Particolarmente interessante è lostudio dell'attività di queineuronichesparanoogniqualvoltalascimmiaeettuaconsuccessol'azione di"grasping",indipendentementedall'eettorechelascimmiausaperraggiun- gerel'oggetto

1 Introduzione

L'area F5 costituisceil settore rostrale dellacortecciapremotoria centrale del

macaco. LamaggiorpartedeineuronidiF5scaricaquandolamanoelabocca

eseguonodelle azioni. Particolarmente interessante è lostudio dell'attività di

queineuronichesparanoogniqualvoltalascimmiaeettuaconsuccessol'azione

di"grasping",indipendentementedall'eettorechelascimmiausaperraggiun-

gerel'oggetto. SullabasedellericerchesvoltedalgruppodelProf. Rizzolatti[1]

diParma,ilsistemamotoriononcodicasoltantoimovimentimaancheaspetti

piùcognitivi,comeadesempiounaazione. Inquestomodo,sein F5sonopre-

sentineuroniadibitialla codicadell'azione di"grasping"enonalmovimento

richiesto per ottenere il "grasping", questi neuroni dovrebbero sparare anche

quandoilgraspingvieneottenutousandounaltroeettore,nonbiologico[3].

1.1 Il paradigma sperimentale della pinza inversa

Alloscopodidimostrarel'altolivellodicontrollodelleazionidapartedeineuroni

"goal-related" di F5, è stato realizzato un paradigma che potesse prevenire

ogni tipo di obiezione legata alla pretesa di una codica di basso livello del

movimento, intesoad esempioin termini di controllomuscolare. Ilparadigma

in questione operainfatti una nettadissociazionetra ciò chepuò essereinteso

come"movimento"eloscoponaledell'azione,ovverolapresadelcibodaparte

dell'eettore.

L'animaleall'iniziodell'esperimento osservadelciboevienepoiaddestrato

allapresa delciboin tremodidierenti:

*presanaturaleeettuataconlamano

*presaeettuatapermezzodiunapinzanormale

*presaeettuatapermezzodiunapinzainversa,da"escargot"

Lapinzainversanecessitadiunaestensionedelleditadellamanoperchiud-

ere l'end-eector, alcontrario dellapinza normalee dellapresa naturale nelle

quali è necessaria invece una essione: in questo modo è possibile separareil

movimentochevieneeseguitodaimuscolidall'azionerichiesta.

Fig.2: I tre eettori del paradigma sperimentale ed i relativi movimenti

muscolari.

F1, per avere un confronto tra le attività dei mirror con la corteccia che ha

lo specico compito di comandare i motoneuroni di mano e bocca. Infatti la

convessitàdiF5nonpartecipaallaformazionedeltrattopiramidale,sebbeneil

contributoall'attivitàmotoriasiastatotradizionalmenteconsideratoindiretto,

dateleforticonnessioniconl'areamotriceprimariaF1.

Sesi ipotizza che leunità osservatein F5 si proiettino in F1 comunicando

un qualche controllo e che tale controllo si traduca poi in un movimento di

chiusura dell'eettore, sirendepoinecessarioconsiderareanchelatipologiadi

questotipodicontrolloneldettaglio:cisitrovaquindidifronteadunparadosso

in quanto si suppone che i mirror abbianouna componente di astrazione edi

indipendenzadalmovimento,maaltempostessosivuolecapirecomeineuroni

diF5comunichinoaquellidiF1cosafarein terminipuramentemotori,cosìda

renderepossibilel'esecuzionedeltask.

Questotipodiparadossoèineditoperleareepremotorieventrali,dato che

per tutte le popolazioni visuomotorie descritte in termini di controllo di alto

livello,pernondireaddiritturacognitive(comegli"actionlocation"di F4odi

canonici del bancodi F5) èpossibile sempretradurre il messaggioespressoda

un linguaggio cognitivo, di alto livello, ad uno di basso livello che si esprime

in termini di movimenti muscolari. Perquanto riguardainvecei neuronigoal-

related,l'ideacheinunprimomomentosembraesseresuggeritaècheaseconda

dellecontingenzeilneuroneinvii oallapopolazionedi F1addettaadaprirele

ditaoaquellaaddettaachiuderle,maquestononèunragionamentoplausibile.

Dalleconoscenzeattualisiescludecheunaunitàneuralepossadecidereaquali

unitàriceventiinviareilpropriosegnale;èpiùprobabileinvececheineuronidi

F5 osservatiinviinoadentrambi icanali illorosegnale,sebbenepoiF1nisca

per eseguire solamente uno dei due comandi. Secondo i lavori pubblicati del

gruppodelProf. Rizzolattisono due leipotesiplausibili, nonnecessariamente

incompatibili traloro.

