Iperomocisteinemia, stress ossidativo, danno endoteliale e menopausa
D. Pulvirenti1, S. Signorelli2, S. Sciacchitano3, L. Di Pino2, A. Tsami1, L. Ignaccolo1, S. Neri1
1U.O. di Medicina Interna; 2U.O. di Angiologia, Dipartimento di Medicina Interna e Patologie Sistemiche; 3Dipartimento di Ostetri- cia, Ginecologia e Radiologia, Università di Catania, Italia
Articolo originale
Clin Ter 2007; 158 (3):213-217Corrispondenza: Dott. Davide Pulvirenti, Dipartimento di Medicina Interna. Policlinico di Catania, Via S. Sofi a 86, 95123 Catania, Italia.
Tel. e Fax +039.095.3782908; E-mail: [email protected] Introduzione
L’aterosclerosi rappresenta la principale causa di mor- talità e morbilità cardiovascolare nei Paesi sviluppati (1).
Nonostante pareri concordi e studi signifi cativi che tracciano le tappe principali della sua eziopatogenesi, alcuni degli aspetti fondamentali della patologia aterosclerotica restano ancora poco chiari. Molteplici fattori di rischio generali o
Riassunto
Obiettivo. Diverse segnalazioni della letteratura, sembrano con- fermare l’associazione tra elevati livelli plasmatici di omocisteina ed elevazione del rischio cardiovascolare. Abbiamo studiato un gruppo di donne in età fertile e in menopausa con assenza di segni clinici di malattia cardiovascolare per verifi care l’eventuale correlazione tra livelli plasmatici di omocisteina, spessore medio-intimale e stress ossidativo.
Materiali e Metodi. Abbiamo preso in considerazione 68 donne (34 in età fertile con età media di 42 ± 2 anni; 34 in menopausa con età media di 48 ± 3 anni) con un Indice di Massa Corporea (BMI) di 21 ± 3 kg/m² nel primo gruppo e di 22 ± 2 kg/m² nel secondo gruppo.
Risultati. Le nostre rilevazioni hanno evidenziato un moderato aumento di omocisteinemia plasmatica (12,78 ± 0,66 µmol/L) nelle donne in menopausa rispetto alle donne ancora fertili. Nelle donne in menopausa lo spessore medio intimale (IMT) era signifi cativamente (p<0.001) aumentato (1,15 ± 0,25mm) rispetto alle donne in età fertile (0,80 ± 0,15mm). Nelle donne in menopausa abbiamo rilevato un aumentato stress ossidativo dimostrato da aumentati livelli plasmatici di LDLox (12,11 ± 0,01 nmol/mL) e 4-HNE (2,3 ± 0,02 µmol/dL), utilizzati da noi come marker di ossidazione.
Conclusioni. Le correlazioni positive rilevate tra livelli di omoci- steina e IMT nelle donne in menopausa ci consentono considerazioni che indicano nell’elevazione dei livelli di omocisteinemia un possibile fattore di rischio nella progressione della patologia aterosclerotica. La carenza di estrogeni nelle donne in menopausa, potrebbe condurre ad un aumentato stress ossidativo ed a un aumento dei livelli di omoci- steinemia. Clin Ter 2007; 158(3):213-217
Parole chiave: omocisteina, spessore medio-intimale, stress ossidativi, aterosclerosi
Abstract
Hyperhomocysteinemia, oxidative stress, endothelial dysfunction in postmenopausal women
Aim. Menopause seems to accelerate the development of athero- sclerosis and cardiovascular diseases. Several studies show a signifi cant correlation between elevated homocysteine serum levels and increased cardiovascular risk. Oxidative stress is involved in the pathophysiology of endothelial dysfunction and atherosclerosis. Our study aim was to assess the correlations between intima-media thickness, homocysteine serum levels and oxidative stress both in fertile and postmenopausal women.
Materials and Methods. We have investigated 34 fertile women (mean age= 42 ± 2 yrs; BMI= 21 kg/m² and 34 postmenopausal women (48 ± 3 yrs; BMI= 22 ± 2 kg/m²).
Results. Results show increased levels of homocysteine, oxidative stress and intima-media tickness (IMT) in postmenopausal women, having a positive correlation with IMT.
