• Non ci sono risultati.

Messa a punto di un metodo sperimentale per lo studio in

N/A
N/A
Protected

Academic year: 2021

Condividi "Messa a punto di un metodo sperimentale per lo studio in"

Copied!
7
0
0

Testo completo

(1)

UNIVERSITÀ DI PISA

Facoltà di Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali

Corso di Laurea Specialistica in Scienze e Tecnologie Biomolecolari

Tesi di Laurea

Messa a punto di un metodo sperimentale per lo studio in vivo della

localizzazione di mRNA in colture cellulari e durante la retinogenesi di

Xenopus laevis.

Candidata

Relatori

Stefania Simonini Prof.ssa Luciana Dente

Dott.ssa Silvia Marracci

Correlatori

Prof. Federico Cremisi Prof. Robert Vignali

(2)

“Quando si alza lo sguardo al cielo lo si vede nero, cosparso di vaghi

chiarori; solo a poco a poco le stelle si fissano e dispongono in disegni

precisi, e più si guarda più se ne vedono affiorare.”

(3)

Indice analitico

Indice analitico...3

Riassunto...6

Abstract...7

1 Capitolo 1: Introduzione...8

1.1 Localizzazione intracellulare di mRNA...9

1.1.1 Significato biologico...9

1.1.2 Meccanismi molecolari che rendono possibile la localizzazione degli mRNA...11

1.1.2.1 Movimenti degli mRNA basati sui microfilamenti di actina...13

1.1.3 Macchinario molecolare coinvolto nella localizzazione di mRNA: strutture “zip code” e proteine “RNA binding”...14

1.2 La localizzazione degli mRNA nel Sistema Nervoso...18

1.2.1 Localizzazione degli RNA nei dendriti...23

1.2.2 Localizzazione degli RNA negli assoni...25

1.3 La retina neurale: una componente del SNC...29

1.3.1 Concetto di “divisione cellulare asimmetrica”...34

1.3.2 Divisioni cellulari asimmetriche nella retina...35

1.4 Scopo della tesi...36

2 Capitolo 2: Materiali e metodi...39

2.1 Tecniche di clonaggio genico...40

2.1.1 Trasformazione di cellule batteriche competenti...40

2.1.1.1 Ceppo batterico DH5α...40

2.1.1.2 Preparazione di cellule competenti mediante l'utilizzo di RbCl...40

2.1.1.3 Trasformazione batterica...42

2.1.1.4 Semina di colonie batteriche trasformate...41

2.1.2 Estrazione di DNA plasmidico...42

2.1.2.1 Estrazione di DNA plasmidico su piccola scala mediante lisi alcalina...42

2.1.2.2 Purificazione di DNA plasmidico mediante kit...44

2.1.2.3 Estrazione di DNA plasmidico su media scala...44

2.1.3 Corsa elettroforetica su gel di agarosio...45

2.1.3.1 Caricamento del campione e corsa elettroforetica...45

2.1.4 Purificazione di acidi nucleici...46

2.1.4.1 Estrazione e purificazione di frammenti di DNA da gel e purificazione di prodotti di PCR...46

(4)

2.1.4.2 Estrazione fenolica e precipitazione alcoolica...47

2.1.5 Digestione di DNA plasmidico con enzimi di restrizione...47

2.1.5.1 Digestioni parziali……….………….49

2.1.6 Ligation...50

2.1.6.1 Reazione di “fill-in”………...………50

2.1.6.2 Defosforilazione……….51

2.1.6.3 Ligation………..52

2.1.7 Amplificazione di DNA mediante PCR...54

2.1.8 Determinazione della concentrazione e della purezza degli acidi nucleici mediante lettura allo spettrofotometro...56

