LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETO
VETERINARIJOS AKADEMIJA
Egl÷ Kudirkien÷
CAMPYLOBACTER JEJUNI PAPLITIMAS,
GENETINö ĮVAIROVö BEI IŠGYVENIMO YPATUMAI
BROILERIŲ MöSOS GAMYBOS GRANDINöJE
LIETUVOJE
Daktaro disertacijos santrauka
Biomedicinos mokslai, veterinarin÷ medicina (12 B)
Kaunas, 2010
Disertacija rengta 2006–2010 metais Lietuvos sveikatos mokslų univer-siteto Veterinarijos akademijoje, Kopenhagos univeruniver-siteto Veterinarinių ligų biologijos katedroje.
Moksliniai vadovai: Doc. dr. Loreta ŠERNIENö (LSMU Veterinarijos akademija, biomedicinos mokslai, veterinarin÷ medicina – 12 B) (2006 10 25–2008 10 29);
Doc. dr. Mindaugas MALAKAUSKAS (LSMU Veterinarijos akademija, biomedicinos mokslai, veterinarin÷ medicina – 12 B) (2008 10 30– 2010 09 29).
Konsultantai: Prof. dr. John Elmerdahl OLSEN (Kopenhagos universi-teto Veterinarinių ligų biologijos katedra, biomedicinos mokslai, veterinari-n÷ medicina – 12 B);
Doc. dr. Loreta ŠERNIENö (LSMU Veterinarijos akademija, biomedi-cinos mokslai, veterinarin÷ medicina – 12 B) (2008 10 30–2010 09 29).
Veterinarin÷s medicinos mokslo krypties taryba:
Pirmininkas – Doc. dr. Judita ŽYMANTIENö (LSMU Veterinarijos akademija, biomedicinos mokslai, veterinarin÷ medicina – 12 B).
Nariai: Prof. habil. dr. Gražina JUODEIKIENö (Kauno technologijos universitetas, technologijos mokslai, chemijos inžinerija – 05 T);
Prof. dr. Algimantas PAULAUSKAS (Vytauto Didžiojo universitetas, biomedicinos mokslai, biologija – 01 B);
Dr. Modestas RUŽAUSKAS (LSMU Veterinarijos akademijos Veterina-rijos institutas, biomedicinos mokslai, veterinarin÷ medicina – 12 B);
Dr. Arūnas STANKEVIČIUS (LSMU Veterinarijos akademija, biome-dicinos mokslai, veterinarin÷ medicina – 12 B).
Oponentai: Prof. dr. Jūrat÷ ŠIUGŽDAITö (LSMU Veterinarijos aka-demija, biomedicinos mokslai, veterinarin÷ medicina – 12 B);
Dr. Nomeda KUISIENö (Vilniaus universitetas, biomedicinos mokslai, biologija – 01 B).
Disertacija bus ginama viešame Veterinarin÷s medicinos mokslo kryp-ties tarybos pos÷dyje 2010 m. lapkričio 26 d. 14 val. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Veterinarijos akademijos dr. S. Jankausko auditorijoje.
Adresas: Tilž÷s g. 18, 47181 Kaunas, Lietuva.
Disertacijos santrauka išsiųsta pagal patvirtintą adresų sąrašą 2010 m. spalio 26 d.
LITHUANIAN UNIVERSITY OF HEALTH SCIENCES
VETERINARY ACADEMY
Egl÷ Kudirkien÷
PREVALENCE, GENETIC DIVERSITY AND
SURVIVAL PROPERTIES OF
CAMPYLOBACTER JEJUNI IN THE BROILER MEAT
PRODUCTION CHAIN IN LITHUANIA
Summary of doctoral dissertation
Biomedical Sciences, Veterinary Medicine (12 B)
Kaunas, 2010
The study was carried out in 2006-2010 at the Lithuanian University of Health Sciences' Veterinary Academy, at the Department of Veterinary Di-sease Biology of the University of Copenhagen.
Scientific supervisors: Assoc. Prof. Dr. Loreta ŠERNIENö (LUHS Ve-terinary Academy, Biomedical Sciences, VeVe-terinary Medicine – 12 B) (25 10 2006–29 10 2008);
Assoc. Prof. Dr. Mindaugas MALAKAUSKAS (LUHS Veterinary Aca-demy, Biomedical Sciences, Veterinary Medicine – 12 B) (30 10 2008–29 09 2010).
Scientific consultants: Prof. Dr. John Elmerdahl OLSEN (Department of Veterinary Disease Biology of the University of Copenhagen, Biomedical Sciences, Veterinary Medicine – 12 B);
Assoc. Prof. Dr. Loreta ŠERNIENö (LUHS Veterinary Academy, Bio-medical Sciences, Veterinary Medicine – 12 B) (30 10 2008–29 09 2010).
Veterinary Science Council:
Chaiman – Assoc. Prof. Dr. Judita ŽYMANTIENö (LUHS Veterinary academy, Biomedical sciences, Veterinary medicine – 12 B).
