamente in questa stessa zona, all’interno di altri precursori non ancora differenziati, vengono attivati per la prima volta geni utili per la specificazione, il differenziamento e il mantenimento post- mitotico del fenotipo serotoninergico (Pattyn et al., 2003; 2004).
In questi neuroni, infatti, viene attivata la trascrizione dei geni, codificanti per fattori di trascrizione, come: Lmx1b, Pet-1, GATA2, GATA3.
Lmx1b sembra essere implicato nel mantenimento post-mitotico dei precursori serotoninergici (Ding et al., 2003).
Pet-1 è un gene specifico del destino serotoninergico, indispensabile affinché i neuroni serotoninergici inizino a differenziarsi (Cheng et al., 2003).
GATA2 è richiesto per la specificazione dei neuroni serotoninergici solo di r2 e GATA3 da r3 in poi, come dimostrato dal “knock-out” di questi due geni in topo (Craven et al., 2003; van Doorninck et al., 1999).
Figura 2: A) Fattori richisti per la generazione del fenotipo serotoninergico. I neuroni serotoninergici derivano dalla stessa popolazione di precursori da cui originano, in fasi più precoci dello sviluppo embrionale, i motoneuroni. B) Geni espressi nei precursori fra 9 e 10.5 giorni di gestazione (E9-e10.5) nel topo utili per la produzione dei motoneuroni. C) Geni espressi nei precursori fra E10.5 e E12 utili per la specificazione dei neuroni serotoninergici.
1.6 Analisi del gene Pet-1
Il gene Pet-1 è stato identificato per la prima volta nei mammiferi e varie analisi condotte su questo gene hanno portato a stabilire un suo coinvolgimento nella specificazione dei neuroni serotoninergici.
Studi sulla localizzazione spazio-temporale dell’RNA messaggero per questo gene nel topo e nel ratto hanno rivelato una sua localizzazione a livello dei neuroni in grado di produrre e secernere serotonina, localizzati a livello del romboencefalo (Hendricks et al., 1999). Successivamente sono state condotte analisi di tipo funzionale in topo con la generazione di linee
“knock-out” per Pet-1.
Esperimenti di immunoistochimica con anticorpi contro la serotonina, condotti nei topi “knock-out”, hanno messo in evidenza l’assenza di questo neurotrasmettitore nel romboencefalo (Hendricks et al.,2003). Da analisi successive, è emerso che Pet-1 è un fattore di trascrizione indispensabile
per la trascrizione dei geni che permettono ai precursori di diventare neuroni serotoninergici differenziati, fra cui Tph2 (una delle due isoforme della triptofano idrossilasi) e ADCC (decarbossilasi degli aminoacidi aromatici) che rappresentano i due enzimi chiave attraverso i quali viene effettuata la sintesi della serotonina, e il Sert o 5HT-T (trasportatore della serotonina) e Vmat2 (trasportatore di vescicole monoaminiche) implicati rispettivamente nella “reuptake” della 5HT a livello del terminale assonico e nel trasporto dal corpo cellulare, dove viene prodotta, lungo l’assone (Cheng et al., 2003).
1.7 Struttura di Pet-1: Dominio ETS
Pet-1 fa parte di una famiglia di geni che codificano per proteine caratterizzate da un dominio altamente conservato durante l’evoluzione che prende il nome di ETS (“erythroblast transformation specific”). Questo dominio è caratterizzato dall’essere costituito da tre “α-eliche” intervallate da tre “foglietti-β” utili per interazioni sia con il DNA che con altre proteine (Sharrocks, 2001). Il legame al solco maggiore del DNA viene di solito mediato dalla α-elica 3, mentre le altre due eliche sembrano rappresentare le sedi di interazione proteina-proteina, tra queste ritroviamo proteine con motivi bHLH e fattori di vario genere come proteine Pax e GATA (Sharrocks, 2001). Questo ha permesso di ipotizzare che Pet-1 possa interagire con alcuni di questi fattori per esplicare la sua funzione (Craven et al., 2003; Pattyn et al., 2004).
Figura 3: Schema della struttura del dominio ETS. E' possibile riconoscere numerosi siti di interazione proteina-proteina e un sito di legame al solco maggiore del DNA (Sharrocks, 2001)..
1.8 Analisi dell’espressione genica di Pet-1 in ratto e topo
Dall’ analisi dell’ espressione spazio-temporale del gene Pet-1 condotta in topo e ratto, è emerso che questo gene viene attivato circa un giorno prima della comparsa dei primi neuroni serotoninergici al livello della parte più anteriore del romboencefalo (circa al decimo giorno di gestazione nel topo e al dodicesimo giorno in ratto). La specificazione dei neuroni serotoninergici termina dopo due giorni (stadi embrionali: E12.5 nel topo e E14 in ratto). L’espressione di Pet-1 si mantiene nei neuroni serotoninergici dei nuclei del raphe durante lo stadio adulto. Questi dati di espressione hanno anche mostrato che lo sviluppo dei neuroni serotoninergici, procede in senso antero-posteriore.