2.2 Ibridazione in situ su sezioni...57

2.2.1 Raccolta degli embrioni di Xenopus laevis...57

2.2.2 Sintesi in vitro delle sonde...58

2.2.3 Istologia...60

2.2.3.1 Inclusione degli embrioni in paraffina e taglio al microtomo...60

2.2.3.1.1 Fissazione degli embrioni per inclusione in paraffina...60

2.2.3.1.2 Inclusione degli embrioni in paraffina...60

2.2.3.1.3 Montaggio dei blocchetti di paraffina e taglio al microtomo...61

2.2.3.2 Inclusione degli embrioni in OCT e taglio al criostato...61

2.2.3.2.1 Fissazione e disidratazione...61

2.2.3.2.2 Inclusione degli embrioni in resina OCT o “Tissue Tek”...62

2.2.3.2.3 Sezioni al criostato...62

2.2.4 Ibridazione in situ su sezioni in paraffina...63

2.2.5 Ibridazione in situ su sezioni al criostato...67

2.2.6 Acquisizione delle immagini al microscopio e successiva elaborazione...68

2.3 Colture cellulari...69

2.3.1 Linea cellulare e condizioni di coltura...69

2.3.2 Congelamento delle cellule...69

2.3.3 Deprivazione del siero e trasfezione dei costrutti...70

2.3.4 Fissazione delle cellule...71

2.3.5 Osservazione al microscopio...71

3 Capitolo 3: Risultati...72

3.1 Premessa………..…….…..73

3.1.1 Descrizione dei costrutti……….73

3.1.2 Applicazione del metodo………73

3.1.2.1 Vantaggi del metodo in esame………74

(5)

3.2.1 Descrizione dei tre costrutti di partenza……….………75

3.2.2 Subclonaggio dei costrutti nel vettore plasmidico pCS2+………..77

3.2.3 Strategie di subclonaggio………78

3.2.3.1 Costrutto MS2-GFP………...………...78

3.2.3.2 Costrutti in mRNA target………..………..…………85

3.3 Trasfezione dei costrutti in cellule eucariotiche di mammifero……….…90

3.3.1 Caratteristiche del modello cellulare………..90

3.3.2 Trasfezioni………..90

3.3.3 Screening di geni, espressi nell’occhio di Xenopus laevis, di cui eventualmente clonare il 3’UTR nel costrutto in cis………...95

4 Capitolo 4: Discussione dei risultati...104

4.1 Prospettive future...107

Bibliografia...108

(6)

Riassunto

Titolo della tesi: Messa a punto di un metodo sperimentale per lo studio in vivo della localizzazione di mRNA in colture cellulari e durante la retinogenesi di Xenopus laevis.

La localizzazione intracellulare degli mRNA rappresenta un importante meccanismo di regolazione genica post-trascrizionale, coinvolto sia nella diversificazione del destino cellulare che nella determinazione della polarità cellulare. Finalità della mia tesi è la messa a punto di un metodo innovativo per studiare in vivo la distribuzione intracellulare di RNA messaggeri allo scopo di effettuare un’analisi della loro segregazione durante le divisioni cellulari che accompagnano la retinogenesi nell’anfibio Xenopus laevis. Il sistema sperimentale che ho utilizzato si basa su due componenti: la proteina MS2-GFP, derivata dalla fusione della proteina batteriofagica MS2 con proprietà “RNA-binding”, con la proteina fluorescente verde GFP, dotata di un segnale di localizzazione nucleare; un mRNA reporter contenente un sito di legame per la proteina MS2-GFP, costituito da più ripetizioni di un’unità “stem-loop” (ripetizioni MS2), poste a monte del 3’UTR di un gene di interesse. La proteina MS2-GFP, riconoscendo le ripetizioni MS2, rimane associata all’mRNA reporter nel citoplasma, permettendone la visualizzazione in vivo mediante osservazione al microscopio ad epifluorescenza o al microscopio confocale. Questo metodo si rivela un utile strumento per seguire la dinamica di trasporto e di localizzazione degli RNA messaggeri con una risoluzione temporale e spaziale più fine rispetto a quelle consentite dai tradizionali approcci di studio che, richiedendo la fissazione delle cellule, forniscono un’immagine statica della presenza degli RNA. Durante la mia tesi, ho preparato una serie di costrutti: ho clonato nel vettore di espressione pCS2+ la sequenza codificante per la proteina di fusione MS2-GFP, dotata all’estremità C-terminale di un segnale di localizzazione nucleare (NLS); ho preparato inoltre altri costrutti in pCS2+ contenenti 6 o 24 ripetizioni MS2, poste a monte della sequenza 3’ UTR di alcuni geni di interesse come Rab-13, Xotx2 e Xotx5b. Per mettere a punto il sistema ho effettuato una serie di trasfezioni nella linea cellulare HN9.10e, derivante dalla fusione somatica di cellule ippocampali di topo con un neuroblastoma murino: il solo plasmide pCS2+-MS2-GFP mostra, come atteso, un segnale strettamente nucleare. La co-trasfezione del plasmide pCS2+-MS2-GFP con il costrutto contenente 24 ripetizioni MS2 più il 3’UTR di Rab13 o il 3’UTR di Xotx2, determina lo spostamento della proteina reporter nel citoplasma dei neuroblasti. In particolare, il trascritto Xotx2 risulta localizzato a livello di alcune protrusioni cellulari, suggerendo che il suo mRNA possa essere asimmetricamente distribuito nel citoplasma neuronale. In futuro, intendiamo applicare questo metodo sperimentale all’analisi della localizzazione intracellulare degli mRNA di Xotx2 e Xotx5b durante la retinogenesi di Xenopus, mediante lipofezione dei costrutti nella vescicola ottica di embrioni a stadio di neurula precoce e successiva analisi della segregazione di questi trascritti durante le divisioni cellulari che accompagnano il differenziamento dei tipi cellulari retinici.