Members: Prof. habil. dr. Gražina JUODEIKIENö (Kaunas University of Technology, Technology Sciences, Chemical engineering – 05 T);
Prof. dr. Algimantas PAULAUSKAS (Vytautas Magnus University, Biomedical Sciences, Biology – 01 B);
Dr. Modestas RUŽAUSKAS (LUHS Veterinary academy Veterinary institute, Biomedical sciences, Veterinary medicine – 12 B);
Dr. Arūnas STANKEVIČIUS (LUHS Veterinary academy, Biomedical sciences, Veterinary medicine – 12 B).
Opponents: Prof. dr. Jūrat÷ ŠIUGŽDAITö (LUHS Veterinary academy, Biomedical sciences, Veterinary medicine – 12 B);
Dr. Nomeda KUISIENö (Vilnius University, Biomedical sciences, Bio-logy – 01 B).
Public defence of doctoral dissertation in Veterinary Science Council will take place at the Lithuanian University of Health Sciences, Veterinary Academy Dr. S. Jankauskas auditorium at 2 p.m. on 26th of November, 2010. Address: Tilž÷s str. 18, LT-47181 Kaunas, Lithuania.
The summary of doctoral dissertation has been sent on 26th of October, 2010 according to the confirmed address list.
The doctoral dissertation is available at the library of the LUHS Veteri-nary Academy.
ĮŽANGA
Campylobacter jejuni yra labiausiai pasaulyje paplitusi, žmonių žarnyno infekciją sukelianti patogenin÷ bakterija. Žmon÷ms, užsikr÷tusiems šia bak-terija, pasireiškia virškinimo trakto infekcija, vadinama kampilobakterioze, kampilobakteriniu enteritu arba gastroenteritu. Iš visų kampilobakteriozę galinčių sukelti Campylobacter spp. rūšių šiuo metu labiausiai paplitę dvi: Campylobacter jejuni ir Campylobacter coli (Lastovica et al., 2006). Pasta-raisiais metais ekonomiškai išsivyščiusiose šalyse Campylobacter infekcija turi did÷jimo tendenciją, kurios priežastys n÷ra gerai žinomos. Europos maisto saugos tarnybos duomenimis 2008 metais kampilobakterioz÷ buvo dažniausiai nustatoma zoonoz÷ Europoje. Lietuvoje šis susirgimas yra antro-je vietoantro-je po salmonelioz÷s (EFSA, 2010). Infekcijai jautriausi vaikai iki 5 metų ir vyresni kaip 70 metų žmon÷s. Jie užsikrečia lengviau ir serga sun-kiau. Taip pat šiose amžiaus grup÷se dažnesni mirties atvejai (Mortensen et al., 2009). Infekcin÷ doz÷, priklausomai nuo bakterijos rūšies, šeimininko atsparumo ir nuo to, kiek organizmą yra paveikusi aplinka, gali būti nuo 500 iki 1000 ląstelių (Gillespie et al., 2006).
C. jejuni plačiai paplitusi aplinkoje. Taip pat kampilobakterijos dideliais kiekiais nustatomos šiltakraujų gyvūnų virškinimo trakte, kurie yra kampi-lobakterijų nešiotojai (Newell and Fearnley, 2003). Žmon÷s kampilobakte-rioze gali užsikr÷sti dviem būdais, t.y. tiesioginio kontakto metu nuo jas nešiojančių gyvūnų bei alimentiniu keliu. Dažniausiai kampilobakterioze užsikrečiama per nepakankamai termiškai apdorotus, netinkamomis sąly-gomis laikomus maisto produktus, ypač per paukštieną (vištieną, kalakutie-ną ir antiekalakutie-ną), rečiau per jautiekalakutie-ną, kiauliekalakutie-ną ir aviekalakutie-ną (Tam et al., 2009). Šių patogenų rezervuaras yra geriamas vanduo bei aplinkos (upių, upelių, ežerų ir t.t.) vanduo. Taip pat Campylobacter spp. bakterijomis užsikrečiama per šviežią pieną (Altekruse et al., 1999). Liga dažniausiai pasireiškia kaip spo-radiniai atvejai, tuo tarpu kampilobakterioz÷s protrūkiai nustatomi labai re-tai. Sporadinius atvejus dažniausiai sukelia kampilobakterijomis užkr÷sta m÷sa bei kiti maisto produktai. Protrūkiai pasireiškia, kai maistui naudoja-mas nepasterizuotas pienas arba užsikr÷tus šiomis bakterijomis per užkr÷stą geriamąjį vandenį (Heuvelink et al., 2009).
Kadangi pasaulyje daugiausia žmonių kampilobakterioz÷s atvejų yra sie-jami su kampilobakterijomis užkr÷stos paukštienos produktų vartojimu, tai siekiant sumažinti žmonių susirgimų kampilobakterioze riziką, didžiausias d÷mesys skiriamas šių bakterijų plitimo kontrolei broilerių m÷sos gamybos grandin÷je, pradedant nuo jų auginimo iki galutinio produkto prekyboje (Hansson et al., 2007; Hofshagen and Kruse, 2005; Rosenquist et al., 2009).