I primi neuroni serotoninergici differenziano nella porzione ventrale del tubo neurale al confine fra mesencefalo e romboencefalo.
Successivamente i neuroni serotoninergici compaiono in zone sempre più posteriori fino ad arrivare circa al livello del sesto-settimo rombomero, il penultimo degli otto segmenti in cui si suddivide il romboencefalo durante lo sviluppo (Hendricks et al., 1999).
E’ interessante notare, che in tutti i mammiferi analizzati, nel rombomero quattro i neuroni serotoninergici non sono prodotti, molto
probabilmente a causa del fatto che in questa zona viene prolungata temporalmente la specificazione dei motoneuroni, fino a circa E12 nel topo, (periodo in cui il fenotipo serotoninergico è già stato specificato), e conseguentemente si pensa che possano esistere fattori, quali Phox2b, che impediscono ai precursori di andare incontro alla specificazione in neuroni serotoninergici. Ricordiamo, infatti, che a livello dei rombomeri i motoneuroni e neuroni serotoninergici vengono originati a partire dalla stessa popolazione di precursori neurali (Pattyn et al., 2003).
A B
E14
A B
E14
Figura 4: A) Localizzazione spaziale dell'mRNA di Pet-1 in una sezione sagittale di un embrione di ratto a E14, la freccia mette in evidenza il confine fra mesencefalo e romboencefalo zona da cui inizia la specificazione dei neuroni serotoninergici. L'asterisco indica il rombomero4 dove, nei mammiferi, è presente il “Gap di r4”dovuto a una mancata produzione di neuroni serotoninergici (Hendricks et al., 1999). B) Ipotetico schema dei fattori coinvolti nello “swich” motoneuroni- neuroni serotoninergici a partire dai precursori (parte più alta dello schema) a livello di r2-r7. In basso nello schema è ipotizzato il meccanismo che si propone di spiegare la presenza del “Gap di r4” (Pattyn et al., 2003).
1.9 Studi funzionali sul gene Pet-1
Gli studi funzionali finora condotti su Pet-1 sono stati effettuati mediante il “knock-out” genico in topo, come già anticipato precedentemente, e studi di sovraespressione in pollo utilizzando la tecnica dell’elettroporazione. Dal “knock-out” di Pet-1 in topo è emerso che si ha una mancata produzione del fenotipo serotoninergici. Questo dato a portato a ipotizzare che questo fattore di trascrizione attivi la trascrizione dei geni necessari alla specificazione dei neuroni che producono 5HT. Infatti, le analisi di topi “knock-out”, tramite esperimenti di immunoistochimica con anticorpi contro la serotonina, sia a E11, quando i neuroni serotoninergici sono presenti ancora solo nella parte più anteriore del romboencefalo, che a E12, quando dovrebbero essere comparsi anche nella parte più posteriore, hanno evidenziato una drammatica riduzione di neuroni serotoninergici, sebbene l’anatomia complessiva del cervello rimanga apparentemente inalterata. I topi mutanti sono vitali e si sviluppano normalmente fino allo stadio adulto, le uniche anomalie individuate vengono da parametri comportamentali che permettono di valutare un aumentato stato di ansia e aggressività (Hendricks et al.,2003; Lesch et al., 2003).
Figura 5: Confronto fra sezioni sagittali di romboencefalo di topi selvatici (fig.A, C, E) e "Knock- out" per Pet-1 (fig.B, D,F) processati per immunoistochimica contro la serotonina. In figg A e B è riportato il confronto a E11.5, quando i neuroni serotoninergici si sono specificati solo nella parte più anteriore del romboencefalo ventrale, mentre in figg C, D, E, F ritroviamo i confronti a stadio E12.5 quando i neuroni serotoninergici hanno finito di specificarsi anche nella parte più caudale del romboencefalo ventrale. Come possiamo vedere si assiste ad una notevole divergenza nella produzione di neuroni serotoninergic, infatti nel “knock-out” per Pet-1 questi sono drammaticamente ridotti in numero (Hendricks et al.,2003).