Conclusions. The positive correlations between serum levels of homocysteine and IMT in postmenopausal women reinforce the idea that a hyperhomocysteinemia may play a role in the progression of atherosclerosis. The lack of estrogens could be a pathophysiologic risk factor for endothelial damage via an augmented oxidative stress. Clin Ter 2007; 158(3):213-217
Key words: atherosclerosis, homocysteine, intima-media tickness, oxidative stress
sistemici conferiscono una predisposizione allo sviluppo di questa malattia. Studi prospettici hanno dimostrato, infatti, diverse signifi cative associazioni e un incremento dell’in- cidenza della aterosclerosi in relazione al fumo di sigaretta, alla ipertensione, al diabete, alle dislipidemie, all’ obesità, al sesso maschile, all’età e persino a particolari caratteristiche della personalità e alla presenza di determinanti genetici; a livello molecolare viene riconosciuto un ruolo di primaria
importanza allo stress ossidativo e alla glicazione non en- zimatica (1).
Diverse segnalazioni della letteratura, sembrano confer- mare l’associazione tra elevati livelli plasmatici di omocisteina ed ispessimento medio intimale delle carotidi, considerato come un buon indice indiretto di valutazione della pro- gressione aterosclerotica nel vaso arterioso (2-3), oltre che una altrettanto signifi cativa associazione tra il suo aumento plasmatico ed un consensuale aumento del rischio di infarto del miocardio ed ictus cerebrale (2-10) cosicché anche per l’iperomocisteinemia viene ormai postulato un ruolo quale fattore di rischio indipendente per malattia cardiovascolare.
Questa osservazione ci ha indotto a studiare un gruppo di donne in età fertile e in menopausa, ma con assenza di segni clinici di malattia cardiovascolare, con i seguenti obbiettivi:
1) verifi care l’eventuale correlazione tra livelli plasmatici di omocisteina e stato post-menopausale;
2) verifi care l’eventuale correlazione tra livelli plasmatici di omocisteina e spessore medio-intimale arterioso;
3) verifi care l’eventuale correlazione tra livelli plasmatici di omocisteina e stress ossidativo;
4) valutare il ruolo della iperomocisteinemia in età post- menopausale, quale fattore di rischio indipendente.
Materiali e Metodi
Abbiamo preso in considerazione 68 donne (34 in età fertile con età media di 42 ± 2 anni; 34 in menopausa con età media di 48 ± 3 anni) con un Indice di Massa Corporea (BMI) di 21 ± 3 kg/m² nel primo gruppo e di 22 ± 2 kg/m² nel se- condo gruppo. Al fi ne di non interferire con le determinazioni effettuate, specie sui markers dell’ossido riduzione, per 15 giorni precedenti lo studio era fatto divieto a tutti i pazienti di assumere qualsiasi farmaco o alcolici e di sottoporsi a stress fi sici di particolare intensità (palestra). Nei 3 giorni che precedevano l’esame, le pazienti selezionate dovevano inoltre consumare una dieta bilanciata contenente quantità note di metionina, comunque priva di caffè, thè e cioccolata.
Venivano adottati i seguenti criteri di esclusione dallo studio:
1) uso cronico di farmaci, vitamine, antiossidanti, terapia ormonale sostitutiva;
2) fumo di sigaretta;
3) consumo di alcolici ≥ 20 gr/die;
4) diabete mellito;
5) intolleranza al glucosio dopo determinazione di glicemia a digiuno e prova da carico;
6) patologie croniche polmonari, epatiche e renali, infezioni delle vie urinarie, malattie infi ammatorie ed autoimmuni, neoplasie, cerebrovasculopatie croniche;
7) attività lavorativa potenzialmente in rapporto con pato- logie professionali.
Tutte le pazienti venivano sottoposte alle seguenti de- terminazioni:
– Creatinina (autoanalyser) per escludere l’insuffi cienza renale;
– Glicemia a digiuno con prova da carico con 75 g di glucosio e curva insulinemica (mediante metodica ra- dioimmunologica a doppio anticorpo in fase solida);
– Microalbuminuria (defi nita come escrezione di albumina delle 24h compresa tra 20 e 200 mg/l);
– Colesterolemia (v.n. <200 mg/dl) e trigliceridemia (v.n.