Europos maisto saugos tarnybos duomenimis, skirtingose šalyse
Campy-lobacter spp. paplitimas broilerių pulkuose svyruoja nuo 6,5% Suomijoje iki 79,0% Lenkijoje (EFSA, 2010). Kampilobakterijų paplitimas broilerių pul-kuose daugiausiai priklauso nuo zootechninių ir higieninių sąlygų paukšty-nuose (Newell and Fearnley, 2003). Paukštynų aplinka yra vienas svarbiau-sių veiksnių, lemiančių C. jejuni plitimą tarp skirtingų broilerių pulkų paukštynuose, ypač tuomet, kai nesilaikoma griežtų bioapsaugos bei higie-nos taisyklių (Hiett et al., 2002). Nustatyta, kad atskiruose paukštynuose egzistuoja pastovūs C. jejuni šaltiniai, galimai lemiantys broilerių koloniza-ciją specifin÷mis, ypač prisitaikiusiomis C. jejuni paderm÷mis, tod÷l šių šaltinių identifikavimas ir pašalinimas ypatingai svarbus siekiant kontroliuo-ti tolimesnį tokių kampilobakterijų plikontroliuo-timą broilerių m÷sos gamybos metu (Petersen and Wedderkopp, 2001).
Užkr÷stų kampilobakterijomis broilerių virškinimo trakte nustatomi labai dideli (>107 ksv/g-1 išmatų) C. jejuni kiekiai (Mead et al., 1995). Broilerių skerdimo metu, ypač jei pažeidžiamas skerdžiamų broilerių žarnynas žarnų šalinimo proceso metu, bakterijos patenka į aplinką, t.y. ant skerdimo įran-gos bei į plikinimo vandenį (Allen et al., 2007). Kryžminis užsikr÷timas, kai C. jejuni iš broilerių išmatų ir skerdyklos aplinkos patenka ant skerdžiamų broilerių skerdenų, yra svarbiausias galutinių broilerių m÷sos produktų užsi-kr÷timo kelias skerdykloje. Skerdimo metu C. jejuni bakterijos yra veikia-mos daugelio nepalankių aplinkos veiksnių, kaip žema ir aukšta temperatū-ros, osmosinis sl÷gis bei deguonis. Tam, kad pasiektų naują šeimininką, C. jejuni turi būti atspari šiems nepalankiems aplinkos veiksniams (Newell, 2002). Pasteb÷ta, kad iš visų iš paukštyno patekusių C. jejuni padermių dalis jų išgyvena geriau ir didesni jų kiekiai nustatomi galutiniuose produktuose skerdimo proceso pabaigoje (Klein et al., 2007; Newell et al., 2001; Takaha-shi et al., 2006). Iki šiol n÷ra pakankamai ištirta, kas lemia šių C. jejuni pa-dermių geresnį išgyvenimą, tačiau manoma, kad joms būdingas geriau išsi-vystęs prisitaikymo aplinkoje mechanizmas bei intensyvi specifinių genų raiška veikiant tam tikroms sąlygoms aplinkoje.
Įvertinus turimas žinias, akivaizdu, kad siekiant efektyviai kontroliuoti C. jejuni plitimą broilerių m÷sos gamybos grandin÷je labai svarbu nustatyti labiausiai paplitusias C. jejuni padermes broileriuose šalies lygiu, įvertinti veiksnius, lemiančius jų plitimą skerdimo metu, bei ištirti savybes, lemian-čias tam tikrų C. jejuni padermių išgyvenimą veikiant nepalankiems aplin-kos veiksniams broilerių gamybos proceso metu.
Tyrimo tikslas
Nustatyti Campylobacter spp. paplitimą ir C. jejuni genetinę įvairovę broilerių pulkuose bei įvertinti veiksnius, susijusius su C. jejuni plitimu bei išgyvenimu broilerių m÷sos gamybos grandin÷je Lietuvoje.
Uždaviniai:
1. Nustatyti Campylobacter spp. paplitimą broilerių pulkuose.
2. Ištirti C. jejuni genetinę įvairovę broileriuose ir nustatyti galimai iš-liekančias C. jejuni padermes.
3. Ištirti C. jejuni genotipų pokyčius broilerių m÷sos gamybos grandin÷-je ir nustatyti galimus broilerių m÷sos užsikr÷timo šaltinius skerdyklograndin÷-je.
4. Įvertinti skirtingų C. jejuni padermių prisitaikymą prie stresinių veiksnių, jas veikiančių broilerių m÷sos gamybos grandin÷je.
5. Įvertinti C. jejuni padermių, išskirtų tam tikruose broilerių m÷sos ga-mybos taškuose, fenotipinių ir genotipinių savybių tarpusavio ryšį.
Darbo naujumas ir praktin÷ reikšm÷
Lietuvoje iki šiol buvo labai mažai duomenų apie kampilobakterijų pa-plitimą broileriuose ir C. jejuni populiacijos ypatumus šalies lygiu. Atliktų tyrimų metu buvo įvertinti broileriai, kaip žmonių kampilobakterioz÷s užsi-kr÷timo šaltinis Lietuvoje, ir nustatyti veiksniai, turintys Campylobacter spp. plitimui broilerių m÷sos gamybos grandin÷s pradiniame etape. C. jejuni genetin÷s įvairov÷s tyrimui pirmą kartą buvo pritaikyti nauji fermentai, BglII ir BspDI, genotipuojant Amplifikuotų fragmentų ilgio polimorfizmo metodu (AFIP).
