- Chimica Combinatoria;

(1)

- Sintesi Parallele;

- Chimica Combinatoria;

- Ottimizzazione di Processo.

Prof. Attilio Citterio

Dipartimento CMIC “Giulio Natta”

https://iscamapweb.chem.polimi.it/citterio/it/education/course-topics/

School of Industrial and Information Engineering Course 096125 (095857)

Introduction to Green and Sustainable Chemistry

(2)

Chimica Combinatoria e Controlli ad Alta Produttività.

1. Tecniche in Fase Solida 1.1. Vantaggi

1.2. Requisiti

1.3. Esempi di Supporti Solidi 1.4. Spaziatori e leganti

1.4.1. Resine Merrifield per la sintesi peptidica (gruppo clorometile) 1.4.2. Resine Wang e Rink

1.4.3. Resine diiidropiraniche 2. Sintesi Parallele

2.1. Procedure di Houghton delle Bustine di te 2.2. Sintesi parallela automatizzata

2.3. Tecnica "split and pool"

3. Sintesi Combinatoria Mista 4. Sintesi in fase soluzione

(3)

Fasi Chiave nella Sperimentazione.

• Preparazione robotica del campione

• Miniaturizzazione dei reattori

• Alto livello di automatizzazione dei sensori

• Industria farmaceutica:

• creazione e analisi di routine da 1000 a 1000000 composti distinti (librerie)

• Queste tecniche sono ora anche applicate nello sviluppo di materiali

• Nuove aziende:

• Symyx (www.symyx.com )

• Avantium (www.avantium.com )

(4)

Analisi ad Alta Produttività.

• Ciclo tipico di sperimentazione:

– Migliaia di reazioni in poche ore – Poche ore di analisi statistica – Migliaia di reazioni in poche ore – Poche ore di analisi statistica – ---

• Si possono sviluppare nuovi composti chimici in 3 settimane anziché in 3 anni

• Quali tecniche statistiche sono importanti?

• Come si confrontano con le tecniche classiche?

• Quali nuove tecniche sono necessarie?

(5)

Chimica Combinatoria - Una Rassegna Storica.

1. Sintesi in fase Solida di peptidi

2. Sintesi in fase Solida di oligodeossiribonucleotidi 3. Intesi tradizionale vs. combinatoria :

Mario Geysen: tecnica Multipin

Richard Houghton: tecnica "Tea bag"

Ronald Frank: tecnica SPOT

John Ellman: Prima sintesi combinatoria di piccoli composti eterociclici

4. Concetti base della chimica combinatoria

5. Chimica combinatoria nello sviluppo di farmaci

(6)

1. Sintesi in Fase Solida di Peptidi (SPPS) col Metodo Boc.

SPPS: sviluppata da Merrifield, un vincitore di premio Nobel.

Sintesi in Fase Solida vs.

sintesi tradizionale in soluzione : 1. Facile purificazione del prodotto,

specialmente adatta alle sintesi a più stadi

2. Reazione eterogenea: le reazioni sono più lente e meno efficienti delle reazioni in soluzione.

Amminoacido₁protetto Resina reattiva Ancoraggio

Deprotezione con

Accoppiamento Amminoacido₂protetto

+ DCC

Deprotezioni sequenziali e stadi di accoppiamento

Rilascio con HF

(7)

Sintesi in Fase Solida di Peptidi (SPPS) col Metodo Fmoc.

Metodo Fmoc

Deprotezione Fmoc

(8)

Sintesi Chimica di Oligos del DNA.

Stadio 1: Deprotezione terminale : pochi min.

CCl₃COOH(TCA) o CHCl₂COOH(DCA)

Stadio 2: Accoppiamento: 2-3 min.

Stadio 3: Ossidazione: I², pochi min.

Stadio 4: Protezione: per bloccare il 5’-OH Ac²O, lutidina, N-metilimidazolo, THF

Deprotezione: 30% NH₄OH, 5h a 50°C Purificazione: HPLC, elettroforesi,

DMTr

R₁= b-cianoetil B = gruppo base S = fase solida

(9)

Ciclo Sintetico

Accoppiare



 Detritilare

+ +

Partenza Accoppiare



 

Ciclo di Reazione ecc.

Supporto deratizzato P

B₁, B₂, B₃: A^ba, C^Bg, G^Bwo T

Detritilare

 

Ossidare e Accop.

(10)

Tecnica Multipin per la Sintesi Parallela di Peptidi.

Geysen, HM; Rodda, HM; Mason, TJ. The delineation of peptides able to mimick

assembled epitopes. In Synthetic Peptides as Antigens. Ciba Foundation Symposium 119;

Porter, R., Wheelan, J., Eds.; Wiley: New York, 1986; pp131-149.

Lavaggio e deprotezione in un grande pentola.

Accoppiamento: uso di un Dispositivo a 96 pozzetti.

Il reagente AA protetto in

ciascun pozzetto dipende dalla sequenza del peptide di

interesse sulla punta a cui corrisponde.

10-50 nmoli di peptide legato covalentemente Punte di polipropilene

derivatizzato con acido acrilico Spaziatore Fmoc-b-alanina-esametilendiammina

(11)

Sintesi Classica vs.

Approccio a Sintesi Combinatoria.

Sintesi "Classica"

+ +

" Approccio a Chimica Combinatoria"

+ +

(12)

Esempio di Diversità Molecolare e Sintesi.

