Caserta 31 maggio 2008
Cristina Massai Clinica Pediatrica II
Ospedale Meyer Università di Firenze
Diagnosi e tipizzazione di IPD in biologia
molecolare direttamente da campione clinico in
pazienti con terapia antibiotica in atto
tempo dopo la somministrazione dell’antibiotico [ore]
tempo di sterilizzazione del liquor cefalo-rachidiano dopo somministrazione di antibiotico per via parenterale
Kanegaye JT et al. Pediatrics 2001; 108: 1169-1174
24 18
12 6
coltura positiva coltura negativa
Neisseria meningitidis Streptococcus pneumoniae Streptococcus gruppo B
Dipartimento di Pediatria Università di Firenze
Coltura PCR
Richiede
non terapia antibiotica precedente
OK se terapia antibiotica precedente
germe vivo germe anche morto
terreni di coltura adeguati anche in fisiologica
anche campione “già usato”
trasporto rapido a t°C ambiente anche 48h
laboratorio microbiologia tecniche e macchinari semplici
Si estrae il DNA
Si parte da sangue intero
Primers per:
9V 14 23F 6B
Nucleotidi Enzimi
DNA estratto altri
Sierotipizzazione: PCR- Multiplex Sequenziale
Diagnosi e sierotipizzazione mediante PCR multiplex sequenziale di infezioni
pneumococciche in età pediatrica (BP + meningiti/sepsi)
RT-PCR n: 22/98 Coltura n: 4/98
0 5 10 15 20 25 30 35
%
di
casi positivi
25/98
hanno fatto breve terapia antibiotica
prima
del ricovero
0 5 10 15 20 25 30 35 40
RT-PCR n: 9/25 Coltura n: 0/25
%
di casi positivi
Paz. con pregressa Paz. con pregressa terapia
terapia antibioticaantibiotica
Distribuzione dei sierotipi isolati in corso di malattie invasive del bambino
Sierotipo contenuto nel vaccino eptavalente
3
2
1
0
polmonite meningite
sepsi artrite
Esame colturale Esame colturale
Azzari C, Moriondo M, Massai C, Resti M.
J Med Microbiol 2008
Distribuzione dei sierotipi isolati in corso di malattie invasive del bambino
Sierotipo contenuto nel vaccino eptavalente Azzari C, Moriondo M, Massai C, Resti M.
J Med Microbiol 2008
3
2
1
0
polmonite meningite
sepsi artrite
6 8 19F 1 3 4 12 14 18 18C 19A ? ? 4 6 9V/A 23F 22F ?
Esame PCR
Esame PCR
Parliamo di costi……
Un apparecchio per real-time PCR Un apparecchio per PCR standard
25.000 € 5.000 €
Un test di diagnosi
Un test di sierotipizzazione
5 € 12 €
La sola sierotipizzazione da coltura costa 45 €
(gli stessi che usiamo per HCV, HIV, CMV)
Progetto sorveglianza nazionale delle infezioni invasive Meningococco, pneumococco, Haemophilus
Miglioramento della possibilità di diagnosi mediante biologia molecolare
Sensibilizzazione al problema
Centralizzazione presso l’Ospedale Meyer dei campioni per diagnosi
Diffusione delle metodiche diagnostiche molecolari a tutte le regioni
I fase
II fase
Progetto Malattie Invasive Laboratorio Immunologia Meyer
Viale Pieraccini 24 50139 FIRENZE
progetto.malattieinvasive@meyer.it
L’esecuzione del test è gratuita La risposta viene inviata via FAX
all’ospedale richiedente entro 48 ore dall’arrivo
c.azzari@meyer.it m.resti@meyer.it
Chiamare TRACO 10 - Tel. 803-868
La spedizione del campione è
gratuita (a carico del destinatario)
Indicare “PORTO ASSEGNATO”
Grazie per l’attenzione!!!!
IPD in bambini italiani valutata con coltura IPD in bambini italiani valutata con coltura
D’Ancona F. Vaccine 2005 Italian PNC-Euro Working group
0 10 20 30 40 50
X 100.000 60
piemonte puglia
11
6
< 2 anni
11,511,5
Azzari Resti 2007
Provincia di Firenze
Incidenza di infezioni invasive
Incidenza di infezioni invasive pneumococciche pneumococciche (IPD) (IPD) valutata con PCR o mediante coltura
valutata con PCR o mediante coltura
Casi x 100.000
Incidenza di IPD Incidenza di IPD
nella popolazione pediatrica fiorentina nella popolazione pediatrica fiorentina
valutata mediante coltura valutata mediante coltura
0 10 20 30 40 50 60
<1 anni 11,2
<2 11,5
<5 4,7
<14 3,6
Casi x 100.000
anni
Incidenza di IPD Incidenza di IPD
nella popolazione pediatrica fiorentina nella popolazione pediatrica fiorentina
valutata mediante PCR valutata mediante PCR
0 10 20 30 40 50 60
<1 55,8
<2 51,8
<5 35,1
<14 19,9
RT-PCR nella diagnosi di infezioni invasive da pneumococco
0 5 10 15 20 25
Broncopolmoniti n: 82 Broncopolmoniti n: 82
positivi RT-PCR n: 18 positivi Coltura n: 2
%
0 20 40 60 80 100
positivi RT-PCR n: 11 positivi Coltura n: 5
Meningiti / sepsi n: 11 Meningiti / sepsi n: 11
Pneumo
Pneumo -Meningo - Meningo
%
Progetto Malattie Invasive
Real-Time PCR per PNEUMOCOCCO: primer per gene PLY
(pneumolisina) conferma primer cps-A (PCR in gel di agarosio)
4 campioni
Entità di
fluorescenza
Cicli di amplificazione nel tempo
L’amplificazione di un prodotto significa presenza di DNA specifico Si evidenzia come incremento di fluorescenza