Daugelio ankstesnių tyrimų metu, kuomet buvo siekiama nustatyti kam-pilobakterijų plitimo kelius skerdykloje, nebuvo imami m÷giniai iš skerdyk-los aplinkos po dezinfekcijos, tod÷l šiame etape esančių C. jejuni bakterijų reikšm÷ broilerių m÷sos užsikr÷timui nebuvo pakankamai įvertinta. Siekiant įvertinti šio ir kitų šaltinių reikšmę kampilobakterijų plitimui buvo tiriamas broilerių pulkas nuo jo auginimo pradžios iki galutinio produkto skerdyklo-je. Taip pat šiame darbe, mūsų žiniomis, pirmą kartą buvo atlikta išsami, iš skirtingų taškų broilerių m÷sos gamybos metu išskirtų C. jejuni padermių genetinių ir fenotipinių savybių analiz÷ bei jų tarpusavio ryšio tyrimas. Šio tyrimo metu įgyta daugiau žinių apie C. jejuni išgyvenimo mechanizmą ap-linkoje bei nustatyti genai, galintys tur÷ti įtakos C. jejuni išgyvenimui tam tikrose sąlygose veikiančiose broilerių m÷sos gamybos proceso metu.
MEDŽIAGOS IR METODAI
Tyrimai buvo atlikti keturiais etapais. Pirmiausia buvo tiriamas Campy-lobacter spp. paplitimas broilerių pulkuose Lietuvoje. Kito etapo metu buvo tiriama genetin÷ iš broilerių išskirtų C. jejuni įvairov÷ tiek vieno paukštyno, tiek šalies lygmenyje. Trečio etapo metu vienas broilerių pulkas buvo tiria-mas nuo jo auginimo pradžios iki galutinio produkto skerdykloje siekiant
išsiaiškinti broilerių m÷sos užsikr÷timo šaltinius C. jejuni bakterijomis. Pas-kutinio etapo metu buvo tiriamos genetin÷s ir fenotipin÷s C. jejuni pader-mių, išskirtų iš broilerių pulko tam tikruose broilerių m÷sos gamybos taš-kuose, savyb÷s.
1. Kampilobakterijų paplitimo broilerių pulkuose tyrimo metodai 1.1. Tyrimo planas. Šio tyrimo metu ištirti 42 broilerių pulkai 9 paukš-tynuose (A-I), apimančiuose apie 70% broilerių produkcijos Lietuvoje. Kiekviename iš tiriamų paukštynų broilerių kloakos m÷giniai buvo imami tiek šiltuoju (balandžio-spalio m÷n.), tiek šaltuoju metų laikotarpiu (lapkri-čio-kovo m÷n.). M÷ginių skaičius, reikalingas nustatyti kampilobakterijų paplitimą broilerių pulkuose, buvo apskaičiuotas WinEpiscope 2.0 programa (Blas et al., 1998). Iš kiekvieno broilerių pulko buvo tiriama 10 broilerių kloakos m÷ginių (PI=97,5%). Išskyrus kampilobakterijas nors iš vieno kloa-kos m÷ginio, broilerių pulkas buvo laikomas užkr÷stu. Visuose paukštynuo-se pagal paukštynuo-septynis rizikos veiksnius, turinčius įtakos kampilobakterijų pliti-mui tarp pulkų, balais buvo vertinamas bioapsaugos bei higienos lygis paukštyne. Esant 6-7 balų vertinimui paukštyne buvo nustatomas aukštas, 4-5 balų - vidutinis ir <4 balų - žemas bioapsaugos lygis.
1.2. Kampilobakterijų išskyrimas ir identifikavimas mikrobiologi-niais tyrimo metodais atliktas naudojant selektyvias C. jejuni išskyrimo terpes. Atliekant tiesioginį kampilobakterijų išskyrimą buvo naudojamas mCCDA agaras. Šiuo metodu bakterijos buvo inkubuojamos mikroaerobi-n÷mis sąlygomis 48 val. 37ºC temperatūroje. Atliekant kampilobakterijų pagausinimą, buvo naudojamas Bolton sultinys, kuriame bakterijos inkubuo-tos 24 val. 42ºC temperatūroje. Po pagausinimo atliktas pers÷jimas ant mCCDA agaro ir inkubuojama tokiomis pačiomis sąlygomis kaip ir tiesio-ginio išskyrimo metu.
Pradinis Campylobacter spp. identifikavimas atliktas pagal išaugusių kultūrų kolonijas bei stebint bakterijų judrumą mikroskopu. Iš kiekvieno m÷ginio pasirinktos 3-5 kolonijos buvo pers÷jamos ant Kraujo agaro Nr. 2 ir inkubuojamos 48 val. 37ºC temperatūroje. Išskirtos grynos bakterijų kultū-ros buvo patalpintos į specialią terpę ir saugomos -80ºC temperatūroje.
1.3. DNR išskyrimas atliktas iš šviežių 48 val. bakterijų kultūrų naudo-jant specialų GenEluteTM Bacterial Genomic DNA rinkinį pagal gamintojų instrukcijas.
1.4. Kampilobakterijų identifikavimas iki rūšies Polimeraz÷s gran-dinin÷s reakcijos (PGR) metodu atliktas pagal Wang et al. (2002) metodi-ką su nedideliais pakeitimais. 23SF ir 23SR pradmenys buvo skirti Campy-lobacter genties identifikavimui. CJF ir CJR - C. jejuni ir CCF ir CCR - C. coli identifikavimui.