(7)

Abstract

Headline: Designing an experimental method to image specific mRNAs in living cells and during

Xenopus laevis retinogenesis.

Intracellular mRNA localization represents a common mechanism of post-transcriptional regulation of gene expression, involved both in cell lineage specification and in cell polarity.

During my thesis project, I developed an innovative method useful to analyse intracellular mRNA localization in vivo, with the aim of studying the segregation of specific mRNAs during retinogenesis of

Xenopus laevis.

The experimental system I developed is based on two components:

1. MS2-GFP fusion protein: the RNA-binding MS2 phage coat protein, fused with the enhanced green fluorescent protein (eGFP), which carries a nuclear localization signal (NLS);

2. a reporter mRNA containing multiple MS2-binding sites with a “stem and loop” secondary structure (“MS2 repeat”), upstream of a 3’UTR region of an interest gene.

The MS2-GFP protein recognizes and binds the “MS2-repeats” of the reporter mRNA in the cytoplasm, allowing to observe reporter mRNA localization in vivo, by using confocal or epifluorescence microscope. This technique, characterized by a good temporal and spatial resolution, appears a powerful research tool to investigate the dynamics of mRNA transport and localization, alternatively to traditional approaches that require fixing cells, providing a static imaging of mRNA distribution. During my thesis work, I prepared the following constructs: I cloned in the expression vector pCS2+ the sequence encoding the MS2-GFP protein, with a nuclear localization signal at the C-terminal; I prepared also other constructs in pCS2+, containing either 6 or 24 “MS2-repeats”, upstream of Rab-13, Xotx2, Xotx5b 3’UTR regions. In order to set up the system, I performed a series of transfections into cell lineage (HN9.10e, a cell lineage derived from somatic fusion of murine ippocampal cells and a murine neuroblastoma). When we transfect only the pCS2+-MS2-GFP plasmid into recipient, the cells show a typically nuclear fluorescent signal, as expected. Co-transfection experiments of the pCS2+-MS2-GFP plasmid with the construct containing “24X MS2-repeats” upstream of the Rab 13 3’UTR, determine the translocation of the reporter protein MS2-GFP from the nucleus into the cytoplasm of the cells. Finally, when we co-transfect pCS2+-MS2-GFP plasmid with the construct containing “24X MS2 repeats” upstream of the Xotx2 3’UTR, we observe a preferential localization of the transcript at the level of neuronal protrusions; in perspective, we intend to apply this experimental method to analyse the mRNA localization of Xotx2 and Xotx5b during Xenopus retinogenesis by lipofecting the plasmid constructs into embryos optical vesicles in vivo, at the early neurula stage.

Riferimenti

Documenti correlati

Pathway Manager, who will oversee the review and development of Clinical Pathways in that area.. They must ensure that all paths have been reviewed within the last 2 years, and

This system allowed us to measure the dispersion effects on the total gate capacitance and total gate current within the frequency range 10MHz÷40MHz, for the special case when

rqh zrxog olnh wr dqdo|}h wkh hpsor|phqw e| vh{/ djh/ hgxfdwlrq dqg vhfwru/ wr lghqwli| wkh oderu pdunhw vlwxdwlrq ri wkrvh djhqwv/ zkr duh pruh olnho| wr ehqhw iurp hduo|

Le Entešārāt-e Nilufar si sono particolarmente distinte nel campo della traduzione dei classici della narrativa straniera europea e americana e nel campo della critica letteraria

Il contributo più grande che Galilei ha dato alla scienza è l’introduzione del metodo scientifico o sperimentale.. Galileo opera una distinzione netta tra filosofia, religione e

However, in their pursuit of high and stable economic growth, Brazil and the other BRICS countries have played an active role in damaging the environment through

Several parametric analyses are carried out to investigate the mechanical behavior of these multi-layered structures depending on the damage features, through-the-thickness