Tetra-peptide: H₂N-A-B-C-D-CO₂H

 si consideri solo i 20 amino acidi naturali (serie L) 20⁴ = 160,000 differenti tetra-peptidi !

 ora si includa i 19 amino acidi D (20 L + 19 D = 39)

39⁴ = 2.3 milioni di tetra-peptidi differenti!!

 ora si includa 20 amino acidi non naturali

59⁴ = 12 milioni di tetra-peptidi differenti !!!!

Chimica Combinatoria: metodologia con cui si può preparare e valutare una famiglia (libreria) di composti correlati (per struttura e sintesi).

Per le sintesi multi-stadio, si deve usare l’approccio sintetico in esperimenti in parallelo oppure utilizzando una fase solida per velocizzare la purificazione degli intermedi.

(13)

Chimica Combinatoriale nella Progettazione di Farmaci.

Scoperta Capostipite

Ottimizzazione Struttura

Sviluppo Candidato

Farmaco Target Terapeutico

La Chimica

Combinatoriale opera qui

(14)

Industria Farmaceutica – Scoperta di Farmaci.

Identificazione prodotto guida : letteratura (aperta e brevettuale) natura (prodotti naturali).

Attenta ottimizzazione di una struttura guida tramite sintesi chimica

“tipico: metile-etile-butile-futile”.

N° farmaci commercializzabili per composti sottoposti a test biologico preliminare.

1 10,000

Progettazione razionale Chimica combinatoria Composto

Guida (lead)

ottimizzazione

(sintesi) Farmaco ^{10 anni}

400 – 800 milioni di $

$ $ $

(15)

Sintesi Organica in Fase Solida - Catalisi su Supporti Polimerici.

http://iscamap.chem.polimi.it/citterio/education/course-topics

(16)

Sintesi Organica in Fase Solida (SPOS).

La sintesi in fase solida è una metodologia che consente di realizzare trasformazioni chimiche con l'ausilio di un polimero insolubile. Perciò, è anche nota come sintesi assistita da polimeri e, quando si applica alla chimica organica, essa assume l'acronimo di “SPOS” = Solid-Phase Organic Synthesis.

L'approccio fu introdotto da R. B. Merrifield, Premio Nobel per la Chimica nel 1984..

(17)

Tecniche in Fase Solida.

I reagenti sono legati a una superficie polimerica e modificati mentre sono ancora legati. Si rilascia il prodotto finale alla fine della sintesi.

Vantaggi

• Si possono legare reagenti specifici a specifici supporti a palline

• I supporti si possono mescolare e far reagire nello stesso contenitore

• I prodotti formati sono specifici per ogni pallina e fisicamente distinti

• Si possono usare reagenti in eccesso per spingere le reazioni a completezza e questi possono essere facilmente rimossi

• Gli intermedi di reazione stanno sulle palline e non si devono isolare/purificare

• Si possono separare le singole palline per isolare singoli prodotti

• Il supporto polimerico si può rigenerare e ri-usare dopo distacco del prodotto.

Requisiti

• Una pallina di resina o una superfice funzionalizzata agisce da supporto solido

• Uno spaziatore e un legante (gruppi protettivi per i gruppi funz. Non implicati)

• Un legame che lega il substrato al legante. Il legame deve essere stabile.

• Un mezzo per staccare il prodotto dal legante alla fine.

• E' possibile automatizzare il tutto.

(18)

Tecniche in Fase Solida.

Esempi di Supporti Solidi:

• Palline di polistirene parzialmente reticolato di natura idrofobica causano problemi nella sintesi peptidica per il "folding" dei peptidi

• La resina poliammidica di Sheppard è più polare

• La resina Tentagel ha un intorno simile all'etere o al THF

• Palline, punte e superfici di vetro funzionalizzate

Le palline devono essere in grado di rigonfiarsi nel solvente usato, e

rimanere stabili.

La maggior parte delle reazioni avvengono all'interno delle resine.

(19)

Struttura di un Polimero per SPOS.

Supporto Solido (nocciolo)

Spaziatore Scaffold

Il materiale si può distinguere in quattro componenti differenziate:

Il nocciolo è normalmente un polimero reticolato all'1% insolubile. Tipici sono i copolimeri del polistirene e divinilbenzene eventualmente con polietielenglicol.

Lo Spaziatore: se presente, è comunemente un frammento molecolare (tipico il polietilenglicol) che connette il supporto solido al legante attraverso un

legame covalente. Da più reattività tipo soluzione con minor carico di resina Il Legante, se presente, fornisce un metodo ortogonale al rilascio dello scaffold

Lo Scaffold è la parte che si è interessati a far intervenire nella chimica e che rilascia il prodotto alla fine della sintesi.

Legante

(20)

Scaffolds e Gruppi Terminali Funzionali Reattivi.

Polimeri Reattivi per la Sintesi Organica in Fase Solida:

+ A + B + C

+ A + B A + B

A, B e D

C

A) Catalizzatore B) Ossidante C) “Bloccante” D) Ausiliario Chirale

(21)

Vantaggi della SPOS.

C'è una serie di ragioni di base che rendono la SPOS una metodologia vantaggiosa in confronto alla classica sintesi in fase liquida:

1. Procedure di reazioni semplificate: la purificazione dei prodotti di reazione si può fare per semplice filtrazione e lavaggio della resina.

