4) R
ISULTATI
4.1)LE CARATTERISTICHE DEL CAMPIONE
Il campione analizzato è composto da 110 pazienti affetti da Mieloma Multiplo, di cui 61 maschi e 49 femmine, con un’età media alla diagnosi di 59.5 (±9,2) anni (range 38-83) anni (Fig. 4.1).
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 Sesso Maschi Femmine
Figura 4.1: distribuzione in classi dell’età alla diagnosi e tra i sessi del campione
4.2)VALUTAZIONE DELLA RISPOSTA
I pazienti vengono suddivisi in quattro classi di risposta alla chemioterapia, valutando, circa un mese dopo il trattamento, l’evoluzione di parametri accertati alla diagnosi. Le classi di risposta, definite in accordo ai parametri dell’European Group for Blood and Marrow Transplantation (EBMT) [80], sono:
- CR (Complete Remission) = Scomparsa di qualsiasi evidenza della malattia;
- PR (Partial Remission) = Remissione soltanto parziale della malattia; - SD (Stable Disease) = Assenza di remissione e di progressione della
malattia;
- PD (Progressive Disease) = Progressione della malattia.
In base a questa classificazione, i pazienti risultano suddivisi come mostrato dal grafico in figura 4.2. La percentuale di pazienti più alta è nella classe PR, ed è pari al 61,74%. 0 20 40 60 80 F re q u e n z a ( % )
Risposta alla chemioterapia
PD SD PR CR
Figura 4.2: distribuzione dei pazienti in classi di risposta alla chemioterapia
Ai fini della valutazione della risposta alla chemioterapia, sono stati raggruppati nei due macrogruppi dei RISPONDENTI (R) quei pazienti in cui si è avuta remissione, anche parziale, della malattia, e dei NON RISPONDENTI (NR) quelli che non hanno manifestato alcuna remissione della malattia. Alla luce della nuova classificazione, il campione risulta ridistribuito secondo il grafico in figura 4.3, con una percentuale di rispondenti del 72.2% (80 pazienti).
0 20 40 60 80 F re q u e n z a ( % ) 1
Risposta alla chem ioterapia
R NR
La distribuzione dei pazienti in classi di risposta alla chemioterapia, non presenta differenze significative tra maschi e femmine.
Analogamente è stata valutata la risposta al trapianto dei 94 pazienti che vi sono stati sottoposti, circa un mese dopo il trattamento. In particolare, i pazienti sono stati classificati in due gruppi in base ai parametri definiti dall’EBMT[80]:
- RISPONDENTI (= Migliorati);
- NON RISPONDENTI (= Stabili + Peggiorati);
La distribuzione dei genotipi nelle due classi di risposta è mostrata nella figura 4.4. 0 10 20 30 40 50 60 70 F re q e u n z a % 1 R NR
Figura 4.4: distribuzione dei pazienti nelle classi di risposta al trapianto
4.3)FREQUENZE ALLELICHE E GENOTIPICHE
Il campione di 110 pazienti affetti da mieloma multiplo è stato genotipizzato per i polimorfismi C3435T e G2677T/A al locus MDR1 (Tab 4.1).
GENE
RS
SNP
AA
MDR1 1045642 C3435T Ile1142Ile MDR1 2032582 G2677T/A Ala893Ser/Thr
Dai dati che si ritrovano in letteratura [43,56,57,58,60], l’allele più frequente per il polimorfismo C3435T, considerato pertanto wild-type, è l’allele 3435C, mentre si considera allele variante il 3435T. Le frequenze genotipiche ottenute, riportate nel grafico in figura 4.5, sono in accordo con quanto atteso dall’equilibrio di Hardy-Weinberg, con un p=0,46.
29,09 46,36 24,55 0 10 20 30 40 50 F re q u e n z a % CC CT TT
Figura 4.5: frequenze dei genotipi per lo SNP C3435T al locus MDR1 nel
campione studiato
Le frequenze genotipiche per il polimorfismo G2677T/A sono riportate nel grafico in figura 4.6. L’allele più frequente è l’allele 2677G, mentre gli alleli 2677T e 2677A si considerano entrambi alleli varianti anche se il primo ha una frequenza molto maggiore rispetto al secondo, come riportato in letteratura [43,53,67,68]. 32,73 45,45 15,45 4,55 1,82 0 10 20 30 40 50 F re q u e n z a % GG GT TT GA TA
Figura 4.6: frequenze dei genotipi per lo SNP G2677TA al locus MDR1 nel
4.4) CORRELAZIONE TRA GENOTIPO E RISPOSTA ALLA CHEMIOTERAPIA DAV
Per poter valutare la relazione tra il genotipo dei pazienti e la risposta alla chemioterapia DAV, abbiamo analizzato la distribuzione dei genotipi all’interno delle classi dei rispondenti e dei non rispondenti.