2. C. jejuni genetin÷s įvairov÷s broileriuose tyrimo metodai
2.2. Tyrimo planas. Šio tyrimo metu pasirinkti 114 C. jejuni izoliatų, iš-skirtų iš paukštyno A, buvo naudojami ištirti bakterijų genetinę įvairovę viename paukštyne ir 76 C. jejuni, išskirti iš paukštynų B-G, buvo naudoja-mi ištirti bakterijų genetinę įvairovę šalies lygmenyje.
2.3. C. jejuni genotipavimas atliktas Amplifikuotų fragmentų ilgio po-limorfizmo metodu (AFIP), naudojant BglII ir BspDI fermentus pagal Boje-sen et al. (2003) metodiką su nedideliais pakeitimais. Tyrimo metu gautų fragmentų atskyrimas atliktas poliakrilamidiniame gelyje, naudojant ABI PRISMTM 377 DNA automatinį sekvenatorių. Duomenų analiz÷ atlikta Ge-neScan 3.1 ir GelCompar II programomis.
3. C. jejuni bakterijų genotipų pokyčių broilerių pulke m÷sos gamy-bos proceso metu tyrimo metodai
3.1. M÷ginių rinkimas atliktas viename broilerių pulke nuo jų auginimo pradžios paukštyne iki galutinio produkto skerdykloje. M÷giniai iš broilerių kloakų ir aplinkos (grindys, oras, sienos, vanduo, girdyklos ir kt.) paukštyne buvo imami jiems esant 1, 15, 24 ir 35 dienų amžiaus. Paukštyne iš viso buvo paimti 232 m÷giniai, iš jų 184 iš broilerių kloakų ir 48 iš aplinkos.
Skerdykloje broilerių m÷giniai buvo imami iš pakabintų broilerių kloakų skerdimo linijos pradžioje, broilerių kaklų po plunksnų pešimo, žarnų paša-linimo ir atv÷sinimo ir broilerių fil÷ prieš pakavimą, skerdimo linijos pabai-goje. Šie m÷giniai buvo imami tris kartus, t.y. per pirmas 3, 4-6 ir 7-8 sker-dimo valandas. M÷giniai iš skerdyklos aplinkos (grindų, skersker-dimo įrangos, skerdyklos oro, kabyklos ir kt.) buvo renkami prieš skerdimą, po dezinfekci-jos, 4-6 ir 7-8 skerdimo valandas. Skerdykloje viso buvo paimta 100 m÷gi-nių (30 broilerių kloakų, 30 kaklo odos, 10 broilerių fil÷ ir 30 aplinkos m÷-ginių).
3.2. Kampilobakterijų išskyrimas ir identifikavimas atliktas kaip aprašyta 1.2-1.4 skyriuose.
3.3. C. jejuni genotipavimas atliktas Restrikcijos fragmentų ilgio poli-morfizmo metodu (PGR-RFIP) pagal flaA geną, naudojant DdeI fermentą (Harrington et al., 2003).
4. C. jejuni padermių, išskirtų iš paukštienos gamybos grandin÷s, genetinių ir fenotipinių savybių tyrimo metodai
4.1. Tyrimui naudotos C. jejuni paderm÷s. Šiam tyrimui pasirinktos 12 C. jejuni padermių, iš kurių 10 (S164, S266, S283, S330, S348, S349, S351, S353, S382, S400) išskirtos iš skirtingų šaltinių vieno broilerių pulko augi-nimo bei skerdimo proceso metu (1 lentel÷), ir dvi kontrolin÷s (F508, 140), išskirtos iš broilerių kloakų skirtinguose paukštynuose per vienerius metus ir žmogaus, užsikr÷tusio kampilobakterijomis, vartojant paukštieną.
1 lentel÷. Tirtos C. jejuni paderm÷s
Išskyrimo šaltinis Paderm÷ Skerdyklos aplinka po dezinfekcijos S330; S382; S266 Broilerių fil÷ S283; S400; S353; S351;
S349; S348;
Broilerių kloaka S164
Kontrolin÷s H140; F508
4.2. C. jejuni padermių fenotipinių savybių tyrimas. C. jejuni išgyve-nimas žemoje (5ºC ir -18ºC), aplinkos (20oC) ir aukštoje (48oC) temperatū-rose tirtas naudojant sterilias viščiuko sultis pagamintas pagal Birk et al. (2004) metodiką. Šio tyrimo metu stacionarios augimo faz÷s bakterijų kultū-ros (OD600=0.2) buvo patalpintos į viščiuko sultis santykiu 1:10 ir
inkubuo-tos 35 dienoms -18ºC, 30 dienų - 5ºC, ir 18 dienų - 20ºC. Tyrimas 48ºC temperatūroje atliktas pagal Birk et al. (2004) aprašytą metodiką. Gyvybin-gų bakterijų skaičius kiekvienoje temperatūroje buvo nustatytas kolonijų skaičiavimo metodu kas 5 dienas -18ºC temperatūroje, kas 3 dienas - 5 ir 20ºC temperatūrose ir kas 30 min - 48ºC temperatūroje. Su kiekviena pa-derme tyrimas atliktas bent du kartus.
