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CAPITOLO 4
MATERIALI E METODI
• Cromatografia su strato sottile (TLC)
Metodi cromatografici
Le cromatografie su strato sottile sono state eseguite su lastre di gel di silice Kieselgel 60 F254 (Merck) di 0.25 mm di spessore, su supporto di vetro o alluminio.
Come fase mobile (eluente) sono state scelte le seguenti miscele di solventi:
• BAW (n-butanolo–acido acetico–acqua, 60:15:25)
• CMW (cloroformio–metanolo–acqua, 80:18:2 e 70:30:3)
La rivelazione delle macchie è stata effettuata con la luce UV (254 e 366 nm) e con i seguenti reattivi spray:
• Soluzione satura di solfato di cerio in acido solforico al 65% seguita da riscaldamento a 120°C per 15 minuti per rendere visibili le macchie.
Cromatografia su colonna
• Cromatografia di esclusione molecolare
Per la cromatografia di esclusione molecolare è stato impiegato come supporto gel di Sephadex LH-20 (25-100 mm, Pharmacia Fine Chemicals), utilizzando una colonna di 100 x 6cm per l’estratto cloroformio–metanolo 9:1 (10.54 g) e n-butanolico (4.53 g). Come fase mobile è stato utilizzato
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metanolo. Infine è stata adoperata una pompa peristaltica Pharmacia Fine Chemicals P1, con un flusso costante di 0.8 ml/min.
Fig. 4.1 Colonna Sephadex LH-20 ad esclusione molecolare
• Cromatografia flash
Per la cromatografia flash è stata impiegata come fase stazionaria il gel di silice 60 (230-410 mesh, Merck).
Per ottenere un flusso di 20 ml/min è stata utilizzata aria compressa.
95 Fig. 4.3 Colonna flash dell’estratto cloroformico
• HPLC (High Performance Liquid Chromatography)
Le separazioni con HPLC (20-100 bar) sono state effettuate con un apparecchio Shimadzu, costituito da:
- Pompa Shimadzu LC-8A - Rivelatore Shimadzu RID-10A
- Colonna Waters C-18 µ-Bondapak (30 cm x 7.8 mm)
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Potere ottico rotatorio
Metodi chimico-fisici
Le misure sono state effettuate con un polarimetro Perkin-Elmer modello 241, fornito di una lampada al sodio (589 nm), alla temperatura di 22 ºC, in celle da un decimetro di lunghezza ed un ml di volume, utilizzando metanolo come solvente.
Spettri di massa
Gli spettri di massa ESI-MS (modalità positiva e negativa) sono stati registrati con uno spettrometro Thermo Finningan LC-Q Advantage a trappola ionica equipaggiato con un software Xcalibur. I campioni sono stati sciolti in MeOH ed iniettati nella fonte ESI utilizzando una pompa a siringa. La velocità del flusso è stata di 5 µl/min.
Spettri di dicroismo circolare
Gli spettri di dicroismo circolare sono stati registrati in MeOH su uno spettrofotometro JASCO J-810 con una cella di 0.1 cm, a temperatura ambiente e con le seguenti condizioni: velocità 50 nm/min, larghezza della banda 2.0 nm, time constant 1 s.
Spettri di risonanza magnetica nucleare
Per gli spettri NMR è stato utilizzato uno spettrometro Bruker DRX-600 (software UXNMR) operante a 599.19MHz per 1H e 150.86MHz per 13C e uno strumento Bruker AC-250 (software Topspin) operante a 250 MHz per
1
H e 62.5MHz per 13
Gli spettri mono e bidimensionali sono stati misurati in CD C.
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Negli spettri 1H-NMR, per la misurazione in CD3OD, è stato usato come
standard il segnale del solvente (CD3
Negli spettri
OD a 3.31 ppm e DMSO-d6 a 2.49 ppm). I chemical shifts sono riportati in δ (ppm).
13
C-NMR è stato usato come riferimento il segnale del solvente a 49.0 δ per il CD3OD e a 39.5 δ per il DMSO-d6.
Fig. 4.6 Strumentazione NMR
L'esperimento di correlazione diretta omonucleare (DQF-COSY, Double Quantum Filtered COSY) è stato eseguito usando la convenzionale sequenza di impulsi.
L'esperimento di correlazione diretta eteronucleare 1H-13C HSQC è stato realizzato su una matrice 512 x 1024, usando una costante di accoppiamento
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C-H di 135 Hz ed un relaxation delay di 1.5 sec (Kay et al., 1992; Palmer et
al., 1991).
L'esperimento di correlazione eteronucleare long range (HMBC) è stato ottenuto utilizzando la sequenza di Bax² (Bax e Subramanian, 1986) ad una costante long range media di 6-8 Hz e una matrice 512 x 1024.
Gli esperimenti DEPT-135° sono stati eseguiti utilizzando trasferimenti di polarizzazione per mezzo liquido di impulsi a 90° per ottenere solo i gruppi CH e di 135° per ottenere segnali positivi per i gruppi CH e CH3 e negativi per i gruppi CH2
Il ritardo nel trasferimento di polarizzazione è stato corretto ad un accoppiamento medio C-H di 135Hz.
.
Gli esperimenti 1D-TOCSY e 1D-ROESY sono stati ottenuti usando un software UX-NMR; in particolare 1D-TOCSY è stato eseguito utilizzando un generatore di impulsi gaussiani usando, durante il mixing time, la sequenza di impulsi di tipo MLEV-17 (mixing time 80-100 ms), secondo quanto riportato in letteratura (Davis e Bax, 1985).