Per il polimorfismo C3435T, i dati riportati nel grafico in figura 4.7, mostrano che non ci sono differenze statisticamente significative nella distribuzione dei genotipi tra le due classi di risposta (p(χ2)=0,97).
0 10 20 30 40 50 CC CT TT
RISP NON RISP
Figura 4.7: distribuzione dei genotipi per lo SNP C3435T al locus MDR1 tra
RISPONDENTI e NON RISPONDENTI
L’associazione tra risposta alla chemioterapia e genotipo MDR1 è stata valutata anche con una regressione logistica multivariata, tenendo conto dell’effetto dell’età e del sesso (Tab. 4.2), che conferma l’assenza di differenze significative.
CHEMIOTERAPIA RISP/NON RISP OR I.C. p (value)
Età alla diagnosi 0,99 (0,94–1,04) 0,79
Sesso (M) F (45/16)35/14 1,14 (0,49–2,68) 0,75
MDR1 (C/C)C/T 38/13 0,87 (0,31–2,97) 0,78
MDR1 (C/C)T/T 19/8 1,06 (0,34–3,30) 0,91
Tabella 4.2: Risultati dell’analisi logistica multivariata per lo SNP C3435T
relativi al polimorfismo G2677T/A: i dati riportati nel grafico in figura 4.8 mostrano che non ci sono differenze statisticamente significative nella distribuzione dei genotipi tra le due classi di risposta(p(χ2)=0,84).
0 10 20 30 40 50 GG GT TT GA TA
RISP NON RISP
Figura 4.8: distribuzione dei genotipi per lo SNP G2677T/A al locus MDR1 tra
RISPONDENTI e NON RISPONDENTI alla terapia
Anche in questo caso è stata effettuata un’analisi mediante regressione logistica multivariata, tenendo conto dell’effetto dell’età e del sesso (Tab 4.3), che ha confermato l’assenza di differenze significative.
CHEMIOTERAPIA RISP/NON RISP OR I.C. p (value)
Età alla diagnosi 0,99 (0,91–1,04) 0,81
Sesso (M) F (45/16)35/14 1,24 (0,51–3,00) 0,62
MDR1 (G/G)G/T 36/14 1,33 (0,48–3,64) 0,78
MDR1 (G/G)T/T 12/5 1,42 (0,38–5,31) 0,59
MDR1 (G/G)G/A 3/2 2,44 (0,31–19,04) 0,39
MDR1 (G/G)T/A 1/1 4,09 (0,21–78,17) 0,34
Tabella 4.3: Risultati dell’analisi logistica multivariata per lo SNP G2677T/A
4.5)CORRELAZIONE TRA GENOTIPO E RISPOSTA AL TRAPIANTO (ASCT)
Come per la risposta alla terapia DAV, è stata valutata la relazione tra il genotipo dei pazienti e la risposta al trapianto autologo di cellule staminali, esaminando la distribuzione dei genotipi all’interno delle classi dei rispondenti e dei non rispondenti.
differenze statisticamente significative nella distribuzione dei genotipi tra le due classi di risposta al trapianto ne per il polimorfismo C3435T (p(χ2)=0,71), ne per il polimorfismo G2677T/A (p(χ2)=0,58).
0 10 20 30 40 50 CC CT TT
RISP NON RISP
Figura 4.9: distribuzione dei genotipi per lo SNP C3435T al locus MDR1 tra
RISPONDENTI e NON RISPONDENTI al trapianto.
0 10 20 30 40 50 GG GT TT GA TA
RISP NON RISP
Figura 4.10: distribuzione dei genotipi per lo SNP G2677T/A al locus MDR1 tra
RISPONDENTI e NON RISPONDENTI al trapianto.
La regressione logistica multivariata, che tiene conto dell’effetto dell’età, del sesso e della risposta alla terapia (Tab. 4.4 e 4.5), ha confermato che non c’è alcuna associazione statisticamente significativa tra i due SNPs e la risposta al trapianto.