SecondolaprimaipotesileterminazioniassonalideineuronidiF5attivano

sialapopolazioneneuraleche determinalaessione dellamanosiaquella che

ne determina l'estensione, ma mentre una popolazionesegue il comando l'al-

tradovrebbeveniredaunaltraproiezioneaerente. Lasecondaipotesiinvece

prevedeche quando alcuni neuroni di F5 inviano ad una popolazionedi F1 il

comando siapossibileche lasommazione dei potenziali di azioneche raggiun-

gonoF1nonarrivialivellisucientidaconsentire l'outputmotorio. E' infatti

possibilechequandoineuroni"goal-related"invianoadF1uncomandorelativo

aduna chiusura dell'eettoremediante laessione delledita, questinonsiano

gli uniciresponsabili dell'eettivomuoversidel braccio, maanzicheperchèla

si riferiscealla estensionedelledita conil coloreverdeed aaalessione

conilcolorerosso.

Fig.4: Laregistrazionediunsegnaleneurale.

perottenere l'output, altrineuroni, cherispondonoalla chiusura consoltanto

unadelleduepinzescarichino.

2 La registrazione dei dati

2.1 La misura dell'attività neurale

Ilprimocollegamentotralacomunicazioneneuraleedunsegnaleelettricosideve

a Galvani, che già nel 1791 ha mostrato conil suoesperimento con i muscoli

della ranacome sia possibile stimolaree registrarei segnali neuraliattraverso

l'usodi microelettrodi.

Il circuito, mostrato in gura 4, amplica il potenziale tra la terra a la

punta del microelettrodo. I cambiamenti di potenziale misurati sulla punta

d'azione, ma puòpresentareanchealtre componentiche "sporcano"il segnale

che si va acquisendo. I segnali che possono somigliare al potenziale d'azione

cellularepossonoessererilevati dallebreassonali, chevengonochiamate bre

di passaggio. Questi segnali sono tipicamente molto più localizzati e deboli

rispettoaipotenzialid'azione cellulari. Un altrapossibilefonte di rumoreèil

campo di potenziale,che si presenta tipicamente in strutture a strati. Questi

segnali viaggiano tuttavia ad una banda di frequenza sucientemente bassa,

rispettoalpotenzialed'azione,dapoteressereltratidalsegnalegrezzo.

La formadell'elettrodo inuenza il tipo di segnaleche viene misurato. E'

possibileasserirechepiùunapuntaèlargaemaggioresaràilnumerodicompo-

nentidel segnalechevengonoregistrate. Tuttaviaselapunta ètroppostretta

potrebbeesseredicilela rivelazionedi qualsiasisegnale,compreso quelloche

si è interessati a registrare. Inoltre, anche la congurazione della punta può

esseredeterminanteperlaselezionedei segnaliche devonoesseremisurati. La

corrente nellospazio extracellularetendeauire negli spaziinterstizialitra le

celluleenonnecessariamentequestoussoèregolare: unelettrododi vetrocon

una punta dalla forma ad "O", infatti, potrebberegistrare segnali diversi da

unelettrodoalplatinorivestitosoltantoesternamentedivetroeconunapunta

dallaformasmussata,"apallottola".

L'ultimopassaggionellamisura èl'amplicazionedel segnaleelettrico. Un

metodosemplicepermisuarel'attivitàneurale,comeèstatodettoprecedente-

mente,puòessereeettuatoattraversounriconoscitoredi sogliahardware,ma

i modernicomputerconsentonoanchedianalizzarelaformad'ondain digitale

edusare approccialgoritmiciperlospikesorting. Esistono numerosipacchetti

software,disponibilianchegratuitamente,in gradodifareanalisimoltososti-

cate. Inoltrelasemprecrescente capacitàdi calcolodei computerrendepossi-

bileusaremetodigiànotiinpassato,maconsideratiproibitiviacausadelcosto

computazionale.

2.2 Interfacce corticali invasive

Lapossibilitàdiregistrarel'attivitàdelsistemanervosocentrale(SNC)diretta-

mentedallacortecciainmanierainvasivaèparticolarmenteinteressante. Queste

registrazionihannoloscopodimisurarei"localeldpotential",ovverol'attività

coerentedi piccoligruppidi cellule,ol'attività disingolecelluleusandodier-

entitipologiedimicroelettrodi. Negliultimianniinoltreèemersalapossibilità

di utilizzarequesteinformazioni percontrollaredispositivirobotici,quindi nu-

merosi centri di ricerca hanno cominciato ad arontare due aspetti necessari

Fig.6: Un singoloelettrododi silicio

ralidainserirealivellocorticaleelosviluppodialgoritmiperl'estrazionedelle

informazioni.