<165 mg/dl), determinati con metodica enzimatica in mmol/l (Boehinger Mannheim, Germany);
– LDL (v.n. 0-160 mg/dl) ed HDL (v.n. 45-65 mg/dl), determinate con metodica immunoenzimatica (Boehin- ger Mannheim, Germany), dopo separazione mediante ultracentrifugazione;
– 4-HNE (v.n. 1,25 ± 0,3 µmol/dL), misurato mediante dosaggio spettrocolorimetrico (11-12);
– Glutatione perossidasi plasmatico (GSH Px) (v.n. 6,02
± 0,1 IU/mL) misurata nel plasma mediante dosaggio spettrofotometrico (13);
– LDL-ox (v.n. 13,8 nmol/mL), plasmatiche chelate con EDTA mediante ultracentrifugazione (Beckman) a 4°C e dopo incubazione in una soluzione di fosfato salino a cui erano stati aggiunti come ossidante 10 nanomol di cloruro di rame (CUCL2); l’ossidazione veniva seguita dal controllo della formazione a 37°c di idroperossido di lipidi coniugati con diene, a 234 nanomol, usando uno spettrofotometro (Beckman). Il tasso di ossidazione veniva misurato in nanomol di idrossi-perossidi formati per minuto e per milligrammo di LDL (leg-phase);
– Omocisteina (v.n. 9 ± 2.5 µmol/L) determinata contro standard noto, mediante la metodica HPLC (High Pressure Liquid Chromatography) su campioni di plasma preparati utilizzando KIT commerciali (Chromsystems). In partico- lare a 100 microlitri di ogni campione di plasma, venivano aggiunti 25 microlitri di standard interno e 25 microlitri di reagente di riduzione; dopo aver agitato ed atteso 5 minuti, venivano aggiunti 100 microlitri di reagente di precipitazione e dopo agitazione per ulteriori 30 secondi, il campione veniva sottoposto a centrifugazione a 9000 giri per 7 minuti fi no a separazione della fase liquida da quella solida. 50 microlitri di surnatante venivano quindi, aggiunti a 100 microlitri di miscela di derivatizzazione e messi ad incubare per 10 minuti a 55°C. Dopo rapido raffreddamento, 20 microlitri dei campioni così ottenuti, venivano iniettati in cromatografo HPLC Perkin Helmer LC240 (Colonna C-18 a fase inversa, detector a fl uore- scenza, λEX 385 nm, λEM 515 nm, fl usso 1,5 ml/min).
Tutte le pazienti sono state sottoposte ad esame ecocolor- doppler per la misurazione dello spessore medio intimale (ecografo ATL Apogée 800 con sonda lineare elettronica da 7,5 MHZ); sono state acquisite immagini circonferenziali e longitudinali della carotide comune, bulbo carotideo, carotide interna, arteria femorale, eseguite in cieco dallo stesso operatore che ha utilizzato protocolli standard di acquisizione e di lettura delle immagini.
La misurazione della pressione arteriosa è stata eseguita sullo stesso braccio in posizione supina, calcolando la media di tre misurazioni successive effettuate ogni dieci minuti.
Di tutte le pazienti sono stati acquisiti i rilievi di peso, altezza, BMI, rapporto vita fi anchi (WHR).
Analisi statistica
I risultati ottenuti venivano valutati mediante analisi statistica computerizzata (STAT-1). I risultati sono espressi
come medie ± DS. Sono stati usati i seguenti test statistici:
Student t-test, Pearson χ2-test, covarianza (ANCOVA) e regressione multipla lineare (ANOVA). Valori di P<0,05 sono stati considerati signifi cativi.
Risultati
Sottoponendo i risultati ottenuti ad analisi statistica, abbiamo rilevato le seguenti correlazioni:
Le nostre rilevazioni hanno evidenziato (Fig.1) un mo- derato aumento di omocisteinemia plasmatica (12,78 ± 0,66 µmol/L) nelle donne in menopausa rispetto ai nostri valori normali di riferimento (9 ± 2,25 µmol/L) riscontrati nelle donne ancora fertili. La comparazione era statisticamente signifi cativa con p<0,001.
Nelle donne in menopausa lo spessore medio intimale (IMT) era di 1,15 ± 0,25mm, signifi cativamente aumentato rispetto alle donne in età fertile (0,80 ± 0,15mm) (Fig. 2).
Nel gruppo delle donne in menopausa abbiamo rile- vato un aumentato stress ossidativo (p<0.05) dimostrato da aumentati livelli plasmatici di LDLox (12,11 ± 0,01 nmol/mL) e 4-HNE (2,3 ± 0,02 µmol/dL), utilizzati da noi come markers di ossidazione, contro un loro valore nella norma (LDLox 5,47 ± 0,01 nmol/mL e 4-HNE 1,25 ± 0,14 µmol/dL), delle donne fertili (Fig. 3).
