Le metodiche molecolari di ultima generazione sono impiegate, con notevole successo, nello studio di al-cune branche della biologia molecolare, come la genomica, la trascrittomica e la proteomica.
La genomica si occupa di studiare la struttura, il contenuto, la funzione e l’evoluzione del genoma degli organismi viventi. La trascrittomica e la proteomica si occupano dello studio dei componenti molecolari derivati dal genoma (quali mRNA e proteine) e permettono di avere una visione dettagliata degli eventi che sono avvenuti in una cellula o in un organismo.
Nel campo dell’infettologia le tecniche di sequenziamento massivo del genoma permettono la descrizione accurata di intere mappe genomiche, con la conseguente scoperta e identificazione di nuovi patogeni. Questo aspetto è particolarmente importante in quanto i crescenti flussi migratori e la vicinanza a “serbatoi” virali negli animali d’allevamento, da cui nuovi virus possono effettuare il salto di specie ed arrivare all’uomo, hanno fatto riaffacciare malattie che si pensavano completamente debellate in Europa. La tubercolosi, la SARS e le nuove pandemie influenzali sono un esempio di malattie riemergenti ed emergenti. Anche la diffusione di ceppi batterici con farmacoresistenze multiple è da considerare un rischio di carattere pandemico.
Un altro aspetto riguarda lo studio della variabilità microbica, in particolare virale, la cui conoscenza per-mette l’utilizzo di nuovi farmaci, che colpiscono diverse fasi della replicazione virale, quali l’ingresso del virus nella cellula ospite e l’integrazione del genoma virale nel patrimonio genetico della cellula ospite. Inoltre, la conoscenza della presenza di varianti virali resistenti ai farmaci permette di prevedere se una classe di farmaci sarà efficace o meno.
Queste metodiche rappresentano un enorme avanzamento rispetto alle tecniche finora utilizzate in quanto in un unico esperimento si ottiene una grandissima quantità di dati che con i metodi tradizionali si otterrebbero in mesi di lavoro. Per questo motivo si parla di tecniche caratterizzate dall’elevato contenuto informativo (high throughput).
Allo stesso tempo, queste nuove tecnologie richiedono ingenti risorse di calcolo e personale con compe-tenze bioinformatiche e biostatistiche per l’archiviazione e l’analisi dei dati.
Presso l’Istituto Nazionale per le Malattie Infettive “L. Spallanzani” di Roma, da novembre 2007, è in fun-zione una piattaforma (GS-FLX Roche) per il sequenziamento massivo, che viene utilizzata per applicazioni in campo virologico. Una prima importantissima applicazione è stata l’analisi di porzioni genomiche coinvolte nei fenomeni di farmaco-resistenza e nel tropismo virale. È stato possibile riconoscere, nella popolazione virale presente nei pazienti, la presenza di varianti virali minoritarie, non rilevabili con le comuni tecniche di sequenziamento, che possono fornire al virus caratteristiche di resistenza ad alcuni farmaci. Questi risultati Negli ultimi anni si è verificato un intenso avanzamento
nello studio di alcune tecniche molecolari, tra cui spicca il sequenziamento massivo di DNA, che sta determinando un rivoluzionario cambiamento nell’approccio diagnostico alle malattie da infezione. Affinché tutto questo si traduca in un reale beneficio per i pazienti è necessaria una pro-ficua interazione tra ricercatori bioinformatici e sperimen-tali che possa rendere automatico il processo di analisi e semplificare gli strumenti di interpretazione del risultato.
L’USO DI SEQUENZIATORI
DI ULTIMA GENERAZIONE NELLA LOTTA AI VIRUS
Maria Rosaria Capobianchi
maria.capobianchi@inmi.it
Isabella Abbate
abbate@inmi.it
Istituto Nazionale per le Malattie Infettive L. Spallanzani
Giovanni Chillemi
g.chillemi@caspur.it
Gruppo di Biologia e Medicina Computazionale del CASPUR
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hanno un importante impatto sui pazienti, in quanto gli evitano di utilizzare farmaci non efficaci, riducendo di conseguenza gli effetti collaterali con benefici sia per i pazienti stessi sia per la spesa sanitaria.
La messa a punto di protocolli per la caratterizzazione di interi genomi virali, inoltre, sta consentendo di intraprendere studi di epidemiologia molecolare per il monitoraggio delle nuove varianti di virus HIV-1 presenti in Italia. Lo scorso anno, grazie a questa nuova strategia di sequenziamento, i ricercatori dello Spallanzani
hanno identificato, in una infezione primaria con esito fatale, una rara forma ricombinante di HIV-1 derivante dalla fusione di due sottotipi (B ed F). In Figura 2 è riportata la variabilità per ogni base di DNA dell’intero ge-noma di questo particolare ceppo di HIV-1 (prevalence), insieme all’entità del risequenziamento stesso (co-verage). Tramite l’analisi filogenetica è stato possibile scoprire che il virus in questione è molto simile a varianti virali finora ristrette a zone geografiche distanti dall’Italia, come il Brasile.
Un’altra applicazione strategica delle tecnologie di sequenziamento massivo è la cosiddetta metagenomica, che permette lo studio del materiale genetico presente in un campione ambientale. Attraverso il sequenzia-mento massivo di campioni ambientali possono essere identificati microrganismi non “coltivabili” in labora-torio, con la conseguente possibilità di studiare comunità microbiche presenti nel campione clinico senza la necessità di “coltivare” il patogeno in laboratorio. Questo approccio ha consentito lo studio del virus pandemico influenzale H1N1 in tamponi nasofaringei dei pazienti infetti, ottenendo in alcuni casi la caratterizzazione quasi dell’intero genoma virale. Il sequenziamento massivo abbinato all’approccio metagenomico rappresenta uno strumento prezioso per l’identificazione di nuovi patogeni, estremamente utile in un Istituto dedicato alle emergenze infettivologiche, come lo Spallanzani.
L’insieme delle applicazioni in campo virologico servirà non solo ad approfondire aspetti patogenetici ma anche per ricerche di tipo applicativo diagnostico.
L’elemento che rappresenta un rilevante collo di bottiglia per la diffusione di queste nuove tecnologie è l’analisi bioinformatica dei dati. A questo proposito, sono necessarie ed auspicabili ampie reti di collaborazione tra gli Istituti di Ricerca per la messa a punto di strategie di analisi bioinformatica standardizzate e condivise, grazie alle quali l’avanzamento biotecnologico e biomolecolare possa fornire, in breve tempo, strumenti re-almente fruibili da tutta la comunità scientifica. In questo senso, la collaborazione tra il Laboratorio di Virologia dell’INMI “L. Spallanzani” ed il CASPUR può rappresentare un punto di inizio per far convergere idee ed ini-ziative, che coinvolgano ricercatori provenienti da diversi istituti che si interessano delle problematiche legate all’utilizzo dei sequenziatori di nuove generazione.
Fig. 1Struttura del virus dell’immunodefi-cienza umana (HIV)-1.
BIBLIOGRAFIA ESSENZIALE
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