Purtroppoleinterfaccecorticalinonsono ingradodi fornireinformazionia

lungoterminedall'impianto,acausadeldanneggiamentodellazonaregistratao

deldeterioramentodell'elettrodo. Perquestomotivoèimportantelaricercavol-

taallaprogettazionedielettrodiinnovativi,voltiadunmiglioreinterfacciamento

coniltessutoneurale.

Tra le varie tecnologie di interfaccia invasiva per il SNC bisogna citare le

seguenti:

Microli - Risalgono agli anni '50 e si possono considerare i primi tenta-

tivi di studiareil SNC a livello cellulare. Assumonouna forma di unagocon

diametro variabile tra i 25 ed i 50 µm^{. Oggi questi elettrodi possono essere}

delMichigan

Fig.8: Unainterfaccianeuralecronicaaesagonalecon1141aghiinlegadititanio

realizzatacon ElectricalDischargeMachining

Fig.10: Elettrodi dinuovagenerazione: (a) singoloshaft concanali multipli;

(b)elettrodoibridocon lapresenzadi sistemimicrouidiciperl'inseri-

mentodifattorinutritivi perilsistemanervoso;(c)arraydielettrodi

con l'integrazione della parte per l'elaborazione del segnale e per la

trasmissione wireless; (d) possibile schemadi una interfaccia invasiva

corticaleconattuatoriMEMS.

(a) (b)

(c) (d)

duranteesperimentiacuti ecronici.

Arrayinsilicio-Realizzatiutilizzandotecnicheperlalavorazionedelsilicio

(es.,"etching"anisotropo,"diusedetchstops" e"deepreactiveion etching")

edialtrimateriali(polimerifotodenibilie"dryetching").

Elettrodi dinuovagenerazione - Sitratta dielettrodi non-standard,in gra-

do di adempiere anche ad altre funzioni di elaborazione, trasmissione o che

migliorano le loro caratteristiche di biocompatibilità sia attraverso il rilascio

di farmaci/nutrienti/anti-inammatori o attraverso la possibilità di muoversi

all'internodellacorteccia,evitandodi danneggiaresemprelamedesimazona.

3 Il protocollo sperimentale

3.1 Le procedure di base

Per svolgere l'esperimento della pinza inversa sono stati usati due macachi,

Macaca nemestrina: unmaschio eduna femminadi otto ecinquechilirispet-

tivamente. Tutte le metodologie usate sono state approvate dalla Comitato

Veterinario dell'uso e della cura degli animali presso l'Università di Parma e

confermateconlaleggeeuropeasull'uso dianimaliin laboratorio.

L'attivitàdisingoleunitàèstataregistratadalleareeF5edF1\M1inquat-

trodiversiemisferidelleduescimmiesveglie. Lescimmiesonostatefattesedere

suunasediaconlatestassataedabituatealsetupsperimentale. Ilprotocollo

prevedeval'usodi diversieettori, qualilapinzadirettaelapinzainversa,per

il"grasping"conilcibodapartedellescimmie,chesonoquindistateaddestrate

all'usodi questieettori perunperiododi tempodi circadiecimesi. Alcom-

pletamento dell'addestramento di entrambele scimmie sono stati impiantati i

canalidi registrazione.

3.2 Le procedure siologiche

Sonostatiregistrati singolineuroniusandomicroelettrodi in tungsteno(impe-

denza0.5-1.5MΩ^{,misurataallafrequenzadi1kHz)inseritiattraversoladura.}

Isingolipotenzialid'azionesonostatiisolaticonundiscriminatoredivoltaggio,

regolatoin ampiezzaedurata(BAK Electronics,Germantown,MD,USA).

Ilsegnalediuscitadaldiscriminatoreèstatopoimonitoratoeregistratoper

analisisuccessive. Glistessimicroelettrodisonostatiusatiinalcunistudianche

per microstimolazione intracorticale (ICMS), che consiste in treni di impulsi

(durata dei treni di circa 50ms, larghezza del singolo impulso di circa 0.2ms

efrequenza degli impulsi di circa330Hz) generatida una corrente costante di

stimolazione di intensità dai 3µ^{A ai 40}µ^A. L'intensità della corrente è stata

resistenzain serie all'elettrodo di stimolazionedi 10kΩ^{. La sogliaperciascun}

movimentoevocatodallamicrostimolazioneèstatadenitacome l'intensitàdi

correnteallaqualeimovimentivengonoevocatialmenonel50%delleprove. Le

provedi microstimolazionesono stateeettuatesistematicamente in entrambe

lescimmie.