2. Influenza termodinamica e cinetica sul corso della reazione: consente di usare un largo eccesso di reattivo in soluzione (gruppi protettivi

polimerici) o su resina (polimerico reattivo), con alta resa di reazione.

3. Rigenerazione della resina: La resina o il reattivo polimerico si possono rigenerare per essere usati in una nuova reazione.

4. Principio dell'alta diluizione: Controllando la capacità equivalente della resina (< 0.8 mmol/g), si possono eliminare reazioni indesiderate di accoppiamento e favorire le reazioni di ciclizzazione intramolecolare.

5. E' possibile automatizzare le procedure: l'automazione si usa tipicamente nelle tecniche di Chimica Combinatoria e nella tecnica di Array in Fase Soluzione.

(22)

Svantaggi della SPOS.

I principali svantaggi della chimica assistita da polimeri sono:

1. Sviluppo di un metodo sintetico: Essendo una reazione solido-liquido

(controllata cineticamente dalla diffusione reattiva nei poro del polimero) e avvenendo su un supporto solido (che deve essere stabile), le condizioni di reazione in soluzione non possono essere direttamente applicate,

perciò si devono ottimizzare (scegliendo dei gruppi protettivi polimerici).

2. Limiti dei supporti solidi e dei “linkers”: I “linkers” e i supporti solidi, benché sviluppati commercialmente, sono in numero limitato.

3. Monitoraggio delle reazioni: Usando gruppi protettivi polimerici, i tempi reali di monitoraggio delle reazioni sono limitati in quanto il prodotto che si

forma rimane legato al polimero.

4. Stadi sintetici aggiuntivi: Lavorando con reazioni di addizione-eliminazione, si devono aggiungere più stadi alla sintesi tradizionale in soluzione. Il processo ha bassa EA e numerosi scarti.

5. Scala: Generalmente il metodo si applica alla sintesi di campioni di prodotto inferiore a 1 g, ma in alcuni casi lo si è applicato in fase di produzione.

(23)

Tipi di Supporto Solido.

Si usano supporti polimerici per immobilizzare i

substrati, reagenti e catalizzatori.

Il supporto polimerico nella maggior parte dei casi è

insolubile, ma talvolta si usano polimeri solubili. I polimeri usati nelle sintesi di molecole

organiche appartengono a quattro classi:

1) Polimeri organici reticolati: sono insolubili in solventi organici e possono essere micro-porosi o macro-porosi (per es. Polistirene).

2) Polimeri organici lineari: solubili in solventi organici e insolubili in altri da cui si possono precipitare (per es. Polietilenglicol).

3) Dendrimeri: la cui solubilità dipende dalla polarità e forma

4) Supporti inorganici : vetro poroso, silice, allumina, argille, grafite.

(24)

Tipi di Supporto.

I supporti costituiti da polimeri organici reticolati sono i più comuni.

 I due tipi di supporto per lo più usati nelle applicazioni sono:

• poli(stirene-co-divinilbenzene) PS-DVB

• 2) poli(etilenglicol-co-stirene-co-divinilbenzene) PEG-PS-DVB

(25)

Polistirene Reticolato.

Il supporto polimerico più usato nella sintesi organica in fase solida è il poli(stirene-co-divinilbenzene).

Il principale problema presentato da questo polimero per il suo impiego in sintesi è la sua disomogeneità.

(26)

Origine della Disomogeneità.

1. Differente reattività del m-DVB e del p-DVB:

 Per quanto riguarda il primo gruppo vinile, l'isomero meta reagisce con lo stirene più velocemente dell'isomero para.

 Il p-DVB reagisce meglio con sé stesso (microstruttura densa).

 Per quanto riguarda il secondo gruppo vinile, il m-DVB reagisce ad una velocità simile a quella dello stirene, e si inserisce più regolarmente.

2. Modifiche del polimero dopo la sua sintesi:

 Lavando il polimero con buoni solventi lo si secca con collasso dei pori.

 Lavando il polimero con cattivi solventi lo si secca con pori più grandi.

Regioni dense ricche in

monomero para.

Regioni omogenee ma spaziate dal monomero meta.

(27)

Sintesi del Polistirene Reticolato.

La tecnica preferita per la formazione di resine per sintesi è la

polimerizzazione in sospensione. Essa differisce dalle altre tecniche:

 È un sistema bifasico : fase monomero (costituita dal monomero e dal solvente organico –”porogeno”-) e la fase acquosa.

 Utilizza uno stabilizzante come additivo: una miscela di sali inorganici e specie organiche polari (polivinilalcol), per abbassare la tensione

superficiale delle gocce e inibire la loro aggregazione.

 Produce delle sfere quasi perfette. formando gocce di monomero in fase acquosa (sotto agitazione meccanica).

(28)

Proprietà del Polistirene Reticolato.

Il “Rigonfiamento” di un polimero reticolato è equivalente alla solvatazione di un

polimero lineare:

 Il solvente penetra nel polimero

reticolato e occupa gli interstizi tra le catene di polimero, facendo

aumentare il volume.

 La reticolazione del polimero crea come una trama che previene il

movimento delle catene del polimero necessarie a formare una soluzione.

 Il polimero rigonfiato è il reale solvente della reazione in fase solida, ma

presenta un'alta viscosità.

• Non c'è relazione diretta tra la quantità e la cinetica della reazione di imbibizione.

• Il grado di reticolazione ha un grande impatto sulla capacità di imbibizione tramite l'entropia configurazionale dissipata. Un'elevata reticolazione rende più rigido il

(29)

Resine Polistireniche Derivatizzate.