Discussione
L’omocisteina è un prodotto intermedio della via meta- bolica della metionina, aminoacido che, una volta attivato ad S-adenosil-metionina, funge da donatore di gruppi metilici, trasformandosi in omocisteina. L’aumento dei livelli pla- smatici di omocisteina è il risultato di una combinazione di fattori genetici ed ambientali (4, 9, 10). La più convincente dimostrazione di una relazione causale tra elevati livelli pla- smatici di omocisteina e patologia trombotica origina dalle rilevazioni effettuate sui pazienti affetti da omocistinuria, una condizione patologica geneticamente determinata e caratterizzata da malformazioni e precoci manifestazioni trombotiche arteriose e/o venose. Alcuni lavori suggeriscono come l’iperomocisteinemia possa essere la manifestazione di un disordine biologico, non ben inquadrato, associato al processo di metilazione del DNA (4-10, 14). Dati sperimen- tali indicano che la malattia aterosclerotica connessa alla iperomocisteinemia potrebbe essere il risultato di un danno endoteliale con trombofi lia, con alterazioni della funzionalità piastrinica e dei sistemi coagulativi e fi brinolitici. L’esatto meccanismo del danno endoteliale è ancora ignoto ma da molti autori viene segnalata la possibilità che un aumento dello stress ossidativo, per eccesso di produzione di ossi- danti, possa scaturire dall’autoossidazione della omocisteina (4-10, 15-17).
I composti tiolici come l’omocisteina, sono, infatti, specie chimiche molto reattive (15, 16, 18). L’omocisteina nel plasma va rapidamente incontro ad auto-ossidazione for- mando omocistina, disulfi di misti e omocisteina-tiolattone.
Durante tale processo si vengono a generare specie reattive dell’ossigeno come il superossido ed il perossido di idro-
Fig. 1. Correlazione tra livello circolante di estrogeni e livelli plasmatici di omocisteina (p<0,001).
Fig. 2. Correlazione tra livello circolante di omocisteina e spessore medio intimale della carotide comune (p<0,001).
Fig. 3. Correlazione tra stato di stress ossidativo e livelli plasmatici di mocisteina (p<0,01).
geno, reputate esse stesse, da molti studi, responsabili del danno endoteliale indotto dall’omocisteina. La produzione di radicali liberi dell’ossigeno è in grado di determinare, inoltre, perossidazione dei lipidi, che si verifi ca sia a livello delle membrane delle cellule endoteliali che delle lipopro- teine circolanti (18).
In associazione ad alterazioni del bilancio ossido-redut- tivo sono stati descritti (5-7, 9-10, 15, 17, 19) anche stati di attivazione di fattori procoagulanti, un ridotta attivazione della proteina C ed una inibizione dell’attività del tPA a livello endoteliale nonché iperaggregabilità piastrinica, aumento del fattore XII, del fattore V, della protrombina e della espressione della trombomodulina sulla membrana endoteliali con ipercoagulabilità e trombofi lia. Tutto ciò può essere messo in relazione alla già citata ossidazione delle LDL e a tale proposito, diversi studi (4-10, 14-16, 18) documentano come lipoproteine ossidate, siano in grado di determinare, in vitro, attivazione piastrinica e produzione di trombossano (TX) A2 e come, al contrario, la sommi- nistrazione di antiossidanti riesca a ridurre l’escrezione di metaboliti del TX.
L’omocisteina si è rivelata in grado di potenziare la pro- duzione di NO da parte delle cellule della muscolatura liscia vasale di topo, indotta dalla interleuchina-1 beta, tramite una inibizione della vasodilatazione endotelio dipendente (ma non di quella endotelio indipendente). Questo effetto media- to dall’omocisteina, e comune ad altri aminoacidi solforati, è contrastato da scavengers di radicali liberi (15).
In condizioni normali NO reagisce con l’omocisteina cir- colante formando S-nitroso-omocisteina (SNOHO). Questa ultima ha una potente attività antipiastrinica e vasodilatatrice ed un’emivita di 15 minuti, ben superiore a quella dell’NO che è di pochi secondi. La nitrosilazione dei gruppi sulfi dri- lici dell’omocisteina, previene l’auto-ossidazione di questa sostanza e, quindi, la generazione di radicali liberi. In con- dizioni normali, dunque, la tossicità dell’omocisteina viene neutralizzata dalla formazione di SNOHO. Quando invece i livelli di omocisteina sono cronicamente elevati, vengono saturate le quantità di NO disponibili e l’omocisteina in ec- cesso produce danno endoteliale con conseguente riduzione della produzione stessa di NO e della formazione di SNOHO, con una conseguente riduzione del potenziale antipiastrinico e vasodilatatore (19, 20). Anche la perossidazione lipidica può infl uire sulla produzione di NO, determinando una riduzione dell’espressione della NO-sintetasi endoteliale e la stessa degradazione dell’NO.