Geb÷jimo sudaryti biopl÷veles tyrimas atliktas pagal Reeser et al. (2007) metodiką su nedideliais pakeitimais. Biopl÷velių tyrimui buvo naudojama iš poliesterio pagaminta 24 šulin÷lių mikrol÷kštel÷. Stacionarios augimo faz÷s bakterijų kultūros (OD600=0.25) buvo patalpintos į mikrol÷kštel÷s šulin÷lį su
Mueller Hinton terpe ir inkubuojamos 37ºC temperatūroje 24, 48 ir 72 val. Susidariusios biopl÷vel÷s buvo dažomos kristal-violeto dažais. C. jejuni padermių geb÷jimas sudaryti biopl÷veles buvo nustatomas spektrofotometru prie 540 nm (A540) bangos pagal šių dažų kiekį, ištirpusį 80% etanolio-20% acetono mišinyje. Su kiekviena paderme tyrimas atliktas tris kartus.
4.2. C. jejuni padermių genetinių savybių tyrimas atliktas Daugiažidi-niniu sekų nustatymo metodu (angl. MLST) (Dingle et al., 2001) bei DNR mikrogardelių metodu (Champion et al., 2005).
4.3. Statistin÷ duomenų analiz÷ atlikta SPSS 9.0 paketu, naudojant ANOVA, LSD bei Bonfferoni metodus.
REZULTATAI IR DISKUSIJA
1. Kampilobakterijų paplitimas broilerių pulkuose.
Įvertinus bioapsaugos bei higienos lygį (BHL) paukštynuose pagal mūsų nustatytus kriterijus, šešiuose iš jų nustatytas žemas BHL, viename - viduti-nis ir dvejuose - aukštas BHL (2 lentel÷).
2 lentel÷. Bioapsaugos ir higienos lygis paukštynuose Rizikos veiksniai P au k št y n as A v al y n ÷s d ez in fe k ci ja A v al y n ÷s k ei ti m as R an k ų p lo v im as P er si re n g im o p at al p a T ar p as t ar p p u lk ų K at ÷s , šu n y s te ri to ri jo je P au k šč ių p at ek im as į p au k št id ę Įv er ti n im a s b a la is A - - - + <14 + + 1 - žemas B + + + + ≥14 - - 7 - aukštas C - - - + ≤14 - - 3 - žemas D - - - + ≥14 - - 4 - vidutinis E + + + + ≥14 + - 6 - aukštas F + - - - ≥14 + - 3 - žemas G + - - - ≥14 + - 3 - žemas H - - - - <14 + - 1 - žemas I - - - - <14 + - 1 - žemas
Ištyrus Campylobacter spp. paplitimą 42 broilerių pulkuose, vienerių metų b÷gyje, 32 iš jų (80,95%) buvo užkr÷sti kampilobakterijomis. Dau-giausiai kampilobakterijomis užkr÷stų pulkų (100%) buvo nustatyta paukš-tynuose A, G, B ir C ir tik dviejuose paukšpaukš-tynuose n÷ viename iš tirtų pulkų kampilobakterijos nebuvo nustatytos. Detalūs duomenys apie kampilobakte-rijų bei jų rūšių paplitimą pateikiami 3 lentel÷je. Nepaisant to, kad paukšty-nuose B ir E buvo nustatytas aukštas BHL lygis, juose taip pat kaip ir paukš-tynuose, pasižyminčiuose žemu BHL lygiu, buvo nustatytas didelis 100 ir 83% kampilobakterijų paplitimas broilerių pulkuose. Tai gal÷jo įtakoti kiti veiksniai, kurie nebuvo vertinami šio tyrimo metu, taip pat turintys įtakos kampilobakterijų plitimui paukštynuose, kaip vandens užkr÷stumas šiomis bakterijomis, paukščių ektoparazitai bei graužikų ir musių buvimas paukšti-d÷s (Hald et al., 2007; Hazeleger et al., 2008).
Remiantis literatūros duomenimis, paukštynuose H ir I, pasižyminčiuose žemu BHL lygiu, kampilobakterijos gal÷jo būti nenustatytos d÷l to, kad šio paukštyno teritorijoje buvo tik dvi paukštid÷s, tai žymiai sumažina kampilo-bakterijų plitimo tarp skirtingų pulkų riziką, net jeigu paukštyne ir n÷ra lai-komasi griežtų bioapsaugos bei higienos taisyklių (Refregier-Petton et al., 2001).
3 lentel÷. Campylobacter spp. paplitimas broilerių pulkuose, skirtin-guose paukštynuose (A-I)
Campylobacter spp. C. jejuni C. coli Paukštynas Paplitimas pulke (%) A 100 100 57 B 100 71 86 C 100 100 50 D 60 60 20 E 83 83 17 F 80 80 - G 100 50 100 H - - - I - - -
2. C. jejuni genetin÷ įvairov÷ broileriuose
Ištyrę 190 C. jejuni izoliatų išskirtų iš broilerių kloakų septyniuose paukštynuose (A-G), nustatyta 50 AFIP genotipų. Daugiausia genotipų, iš viso 28, buvo nustatyta paukštyne A, kuriame buvo tirti visi 114 C. jejuni izoliatai, išskirti iš šio paukštyno per metus. Likusieji 22 genotipai nustatyti tarp atrinktų 76 C. jejuni izoliatų, išskirtų iš broilerių, paukštynuose A-F (4 lentel÷).