L'uso di Resine Polistireniche Derivatizzate è stato introdotto perché lo scheletro alchilico è chimicamente inerte mentre gli anelli benzenici sono reattivi e si

possono modificare facilmente (per sostituzione elettrofila aromatica (per es.

clorometilazione) o sostituzione nucleofila (litiazioni)). Inoltre, sono disponibili molti monomeri stirenici funzionalizzati poco costosi.

Metodo A: ha il vantaggio di far reagire solo anelli e posizioni di ugual

accessibilità. Lo svantaggio è che le reazioni sono lente e difficili da seguire con problemi di resa e sottoprodotti.

Metodo B: Assicura l'esatta posizione della funzionalizzazione e un altro grado di sostituzione, ma richiede la sintesi di appropriati monomeri.

PS PS

(30)

Resine Polistireniche Derivatizzate.

Ottenibili per funzionalizzazione del clorometilpolistirene:

PS

PS PS

PS

1) Potassio ftalimmide, DMF; 2) NH₂NH₂, EtOH; 3) NH₃, DCM; 4) KOAc, DMA, 85 ºC, 24h; 5) HAL, etere, 4h; 6) KOH, 1-pentanolo, riflusso, 24h; 7) KSAc, DMF; 8) LiBH₄, etere; 9) NaCN, DMF, H₂O, 120

(31)

Linkers nelle Sintesi SPOS.

Altri leganti

Linker Tritile

linker Sieber protetto linker

Rink ammide protetta

linker

Rink acido

(32)

Linkers nelle Sintesi SPOS (2).

Linker a presa sicura

stabile labile

+ CH₂N₂  R = CH₃: labile

Linker senza traccia (a presa sicura)

R = H: stabile

(33)

Sintesi in Fase Solida : Gruppi Protettori.

I gruppi protettori usati nella sintesi in fase solida sono pochi.

 Per ammine.

 Boc (t-butossicarbonile)

 Fmoc (9-fluorenilmetossicarbonile)

 Tmsec (2-[ trimetilsilil ]etossicarbonile).

 Per acidi carbossilici.

 Tert-Butil estere (t-butil estere)

 Fm estere (9-fluorenilmetil estere)

 Tmse estere (2-[trimetilsilil]etil estere).

(34)

Sintesi in Fase Solida di Peptidi - Stadi Coinvolti.

1. L'amminoacido N-protetto (Boc o Fmoc) è attaccato alla resina mediante il terminale C;

2. Deproteggere il terminale N;

3. Accoppiare: Aggiungere la soluzione del successivo amminoacido. Lasciare reagire, lavare;

4. Ripetere la deprotezione ed accoppiare con ogni

monomero successivo;

5. Staccare il peptide dalla resina.

Nota: sintetizzare da C a N

(35)

Sintesi in Fase Solida di Peptidi.

Accoppiamento

Sblocco finale

Rottura e deprotezione

Sbloccaggio Attivazione

Ripetere gli stadi ad ogni aggiunta di amminoacido

Resina Amminoacido 1

Amminoacido 2 Gruppo protettore Fmoc

Attivatore Gruppo protettore in catena (1)

Gruppo protettore

(36)

Chimica Organica in Fase Solida (Pro/Con).

I prodotti sono insolubili

 Più facile la manipolazione fisica

 Più facile purificarli, si possono lavare abbondantemente

 Si può usare un eccesso di reagenti per spostare le reazioni a completamento

 Nessuna reazione bimolecolare (diluzione infinita)

 Non si possono usare Reagenti in Fase Solida (SPR)

 Le cinetiche sono modificate (generalmente più lente, più ampie distribuzioni di velocità, i siti non sono uguali)

 Richiede nuove metodologie analitiche

 Richiede una chimica legata (limita le condizioni di reazione, impone la struttura del prodotto)

(37)

Chimica Organica in Fase Soluzione (Array).

Più composti significa meno tempo per composto.

Ciò richiede:

 Buone procedure generalizzate

 Corte sequenze sintetiche

 Reazioni ad alta resa

 Aggiunta stechiometrica di reagenti

 Richiede lo sviluppo di lavorazioni e metodi di purificazioni in parallelo

I prodotti sono solubili

 I sottoprodotti e i reagenti in eccesso sono anch'essi solubili e si accumulano ad ogni stadio

 L'analisi diretta è molto più facile (tlc, nmr, ms, hplc, lc/ms)

 Le cinetiche sono uniformi e familiari

 Si possono usare reagenti in fase solida (SPR)

 Non è richiesto nessun linkers, meno chimica vincolata.

(38)

Chimica Organica in Fase Soluzione (Array).

Reazioni di Condensazione a Componenti Multipli:

Armstrong, R.W., Combs, A.P., Tempest, P.A., Brown, S.D., & Keating, T.A. Acc.. Chem. Res.,

(39)

0 1000+

N° di Composti

tempo

tempo per la fase soliida

Sld P Array Sld P S&M

Solu P Array 2004

Sintesi Organica

Classica Solu P Array

1996

10,000+

Gli Array in Fase Soluzione o Sintesi Parallele ora dominano.

Tendenze negli Ultimi Anni.

(40)

Apparati Commerciali per la SPOS.