Da una prima sintesi dei risultati della letteratura sem- brerebbe dunque che i meccanismi atero-trombogeni della iperomocisteinemia possano essere correlati in primo luogo allo stress ossidativo innescato dall’auto-ossidazione dei gruppi tiolici.
Uno studio prospettico (21) sulle donne in menopausa ha evidenziato un aumento della concentrazione plasmatici di LDL ed LDL ossidate ed una consensuale caduta delle HDL durante la menopausa. Ciò è stato spiegato attraverso un meccanismo polifattoriale dovuto alla carenza di estroge- ni e in particolare di estradiolo e una riduzione di funzione dei recettori per le LDL, alterazione della sintesi epatica di apo A1, riduzione della inibizione dell’ossidazione delle LDL, alterazione delle normali proprietà non trombogeniche endoteliali.
Nel lavoro di cui presentiamo i risultati, l’indicatore di danno anatomo-patologico vascolare utilizzato per tentare una correlazione con i livelli di omocisteina e stress ossida- tivo è lo spessore medio intimale (IMT).
Per quanto riguarda i livelli di omocisteinemia plasmatica, le pazienti in menopausa della nostra casistica presentavano iperomocisteinemia, sia pure in assenza di un corrispettivo clinico impegno patologico cardiovascolare. I livelli di tale sostanza erano signifi cativamente più elevati rispetto al grup- po delle donne fertili. In effetti, gli estrogeni sono capaci di interferire nel metabolismo dell’omocisteina, svolgendo una attività protettiva in grado di abbassare i livelli plasmatici di questa sostanza. Gli estrogeni modulano il metabolismo dell’ac. Tiolo-aminico, in particolare nel metabolismo della metionina, interferendo con la via di transufurazione, dimi- nuendo il tasso di omocisteina e prevenendone l’accumulo;
essi possono aumentare il tasso di produzione di GSH, stabilizzare l’ossido di azoto (NO), contribuendo così a provocare effetti benefi ci sul sistema vascolare. Inoltre, gli estrogeni abbassano i livelli di vitamine (folati e vit. B12) e transulfurazione (B6) dell’omocisteina (19-22).
Per ciò che riguarda il rapporto tra stato di iperomoci- steinemia, evidenziato nelle donne in menopausa, e IMT, i nostri risultati dimostrano un netto aumento di questo ultimo rispetto al gruppo delle donne in età fertile.
Inoltre, abbiamo rilevato, sempre nelle donne in meno- pausa iperomocisteinemiche, un signifi cativo aumento dei marcatori di stress ossidativo LDLox e 4-HNE.
In accordo con altri autori (2, 23, 24), le correlazioni positive rilevate tra livelli di omocisteina e IMT nelle donne in menopausa ci consentono considerazioni che indicano nell’elevazione dei livelli di omocisteinemia un possibile fattore di rischio nella progressione della patologia atero- sclerotica.
Dunque, secondo tale interpretazione, la carenza di estro- geni nelle donne in menopausa da noi evidenziato, potrebbe condurre ad un aumentato stress ossidativo ed a un aumento dei livelli di omocisteinemia; mentre la presenza di estrogeni nelle donne fertili avrebbe un contrario effetto inibente l’ac- cumulo plasmatico della sostanza probabilmente attraverso un’infl uenza indiretta esercitata sull’omocisteina mediante la modifi ca dei livelli plasmatici disponibili di folati e vitamina B12, sostanze che, come già citato, sembrano in grado di infl uenzare direttamente la produzione di omocisteina.
Sebbene tempo e nuove ricerche siano ancora necessarie, concludiamo il nostro studio ipotizzando per l’iperomoci- steinemia un ruolo comprimario nello sviluppo dell’atero- genesi durante lo stato postmenopausale; un ruolo di fattore di rischio cardiovascolare come variabile dipendente da una serie di fattori, dei quali proprio lo stato postmenopausale potrebbe risultare il più evidente, attraverso una possibile azione inibente i livelli plasmatici di folati e vitamina B12 e l’elevazione dei livelli di stress ossidativo.