Kiekviename paukštyne buvo nustatyta nuo 1 iki 3 C. jejuni genotipų, randamų daugiau nei viename broilerių pulke. To paties genotipo aptikimas skirtinguose broilerių pulkuose tame pačiame paukštyne parodo, kad tam tikru būdu kampilobakterijos yra pernešamos iš vieno pulko į kitą, arba tai, kad paukštyne yra bendras užsikr÷timo šiomis bakterijomis šaltinis (Peter-sen and Wedderkopp, 2001). Nuo 1 iki 5 papildomų genotipų, kuriems buvo priskirti pavieniai C. jejuni izoliatai, buvo nustatyta paukštynuose B-G, ir tik paukštyne A buvo nustatyti net 24 papildomi C. jejuni genotipai. Didesn÷ C. jejuni genetin÷ įvairov÷, t.y. 43 genotipai, buvo nustatyta šiltuoju metų lai-kotarpiu, negu šaltuoju metų lailai-kotarpiu, kuomet buvo nustatyta 10 C. jejuni genotipų (4 lentel÷). Didel÷ C. jejuni įvairov÷ paukštyne A buvo nustatyta d÷l dviejų priežasčių: pirma - buvo tiriami visi per metus tirti m÷giniai ir iki 5 C. jejuni izoliatų išskirtų iš vieno broilerio, kai tuo metu iš kitų paukštynų iš vieno pulko buvo tiriami tik 1-2 m÷giniai, imant tik vieną izoliatą iš kiek-vieno m÷ginio, ir antra - tam įtakos taip pat gal÷jo tur÷ti žemas BHL šiame paukštyne. Ypač tai akivaizdžiai matyti šiltuoju metų laikotarpiu, kuomet yra palankesn÷s sąlygos kampilobakterijų išgyvenimui bei didesn÷ užsikr÷-timo šaltinių kampilobakterijomis paukštyno bei paukštidžių aplinkoje įvai-rov÷ (Johnsen et al., 2006). AFIP genotipas A32 buvo nustatytas net
pen-kiuose skirtinguose paukštynuose, esančiuose skirtingose geografin÷se vie-tov÷se per vienerius metus. Tokių išliekančių genotipų nustatymas šalies lygmenyje parodo arba esantį bendrą užsikr÷timo kampilobakterijomis tarp skirtingų paukštynų šaltinį , arba šis C. jejuni klonas gali pasižym÷ti ypatin-gu prisitaikymu aplinkoje bei broilerių m÷sos gamybos proceso metu ir to-kiu būdu tur÷ti daugiau šansų nuolat pasiekti vartotojus (Manning et al., 2001).
4 lentel÷. 50-ies C. jejuni AFIP genotipų pasiskirstymas skirtinguose paukštynuose
Genotipų sk. nustatytų
>1 broilerių pulke Pavienių genotipų sk. Paukštynas
(Tirtų
izoliatų sk.) Šaltas metų laikotarpis Šiltas metų laikotarpis Šaltas metų laikotarpis Šiltas metų laikotarpis A (114) 1 3 2 22 B (12) 1 1 1 2 C (16) 1 - - 5 D (9) 2 - 2 1 E (19) 1 2 - 3 F (16) - 1 1 1 G (4) - - - 2
3. C. jejuni bakterijų genotipų pokyčiai broilerių pulke m÷sos gamy-bos proceso metu Ištyrę pasirinkto pulko broilerius paukštyne jų auginimo metu, kampilo-bakterijos buvo nustatytos jiems esant 35 dienų amžiaus. Iš viso 93,3% tirtų broilerių m÷ginių šiuo metu buvo užkr÷sti kampilobakterijomis. Taip pat Campylobacter spp. buvo nustatytos 1 iš 48 aplinkos m÷ginių, tirtų šiuo laikotarpiu. Campylobacter spp. buvo išskirtos iš visų broilerių kloakos ir broilerių fil÷ m÷ginių bei vieno broilerių kaklo m÷ginio skerdimo metu. Ištyrus sker-dyklos aplinką, prieš dezinfekciją, Campylobacter spp. buvo išskirtos iš 66,6% tirtų aplinkos m÷ginių, o skerdimo proceso metu jos buvo išskirtos iš 30,77% tirtų aplinkos m÷ginių. Nepakankamai efektyvus valymas gal÷jo tur÷ti įtakos kampilobakterijų išlikimui aplinkoje, ypač turint omenyje, kad ant skerdimo įrangos paviršių, ant grindų bei plikinimo vandenyje buvo ma-tomi skerdenų likučiai (plunksnos, smulkūs žarnyno likučiai), kurie gal÷jo sudaryti palankią terpę kampilobakterijų išgyvenimui aplinkoje. 