FlexChem www.robsci.com www.scigene.com

Charybdis Technologies www.spike.cc

Polyfiltronics/Whatman www.whatman.com

MiniBlock

www.bohdan.com www.Autochem.com

Argonaut

Quest 210 Nautilus 2400 Trident

Bohdan Ram Tecan Combitec

Advanced Chemtech 496

Myriad Core

Modelli base

Apparati Completi

(41)

Metodi di Purificazione.

Fase Solida

 Lavare esaustivamente

 Distacco dipendente dal Prodotto

Fase Soluzione – Purificazione Parallela

 Estrazione

• liquido-liquido, acido/base

• SPE, resine bloccanti

• Sintesi Fluorosa

 Cromatografia

 MIP (molecular imprinted polymers)

(42)

Resine Bloccanti:

S. W. Kaldor, J. E. Fritz, J. Tang, E. R. McKinney, Biorganic & Med. Chem. Lett., 6, 3041-3044 (1996).

(43)

Sintesi Fluorosa:

Fase Fluorosa (C₆F₁₂)

Fase Acquosa

Fase alocarburica (CH₂Cl₂)

D. P. Curran, M. Hoshino, J. Org. Chem., 1996, 61, 6480-6481.

D. P. Curran and Z. Luo, Fluorous Synthesis with Fewer Fluorines (Light Fluorous Synthesis):

Separation of Tagged from Untagged Products by Solid-Phase Extraction with Fluorous Reverse Phase Silica Gel, J. Am. Chem. Soc., 1999, 121, 9069. http://fluorous.com

Sostituire le resine con sostituenti fluorurati

(44)

Sintesi Parallele.

(45)

Sintesi Parallele Automatizzate.

Obiettivi

• Usare una via sintetica standard per produrre una gamma di analoghi, con un differente analogo in ogni recipiente di reazione,

• L'identità di ogni struttura è nota

• Utile per produrre un'ampia gamma di analoghi per SAR o ottimizzazione di prodotto (farmaco).

Sintesi parallela automatizzata

Sono disponibili sintetizzatori automatici con 42, 96 o 144 recipienti di reazione o postazioni

• Usano palline o spilli per il supporto in fase solida

• Le reazioni e le lavorazioni sono condotte automaticamente

• La stessa via sintetica usate per ogni recipiente, ma diversi reagenti

• Si ottengono prodotti differenti in ogni recipiente.

(46)

Sintesi Combinatoria in Soluzione.

Sintesi in Soluzione.

+ le condizioni di reazione sono di norma più facilmente adattate ad una ampia varietà di sostituenti + niente fasi di aggancio e stacco + nessuna limitazione di scala

- stretta limitazione nell'eccesso di reagenti

- Sono spesso necessarie estense e laboriose purificazioni

cromatografiche

- di norma parallelizzazione e automazione richiedono più sforzi iniziali

Sintesi in Fase Solida.

+ procedure di purificazione ottenute per semplice filtrazione che si può facilmente automatizzare

+ si può usare un eccesso di reagenti per spostare le reazioni a termine + sintetizzare miscele (separa e

combina)

+ facile da automatizzare

- Le condizioni di reazione si devono stabilire caso per caso

- La caratterizzazione dei prodotti sulle palline sono difficili

- La chimica sui polimeri è in parte costosa: polimeri, solventi

- Le resine e i linkers limitano il numero di possibili reazioni (ortogonalità)

Sintesi in soluzione è specialmente adatta a brevi sequenze di reazioni:

(47)

Sintesi Parallele in Soluzione.

Procedure di lavorazione: Estrazione liquido-solido usando bloccanti legati al polimero

• Basi e acidi ausiliari sono legati covalentemente a supporti insolubili

• Vantaggio: l'eccesso di reagenti e sottoprodotti si rimuovono per semplice filtrazione.

nucleofilo basico elettrofilo acido

(48)

Sintesi Parallele in Soluzione.

Metodi Speciali: reagenti o catalizzatori supportati su polimeri.

“sintesi Inversa” su fase solida:

bromurazione epossidazione chetoni

ossidanti riducenti

vari misti

(49)

Attrezzature per la CC.

L’apparecchiatura varia molto dalla tradizionale di “sintesi organica”.

‘personal synthesizer’ da 24

posizioni basati sulla chimica per reagenti in soluzione e supportati su solidi (provette da 0.3 - 3 ml) che consentono un veloce trasferimento via robot a 24 piatti per bioassaggi.

Stazione di reazione a 6 postazioni che opera con reazioni da 6 100 ml in parallelo con agitazione,

riscaldamento elettrico a camicia, sotto vuoto o in pressione, adatta per la sintesi parallela di precursori rilevanti.

(50)

Purificazioni in CC e Sintesi Parallele.

Sistema per purificazioni parallele di Stacker.

Contenitore a 24 postazioni che consente di effettuare filtrazioni, separazioni di fasi e tecniche di estrazioni in Fase Solida (SPE).

Opera in abbinamento con i sintetizzatori paralleli personali.

(51)

Sintesi Parallele.

Sintesi simultanea di molti prodotti in differenti

recipienti di reazione con l’aiuto dell’automazione.

(aumento della produttività di 100-volte o più).

Ogni pozzetto contiene un composto, e si può identificare dalla sua posizione sulla griglia.