Esperimenti di sovraespressione genica di Pet-1 sono stati effettuati in embrioni di pollo a stadio E2 (quando la somitogenesi è già cominciata) a livello del midollo spinale, territorio in cui normalmente non sono prodotti neuroni serotoninergici. Per questi esperimenti è stata utilizzata la tecnica dell’elettroporazione che consente di introdurre un opportuno vettore plasmidico contenente un cDNA di interesse all’interno della doccia del tubo neurale. Sottoponendo il tubo neurale ad una differenza di potenziale, tramite due elettrodi posti ai suoi lati, il vettore, essendo una molecola di DNA (è carico negativamente), migrerà all’interno delle cellule poste dalla parte dell’elettrodo positivo sovraesprimendo il cDNA di interesse solo in quel lato dell’embrione. Questi studi hanno messo in evidenza che elettroporando solo Pet-1 non si producono neuroni serotoninergici ectopici. L’ unica produzione di neuroni serotoninergici, fuori dai territori normalmente competenti, viene ottenuta elettroporando contemporaneamente a Pet-1 anche il cDNA dei geni Nkx2.2 e Lmx1b.
Questo ha permesso di ipotizzare una interazione fra questi fattori nella specificazione del fenotipo serotoninergico (Cheng et al., 2oo3).
Figura 6: Esperimenti di elettroporazione a E2 in pollo. A) Tecnica dell'elettroporazione eseguita a E2 dello sviluppo embrionale di pollo. B) Esperimenti condotti per produrre neuroni serotoninergici ectopici. Gli embrioni sono stati fatti crescere fino a E5. Nelle prime tre figure è possibile vedere come l’elettroporazione dei singoli geni Lmx1b, Pet-1 e Nkx2.2 (rilevata per ibridazione in situ) sebbene portino nel lato elettroporato ad un aumento dell’espressione del singolo gene, questo non è mai correlabile alla produzione di neuroni serotoninergici ectopici. Neuroni serotoninergici ectopici sono prodotti solo nel caso in cui i tre geni siano elettroporati contemporaneamente, come è possibile vedere nell’ultima immagine (Cheng et al., 2oo3).
1.10 Scopo della tesi
La comprensione dei meccanismi attraverso cui il sistema serotoninergico e la serotonina operano al livello del sistema nervoso centrale, necessita di una approfondita conoscenza dei meccanismi e delle interazioni molecolari che stanno alla base della produzione e del differenziamento dei neuroni serotoninergici durante lo sviluppo embrionale.
La mia tesi si è inserita in un progetto di ricerca volto a studiare i meccanismi che portano al differenziamento dei neuroni serotoninergici durante lo sviluppo embrionale di Xenopus laevis e in particolare la mia attenzione si è rivolta allo studio del gene Pet-1, codificante per un fattore di trascrizione espresso specificamente nei neuroni serotoninergici post- mitotici. Il cDNA di Pet-1 è già stato caratterizzato in alcuni mammiferi, mentre non è stato ancora isolato in Xenopus. Da esperimenti di perdita di funzione condotti nel topo è stato inoltre dimostrato che Pet-1 è necessario per la formazione e il differenziamento dei neuroni serotoninergici.
Durante il mio internato di tesi ho isolato il cDNA di XPet-1 a partire da una genoteca di Xenopus e ne ho studiato l’espressione spazio temporale durante lo sviluppo embrionale. Inoltre ho iniziato uno studio funzionale nello Xenopus in cui è possibile effettuare esperimenti di sovraespressione a partire da stadi molto precoci dello sviluppo embrionale in tutti i tessuti dell’embrione.
1.11 Xenopus laevis
La scelta di Xenopus laevis come modello sperimentale deriva da una serie di vantaggi che questo organismo è in grado di offrire. Xenopus, infatti, presenta numerosi vantaggi dal punto di vista del ciclo vitale rispetto ai modelli sperimentali dei mammiferi, che seppur più vicini evolutivamente all’uomo sono più difficili da analizzare. Prima fra tutte lo sviluppo esterno degli embrioni che permette di effettuare un’analisi fenotipica allo stadio embrionale desiderato. La grande quantità di uova, prodotte da un’unica femmina, permette di avere un numero molto grande di embrioni da poter analizzare ad ogni esperimento. Lo sviluppo embrionale veloce permette di avere tutti gli stadi embrionali in un lasso di tempo relativamente breve.
Per quanto riguarda i saggi funzionali che possono essere svolti sono numerosi, ma principalmente è possibile eseguire esperimenti di guadagno e perdita di funzione microiniettando rispettivamente gli RNA di interesse trascritti in vitro o oligonucleotidi antisenso modificati, detti “morpholino”, in uno dei due lati dell’embrione. Co-iniettando, inoltre, l’mRNA codificante per una proteina “reporter” quale la “GFP” (Green Fluorescent Protein) o il LacZ (codificante per la β-galattosidasi) è possibile identificare i territori dell’ embrione dove l’RNA o il “morpholino” si è localizzato e conseguentemente analizzare solo i fenotipi di nostro interesse.
Figura 7: Ciclo vitale dello Xenopus laevis. A) Embrione allo stadio di blastula (stadio 9). B) embrione a stadio di larva natante (stadio 37-38). C) Xenopus adulto. D) Schema dell'intero ciclo vitale.