TRAPIANTO RISP/NON RISP OR I.C. p (value) Risposta alla terapia 64/30 2,30 (0,82-6,41) 0,11
Età alla diagnosi 0,94 (0,89–0,99) 0,044
Sesso (M) F (33/18)31/12 0,68 (0,26–1,73) 0,42
MDR1 (C/C)C/T 24/14 1,65 (0,55–4,93) 0,37
MDR1 (C/C)T/T 19/7 0,82 (0,24–2,78) 0,75
Tabella 4.4: Risultati dell’analisi logistica multivariata per lo SNP C3435T
TRAPIANTO RISP/NON RISP OR I.C. p (value)
Risposta alla Terapia 64/30 2,22 (0,81-6,11) 0,12
Età alla diagnosi 0,94 (0,88–0,99) 0,035
Sesso (M) F (33/18)31/12 0,78 (0,30–2,03) 0,62
MDR1 (G/G)G/T 29/11 0,68 (0,23–2,01) 0,49
MDR1 (G/G)T/T 10/6 1,03 (0,27–3,88) 0,92
MDR1 (G/G)G/A 3/2 0,61 (0,06–6,22) 0,67
Tabella 4.5: Risultati dell’analisi logistica multivariata per lo SNP G2677T/A
4.6)ANALISI DELLA SOPRAVVIVENZA A LUNGO TERMINE (OS)
Il successo del trattamento terapeutico cui sono stati sottoposti i soggetti del campione in studio può anche essere valutato in termini di sopravvivenza a lungo termine, o overall survival (OS), e pertanto è stata
analizzata l’eventuale associazione tra i genotipi per i due polimorfismi di
MDR1 studiati e la probabilità di sopravvivenza.
La sopravvivenza è stata valutata a 60 mesi dalla data di diagnosi su un campione ridotto a 68 individui, i quali mostrano una sopravvivenza media di 44 mesi (range 6-60).
La relazione tra il genotipo e la probabilità di sopravvivenza è stata valutata con il metodo di Kaplan-Meier. Per il polimorfismo C3435T l’analisi l’analisi di Kaplan-Meier mostra una sopravvivenza a lungo termine maggiore per gli individui portatori di almeno un allele variante (C/T o T/T) rispetto agli omozigoti wild type (C/C) (Fig. 4.11). Tale differenza risulta statisticamente significativa (log-rank test, p=0,02). Inoltre, gli individui con genotipo T/T e
C/T si registra anche il maggior numero di pazienti viventi (80,4% vs 54,5%,
p=0,03). Le differenze evidenziate mediante l’analisi di Kaplan-Meier sono
state valutate quantitativamente mediante regressione di Cox aggiustata per età, sesso, chemioterapia e risposta al trapianto (ASCT), presenza/assenza del secondo trapianto e fattori prognostici tradizionali. L’hazard ratio (HR) che
ne risulta è di 0,12 (95%CI: 0,02-0,59), che indica che i pazienti di genotipo C/C hanno una probabilità di sopravvivenza molto inferiore rispetto ai portatori di almeno un allele mutato T.
Figura 4.11: probabilità si sopravvivenza e genotipo al locus C3435T di MDR1
Analogamente, è stata valutata la relazione tra genotipo e sopravvivenza per lo SNP G2677T/A. L’analisi di Kaplan-Meier mostra anche in questo caso evidenti differenze per probabilità di sopravvivenza di individui con genotipo diverso (Fig. 4.12).
Nell’analisi non compare il genotipo T/A, escluso in quanto rappresentato da un unico individuo, e anche per il genotipo G/A il campione è costituito unicamente da 4 individui. Se si considerano gli individui di genotipo variante (T/T e T/A), questi mostrano una sopravvivenza migliore rispetto agli individui omozigoti wild type (G/G) ed eterozigoti (G/T). L’analisi statistica evidenzia un risultato poco sopra i limiti della significatività (log-rank test, p=0,09). Anche la valutazione quantitativa mediante regressione di Cox,
aggiustata come precedentemente descritto, conduce alle stesse conclusioni. L’hazard ratio per gli individui di genotipo eterozigote (G/T) non è significativo (HR=0,37 (95%CI: 0,13-1,11)), mentre per gli individui di genotipo mutato (T/T) è pari 0,09 (95%CI: 0,01-0,77). In particolare, si può affermare che gli individui di genotipo mutato T/T hanno una probabilità di sopravvivenza assai migliore del rispetto agli omozigoti wild type.