Es.: Sintesi parallele di una libreria a 96-membri di dipeptidi in un piatto per micro titolazioni a 8 righe e 12 colonne. (vista parziale):

 Fase 1: ogni riga parte con un diverso amminoacido legato ad un supporto

 Fase 2: ogni colonna aggiunge un secondo amminoacido diverso. (si hanno 96 differenti dipeptidi)

 Fase 3: si rimuovono i dipeptidi dal supporto

 Fase 4: si testa ogni scomparto per l’attività biologica.

1 Stadio

2 Stadio

3 Stadio Ala, A

Val, V

Gly, G

A A A

V V V

G G G

Ala, A Val, V

Gly, G

A A A

V V V

G G G

I S F

F

F S

S I

I

I‒A S‒A F‒A

I‒V S‒V F‒V

I‒G S‒G F‒G

Ala, A Val, V

Gly, G

(52)

Sintetizzatore per Sintesi Automatizzata in Soluzione.

1. Sistema ISRA

• Requisiti: Tutte le procedure di una sintesi di laboratorio

devono essere automatizzate:

• pesatura, sintesi, lavorazione, analisi HPLC, diario di lab.

• L'automazione di tale processo completo è estremamente

difficile. Nessuna soluzione commerciale.

• Vantaggio: completamente automatico, sintesi parallele laboratorio, operativo 24 h al giorno.

1 robot 2 HPLC

3 sostegno iniziale 4 sostegno per filtro 5 stazione di filtrazione 6 stazione di chiusura

7 Asta di trasfer. lid 8 magazzino lid 9 stazione essic.

10 colonne essic.

11 sostegno freddo 12 bilancia

13 separazione di fase 14 rivelatore di fase 15 centrifuga

16 stazione hand over 17 evaporatore

18 blocchi reazione

19 stazione pipet.

20 supporto reagenti 21 supporto reagenti 22 HPLC-transfer 23 stazione vortexer

(53)

Robot per Trattamento Liquidi.

Valvola a 6-Vie

Siringhe Puntale

10 mL Loop

X Y Z

Deviatori

Baccio Robotico

Sistema Solvente

(54)

Filtrazione.

• Rimozione sali

• Cattura di

composti covalenti e Ionici

• Rimozione Resina

Piatto Sorgente Piatto di Destinazione Teste dei

Robot

Piatto filtrante

(55)

Estrazioni.

Liquido-Liquido:

1. Estrattore posizionale a Solvente Pesante

2. Estrattore posizionale a Solvente Leggero

3. Rivelatore di Liquido nell'estrazione a

Solvente Leggero

1 2

3-1 3-2 3-3

3

(56)

Cromatografia e SPE.

• Gel di Silice

• Gel di Silice Fluoroso C

₁₈

• Scambio Ionico

1. Scioglie i campioni in un adatto solvente

2. Trasferisce a piccole

cromatografiche

3. Eluisce i prodotti puliti e/o raccoglie le frazioni

(57)

Depositore Robotico per Piatti da TLC.

Macchie rivelate

(58)

Ottimizzazioni di Reazioni e Chimica Combinatoria.

• Combinatorial Methods for High-Throughput Materials Science, MRS Proceedings Volume 1024E, Fall 2007

• "Design, Synthesis, and Evaluation of Small-Molecule Libraries.”

Ellman, J. A. Acc. Chem. Res. 1996, 29, 132 -143.

• Combinatorial Chemistry, Nicholas K. Terrett, Oxford University Press, London, 1998

• Combinatorial methods for development of sensing materials, Springer, 2009. ISBN 978-0-387-73712-6

(59)

Migliori Processi – Più Controlli anche in Fase di Sviluppo.

INTERFACCIA ELETTRONICA

REATTORI ADIABATICI REATTORI SU SCALA

DA BANCO e PILOTA SINTESI

PARALLELE

PC



(60)

Chimica Semi Batch.

 Sistemi più comuni.

 Alimentazione di liquidi automatizzata, controllo di T, P e agitazione,

distillazione liquidi.

 Interfaccia utente: flessibile, vari sensori.

 Utili per analisi

termodinamiche e di sicurezza (calorimetria, reazioni fuggitive).

(61)

Controllo in Tempo Reale.

Visione Grafica

Quadro MIMIC + Dati

Tabellare

Controllo

(62)

Unità su Scala Pilota.

 Reattore per alte pressioni da 0.05-20 L.

 Continuo e Semi-batch con varie alimentazioni di:

- liquidi volatili

- composti piroforici - gas infiammabili

 Prerogative

- a prova di esplosione

 Interfaccia standard.

 I sistemi di reattori tubulari sono modulabili e di varie dimensioni e diametri, ingegnerizzati per varie pressioni e temperature.

PARR

(63)

Progettazione Fattoriale (Disegni Sperimentali) nell'Ottimizzazione di Processi Chimici.

-2 -1.5 -1 -0.5 0 0.5 1 1.5 2

-2 -1.5 -1 -0.5 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3

-6 -4

-2 -2

0

0 0

0

2 2 2

2

2 4

4 4

6 6

local minimum

Disegni sperimentali:

• Progettazione fattoriale completa con repliche

vs.

• ANOVA ad Un-Fattore :

• Separa la variazione totale

osservata in una serie di misure in:

• Variazione in un sistema

• Dovute a errori random di misura

• Variazione tra i sistemi

• Dovute alle reali differenze + errore random

• La variazione(2) è statisticamente maggiore della variazione(1)?

• Disegno sperimentare a Un-fattore.

(64)

Chimica Sintetica Combinatoria.