3.3 I siti di registrazione

La dimensionedel canaledi registrazioneimpiantatoha permesso l'accessoad

un'ampiaareacorticalecomprendentetuttalacortecciapremotoriaventrale,le

areeF1\M1elazonacaudaledeicampiocularifrontali. Tuttequesteareesono

statecaratterizzatealivellofunzionaleutilizzandodiversicriteriusati: l'areaF1

èrislutataeccitabileconunacorrenteanchedibassissimaintensità(pochiµ^A),

l'attività è stata intensa durante movimenti attivi ed si hanno avutorisposte

durantelastimolazionesomatosensoriale;l'areaF5sestimolataèstataingrado

dievocaremovimentidistali,maconunasogliamaggiorediquellariscontratain

F1,ineuronihannoscaricatoinassociazioneamovimentiattividimanoebocca

ma anche quando le azioni sono state eettuate da terzi ed osservate, inoltre

quest'areasièattivaanchequandosonostatipresentatioggettitridimensionali.

3.4 L'acquisizione dei dati

Una volta classicatoil neurone, vengonostudiate sei condizionisperimentali:

"grasping" con la mano, con la pinza diretta ed inversa ed osservazione del-

la scimmia delle tre azioni precedenti quando svolte da una persona. Sono

stateeettuatediecidiverseregistrazioniperciascunacondizionesperimentale.

Attraversounsistemahardwareasogliaèstatofattounprimorilevamentodel-

l'eventospike. Ognitrialèduratoquattrosecondiedèstatocentratosulgoal,

ovverosonostatiregistratiduesecondiprimaeduesecondidopoil"grasping",

realeoosservato.

Traleestremitàdellepinzeèstatoinseritounpotenziometro(ALPS16mm-

50mW), permisurareistante dopoistante laprecisaposizioneduranteleoper-

azionidi aperturaechiusuradell'eettore.

3.5 La selezione dei neuroni

L'attività di ciascun neurone è stata correlata con l'esecuzione di movimenti

attivieconlestimolazionivisiveesomatosensoriali. Conil terminemovimenti

attivisiintendonoimovimentidell'avambraccio,comeilreachingedilgrasping

spaziodilavorodellascimmia.

Ineuroniinteressantiallalucedelprotocollodellapinzainversasono,teori-

camente,quelli"grasp-related".Sonostatipoiclassicaticomeneuroni"grasp-

related" solo quei neuroni la cui attività era consistente soltanto durante il

"grasping",senzaunaparticolareattenzioneperiltipodimovimentocheilbrac-

cio andavaa fare, che potevaquindi essere di essione, estensione, adduzione

od abduzione. Di questosetdi neuronièstatafattaunaulterioreselezione,in

base all'attivitàcheineuronimostravanoin relazioneall'usodeidiversitipidi

eettori: sololeattivitàdeineuronichepresentavanoproprietàmotorie legate

all'usodituttiglieettorisonostatesalvateperelaborazionisuccessive.

Nelle prove di grasping dove l'eettore usato dalla scimmia è la mano si

possonodistinguerequattrodiversefasidiattività: background,aperturadella

mano,chiusuradellamano,presadell'oggetto. Questeconsiderazionisonostate

possibiliattraversol'usodiunavideocameradigitale,attraversoquindiunacon-

seguente analisidelle immaginieettuataframedopoframe. Percompararele

risposte del neurone alle diverse fasi e condizioni di scarica tutti i dati regis-

trati sono stati analizzati unavolta "puliti"dal background,ovveroil segnale

registratonellaprima fase,enormalizzati.

Lamedianormalizzatadellafrequenza discaricadiciascunneuroneèstata

quindiusataperanalisistatistichealloscopodifareunasuccessivaselezionedei

neuronidainserirenellostudio.

Intotale sono stati registrati in F5 duecentottantadue neuroni, deiquali è

statoclinicamentetestatochesoloil50%siattivavanodurantelafasedigrasping

conlamano econlepinze. Di questicentoquarantadue,solo settantasei sono

stati registratiperuntemposucientementelungoperconsentirel'esecuzione

di almenodieci trialperciascuna modalità dell'esperimento. Ventuno neuroni

nonmostravanodierenzesignicativetral'attivitàdellaprimafase,cheèstata

sceltacomebackground,eleattività"task-related"esonoquindistatiscartati

daiprecedentisettantasei.

Per quanto riguarda le registrazioni dell'area F1\M1, è stato clinicamente

dimostratochesoloil42%deiduecentotrentacinqueneuroniregistratiharispos-

to alleattivitàdi graspingsvoltaconciascuneettore. Diquestinovantanove,

solosettantaseisonostatiregistratiperuntemposucientementelungodacon-

sentireall'operatoredi terminare ciascunamodalità dell'esperimento per dieci

volte. Diciottosonostatipoiineuroniscartatidalleanalisistatistichesuccessive,

svoltesullafrequenzadiscaricadelgruppo.

[1] M.A. Umiltà, E. Kohler,V. Gallese,L.Fogassie L.Fadiga, 2001."I know

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