Bibliografi a
1. Volpe M, Savoia C. L’aterosclerosi. In: Teodori Trattato Italiano di Medicina Interna, VII Ed Cugini P, Fiorelli G, Guarini G, Lopez M, Violi F, Volpe (eds) M, SEU, Roma, 2004; 299-308
2. Signorelli SS, Neri S, Sciacchitano S, et al. Behaviour of some indicators of oxidative stress in postmenopausal and fertile women. Maturitas 2006; 53:77-82
3. Charvat J, Michalova K, Chlumsky J, et al. The signifi cance of carotid artery plaques in the detection of coronary artery disease in asymptomatic type 2 diabetic patients. J Int Med Res 2006; 34:13-20
4. Ueland PM. Homocysteine species as components of plasma redox thiol status. Clin Chem 1995; 41:340-2
5. Ozkan Y, Ozkan E, Simsek B. Plasma total homocysteine and cysteine levels as cardiovasvular risk factors in coronary heart disease. Int J Card 2002; 82:269-77
6. Doshi SN, Goodfellow J, Lewis MJ, et al: Homocysteine and endothelial function. Cardiovasc Res 1999; 42:378-82 7. Bots ML, Launer LJ, Lindemans J, et al. Homocysteine and
short-term risk of myocardial infarction and stroke in the eld- erly: the Rotterdam study. Arch Intern Med 1999; 159:38-44 8. McCully KS. Homocysteine and vascular disease. Nat Med
1996; 2:386-9
9. Langmann LJ, Cole DEC. Homocysteine. Crit Rev Clin Lab Sci 1999; 36:365-406
10. Rossi GP, Maiolino G, Seccia TM, et al. Hyperhomocysteine- mia predicts total and cardiovascular mortality in high-risk women. J Hypertens 2006; 24:851-9
11. Yagy K. Assay for serum lipid peroxide level and its chemical signifi cance. In: Yagy K. Ed: Lipid peroxides in biology and medicine. Academic Press NY 1982; 223-42
12. Esterbauer H, Cheeseman KH. Determination of aldehydic lipid peroxidation productis: malonaldehyde and 4-hydrox- ynonenal. Methods Enzymol 1990;18:407-21
13. Paglia DE, Valentine WN. Studies on the quantitative and
qualitative characterization on erythrocyte glutathione per- oxidase. J Lab Clin Med 1967; 70:158-69
14. Yi P, Melnyk S, Pogribna M, et al. Increase in plasma ho- mocysteine associated with parallel increases in plasma S- adenosylmethionine and lymphocyte DNA hypomethylation.
J Biol Chem 2000; 275:29318-23
15. Aguilar B, Rojas J, Collados MT. Metabolism of omocysteine and its relationship with cardiovascular disease. J Thromb Thrombolysis 2004; 18:75-87
16. Hogg N. The effect of gysteine on the auto-oxidation of homocysteine. Free Radic Biol Med 1997; 100:2153-7 17. Tyagy N, Sedoris KC, Steed M, et al. Mechanism of homo-
cysteine-induced oxidative stress. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2005; 289:2649-56
18. Neri S. Radicali liberi in medicina interna e medicina d’ur- genza.Verduci Ed., Roma, 1999
19. Weiss N. Mechanisms of increased vascular oxidant stress in hyperomocysteinemia and its impact on endothelial function.
Curr Drug Metab 2005; 6:27-36
20. Lentz SR. Mechanisms of homocysteine-induced athero- thrombosis. J Thromb Haemost 2005; 3:1646-54
21. Mackey RH, Kuller RH, Sutton-Tyrrell K, et al. Hormone therapy, lipoprotein subclasses, and coronary calcifi cation: the Healthy Women Study. Arch Intern Med 2005; 165:510-5 22. Lonn E, Yusuf S, Arnold MI, et al. Homocysteine lowering
with folic acid and B vitamins in vascular disease. N Engl J Med 2006; 354:1567-77
23. Dimitrova KR, DeGroot K, Meyers A, et al. Estrogen and Homocysteine. Cardiovasc Res 2002; 53:377-88
24. De Leo V, La Marca A, Morgante G, et al. Menopause, the cardiovascular risk factor homocysteine, and the effects of treatment. Treat Endocrinol 2004; 3:393-400