(65)

Chimica Combinatoria:

Esplorazione della Diversità Molecolare

Consiste nella progettazione e preparazione di “librerie” (“libraries”) di prodotti a struttura simile, basate su di una molecola modello (“lead”), in modo da poter verificarne le proprietà biologiche e nell'ottimizzazione delle stesse per sviluppare nuovi farmaci nell’industria farmaceutica.

Si tratta di una strategia con cui si possono preparare potenzialmente un gran numero di composti in modo rapido e simultaneo (“libraries”), oltre che singoli prodotti (“parallel synthesis”) o come miscele di essi

(“combinatorial synthesis”), mediante la combinazione di un gruppo o gruppi di reattivi in solo pochi stadi sintetici consistenti in trattamenti di dissoluzione o adsorbimento in fase solida, che permette una

delucidazione strutturale rapida (“deconvolution and tagging”), un

riconoscimento accelerato delle relazioni struttura-attività (“SAR”) e la possibilità di automatizzazione.

Tecnica inventata nei tardi anni 1980 e inizio anni 1990.

(66)

Approccio alla Sintesi Combinatoria.

+ +

Identificazione di un Target Biologico

Sviluppo di un saggio

Screening ad alto rendimento

Selezione

Struttura capofila

Ottimizzazione capofila

Sviluppo

Librerie Random

Chimica Combinatoria

Librarie Mirate

(67)

Sintesi Combinatoria

• Si effettuano reazioni multiple in un unico recipiente, generando un’ampia varietà di diversi prodotti noti come libreria combinatoriale. Normalmente la reazione è la stessa, ma i reagenti sono differenti. Il numero dei composti possibili è: b·x (x = N° degli stadi)

• Progettazione della sintesi combinatoriale: sequenziale (a) o templata (b):

• La generazione sintetica della diversità molecolare era concettualmente e sperimentalmente radicata nella sintesi in fase solida di peptidi: La sua

estensione ad altre classi di molecole organiche si è avuta solo dopo il 1990.

A B C

Libraria Lineare Libraria a Templato

A

B C

templato

(68)

Sintesi Combinatoria.

Fonte di Diversità Chimica :

Illimitata !

Nessuna variazione consentita

(69)

Sintesi Combinatoria Mista.

Obiettivi:

• Usare una via sintetica standard per produrre un'ampia gamma di diversi analoghi dove ciascun recipiente di reazione contiene una miscela di prodotti

• Le identità delle strutture in ogni recipiente non sono note con certezza

• Utile per trovare un composto capostipite ("lead")

• Capace di sintetizzare un gran numero di composti velocemente

• Ogni miscela è testata per l'attività come miscela

• Le miscele inattive sono conservate in librerie combinatoriali

• Le miscele attive sono studiate ulteriormente per identificare il/i componenti attivi.

(70)

Approccio Combinatorio.

Sintesi combinatoria

 10³-10⁴composti/esperimento Sintesi tradizionale

 1 chimico =

50 composti/l’anno

A + B AB

A₁ B₁

A₂ B₂

A₃ B₃

. .

A_n B_m

n m prodotti

B₁ B₂ B_m

A₂ A₁

A_n

(71)

Analisi Multi Stadio.

Vaglio di Primo Stadio

Test per solo una o due proprietà

Vaglio di Secondo Stadio

Test per altre proprietà chiave

Materiali Rapidamente Identificati

Campioni con proprietà attese

Candidati per Scale-up

I materiali più promettenti si usano in esperimenti su scala pilota

Screening ad Alta Efficienza che Usa Metodi

Combinatoriali

Screening

Convenzionale che Usa Metodi Consolidati

100-1000 campioni alla set.

10-100 campioni alla settimana

1-10 campioni alla settimana

1-2 campioni al mese

(72)

Strategie Sperimentali: Sintesi Organica Combinatoria.

• Si calcolano i descrittori strutturali per ogni composto.

• Si calcolano i coefficienti di similarità tra coppie di composti.

• Si scelgono i composti con l'ausilio di metodi multivariati (basati su vicinanza, dissimilarità, ecc.).

Possibile perché l'obiettivo è un solo composto.

(73)

Sintesi Combinatoria Mista.

La procedura del Metodo Combinatoria "Mix and Split" implica cinque sintesi separate usando come strategia quella di mescolare e separare.

Esempio – La sintesi di tutti i possibili tripeptidi usa 3 amminoacidi (il metodo Standard avrebbe implicato 25 sintesi separate).

"Ricombinare"

RIUNIRE

"Accoppiare"

RIUNIRE

Numero di leganti = Nⁿ dove N=numero di molecole di riferimento & n = numero

“Separare"

Lam, K. S.; Lebl, M.; Krchn¡ak, V. The

“One-Bead-One-Compound”

Combinatorial Library Method. Chem.

Rev. 1997, 97, 411-448.

27 tripeptidi

(74)

Metodo "Geysen Pin" (per Sintesi Parallele di Peptidi).

Resine legate a spilli in un formato a batteria 8  12

Reagenti o solventi di

lavaggio in un piatto da 96 postazioni

Immergere per fare le reazioni o lavare le resine

Kit disponibile

www.mimotopes.com

(75)

Tecnica delle Bustine da Te ("Tea bag") per la Sintesi Parallela di Peptidi.

Richard A. Houghten, PNAS USA 1985, 82, 5131-5135.

Lavaggio e deprotezione:

condotte assieme.

Accoppiamento:

separare le bustine

raggruppando in base all'AA da accoppiare.

Ogni gruppo è accoppiato separatamente.

FRONTE LATO

Etichetta Resina Chiusura

Apertura a rete

(76)

Tecnica SPOT per la Sintesi Parallela di Oligonucleotidi.

Ronald Frank et al. Nucl. Acids Res. 1983, 11, 4365-4377

Metodo del disco a filtro : un oligo per disco.

Lavaggio, deprotezione e ossidazione:

Tutto assieme.

Accoppiamento:

Inserire i dischi in quattro contenitori differenti contenenti i precursori dA, dC, dT, dG

In base alla sequenza oligo di ogni disco.

Metodo SPOT : un oligo per disco Lavaggio, deprotezione e ossidazione:

tutto assieme.

Accoppiamento:

Pipettare la soluzione di accoppiamento contenente i precursori dA, dC, dT, dG nei dischi in base alla sequenza.

(77)

Pianificazione di Sintesi Combinatoriali: Scaffolds.

• Per esplorare lo spazio conformazionale si usano preferibilmente gli

‘Spider’ scaffolds.

• Consentono di variare i gruppi funzionali attorno alla molecola per aumentare la probabilità di trovare adatte interazioni di legame a H.

Il peso molecolare degli scaffold deve essere abbastanza basso da

permettere delle variazioni di funzionalità, senza dare prodotti con PM > 500.

SITO di LEGAME DEL

RECETTORE

regioni di legame

Esplorazione della libreria di composti

(78)

Pianificazione di Sintesi Combinatoriali: Scaffolds (2)

"Scaffolds Tadpole:

• variazione limitata a una specifica regione attorni alla molecola;

• minore probabilità di interazioni favorevoli con un sito di legame.

Scaffolds Privilegiati

• scaffolds che sono comuni in chimica farmaceutica e che sono associati con diversi intervalli di attività.

• benzodiazepine, idantoine, benzenesolfonammidi, ecc..

'Spider' Scaffold con sostituenti 'dispersi'

'Tadpole' scaffold con sostituenti 'addensati'

(79)

Pianificazione di Sintesi Combinatoriali:

Esempi di Librerie di Scaffold.

Idantoine b-Lattami Piridine

• Buoni scaffolds

• Tipo Spider

• Basso peso molecolare

• Varietà di vie sintetiche disponibili

Dipeptidi Benzodiazepine

(80)

Glucosio

Tipo Spider e basso MW - buone premesse Ma gruppi OH multipli

Difficile variare R₁-R₅ indipendentemente

Steroide

MW relativamente alto

Limitato N° di gruppi funzionali per avere MW

< 500

Relativamente poche posizioni su cui legare facilmente i sostituenti

Scaffold tipo Tadpole

Ristretta regione di variabilità

Pianificazione di Sintesi Combinatoriali:

Scaffolds - cattivi esempi.

(81)

Chimica Combinatoria.

Ricerca bersaglio Ricerca capostipite

Libreria Random

5000 composti

HTS: 1° Bersaglio

EC₅₀ 10 mM

Libreria Mirata

500 composti

Struttura Bersaglio

EC₅₀20 nM

Programma Finale di Ottimizzazione.

(82)

Chimica Combinatoria Dinamica:

Esempio - Leganti per l‘Anidrasi Carbonica.

• Reazione - formazione reversibile di immine:

• Reazione condotta in presenza di anidrasi carbonica;

• Tre aldeidi e quattro ammine presenti come precursori modello;

• Il sodio cianoboroidruro aggiunto per ‘congelare’ la miscela:

• Prodotti quantificati e identificati;

• Gli esperimenti sono ripetuti in assenza del target per identificare il/i prodotto(i) amplificati;

• Il prodotto amplificato non è necessariamente presente in grandi

Immina Ammina secondaria

Immina Aimmna primaria

Aldeide

(83)

Chimica Combinatoria Dinamica:

Esempio - Leganti per l‘Anidrasi Carbonica

Substrati modello indagati:

prodotto amplificato:

Composto Attivo

NaBH₃CN

Ammina secondaria Derivata

Aldeidi ammine

(84)

Screening ad Alta Produttività.

Sistemi di screening molecolare

• Parametro da misurare: Legame

recettore legante anticorpo antigene

DNA proteina che lega il DNA.

• Parametro da misurare: funzione enzimatica

Turnover del substrato

Modifiche di una molecola target.

Sistemi di screening subcellulari

Interazioni o saggi enzimatici con componenti subcellulari quali preparazioni di membrane o frazioni cellulari.

Sistemi di screening cellulari

• Parametri da misurare: Eventi Cellulari

Secrezione

Attivazione di flussi intracellulari di ioni Generazione di molecole messaggere

Stimolo dell'espressione genica. Significativamente più complesso

Riduzionismo:

esplorazione di problemi complessi per riduzione a parti semplici

Animali Organi

Tessuti Cellule

Organelli Molec

ole

(85)

Bibliografia Chimica Combinatoria.

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(86)

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3. Zhang, W.; Curran, D. P. Synthetic Applications of Fluorous Solid-Phase Extraction (F-SPE). Tetrahedron 2006, 62, 11837–11865.

4. Go, E. P.; Uritboonthai, W.; Apon, J. V.; Trauger, S. A.; Nordstrom, A.;

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6. Click Chemistry: Diverse chemical function from a few good reactions H. C.

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