5 lentel÷. C. jejuni izoliatų, išskirtų iš vieno broilerių pulko paukšty-ne ir skerdykloje, pasiskirstymas atsižvelgiant į jų genotipavimo rezul-tatus PGR-RFIP metodu pagal flaA geną flaA genotipai Išskyrimo šaltinis I II III IV V VI VII VIII IX X Paukštyne Broileriai - - - 93 - - - - Grindys - - - 1 - - - - Skerdykloje a 0-3 val. Broileriai - - - 49 - - - - Grindys 1 - - - 4 - Transporteris - - - 2 3 - Pjaustymo m. - - - 4 - Žarnų š. m. - - - 10 - Kabykla - - - 8 - Vanduo - - - 1 - Pešimo m. - - - 5 - Fil÷ 13 2 - - - - 4-6 val. Broileriai - - - 47 - - - - Kaklo oda - 2 - - - - Kabykla - - - 5 - - - - Vanduo - - - 4 - - - - Fil÷ 10 - - - 2 - 7-8 val. Broileriai - - - 49 - - - - Oras - - - 3 - - - - Kabykla - - - 5 - - - - Vanduo - - - 5 - - - - Fil÷ - 3 4 2 1 1 1 - 4 1 Viso 24 7 4 2 1 262 1 2 41 1 a
šiuo periodu m÷giniai iš skerdyklos aplinkos buvo imami po dezinfek-cijos/prieš skerdimą
Taip pat kampilobakterijos aplinkoje gal÷jo išlikti ir tuo atveju, jeigu at-liekant dezinfekciją buvo naudojama netinkama dezinfekcinių medžiagų koncentracija (Peyrat et al., 2008). Tačiau žinant tai, kad kampilobakterijos
paprastai yra ypač jautrios stresiniams veiksniams (aplinkos temperatūra, deguonies bei maisto medžiagų trūkumas), veikiantiems skerdyklos aplinko-je, abiem atvejais gyvybingos C. jejuni bakterijos gal÷jo išlikti tik tuo atve-ju, jeigu jos pasižymi specifiniu prisitaikymu prie aplinkos, kaip biopl÷velių sudarymas, per÷jimas į gyvybingą, bet nekultivuojamą stadiją arba tam tikrų genų raiška stresin÷mis sąlygomis (Murphy et al., 2006; Park, 2002).
Atlikus 345 C. jejuni izoliatų identifikuotų tiriamajame broilerių pulke, genotipavimą buvo nustatyta 10 flaA genotipų (I-X). Tik vienas genotipas (VI) buvo nustatytas tarp C. jejuni izoliatų išskirtų iš broilerių kloakų, tirtų jų auginimo metu bei skerdyklos linijos pradžioje. Šis genotipas v÷liau taip pat buvo nustatytas skerdyklos aplinkoje skerdimo proceso metu bei viena-me broilerių fil÷ m÷ginyje (5 lentel÷).
Skerdyklos aplinkoje po dezinfekcijos iš viso buvo nustatyti trys flaA genotipai (I, VIII, IX). Šie genotipai nebuvo nustatyti skerdyklos aplinkoje skerdimo metu, tačiau du iš jų (I, IX) buvo dominuojantys broilerių fil÷ m÷-giniuose, tirtuose skerdimo proceso pabaigoje. Genotipas I buvo nustatytas 23 (52,3%), o genotipas IX šešiuose (13.6%) iš visų 44 C. jejuni izoliatų išskirtų iš broilerių fil÷. Likusieji 15 C. jejuni izoliatų, išskirtų iš broilerių fil÷, buvo priskirti genotipui II, kuris buvo taip pat nustatytas broilerių kaklo odos m÷ginyje, bei genotipams III, IV, VII, V ir X, kurie prieš tai nebuvo aptikti nei paukštyne, nei skerdimo proceso metu (5 lentel÷).
4. C. jejuni padermių, išskirtų iš paukštienos gamybos grandin÷s, genetinių ir fenotipinių savybių tyrimas.
Ištyrus 12 C. jejuni padermių išgyvenimą skirtingose temperatūrose bu-vo nustatyta, kad broilerių fil÷ paderm÷s geriau nei podezinfekcin÷s pader-m÷s išgyveno 5ºC (P=0,03) ir 48ºC (P=0,004) temperatūrose, geriau nei broilerių kloakos paderm÷s išgyveno 48ºC (P = 0,007) temperatūroje ir ge-riau nei klinikin÷ paderm÷ išgyveno -18ºC (P=0,023) temperatūroje. Tuo tarpu broilerių kloakos ir klinikin÷ paderm÷s geriau nei broilerių fil÷ ir po-dezinfekcin÷s paderm÷s išgyveno 20ºC (p<0,05) temperatūroje. Skirtingų C. jejuni padermių gyvybingų bakterijų skaičius kiekvienoje iš tirtų temperatū-rų eksperimento pabaigoje pateiktas 6 lentel÷je.
Iš visų tirtų C. jejuni padermių 5 broilerių fil÷ paderm÷s (S353, S351, S349, S283, S400) sudar÷ biopl÷veles ir tik viena jų (S348) nesudar÷ biop-l÷velių n÷ vienu iš tirtų laiko periodų (1 paveikslas). Po 24 val. intensyviau-siai biopl÷veles sudar÷ podezinfekcin÷s paderm÷s S382 ir S266 (P<0,05), po 48 val.- klinikin÷ C. jejuni paderm÷ (P<0,05), o po 72 val. - klinikin÷ bei broilerių kloakos paderm÷ (P<0,05), paplitusi paukštynuose Lietuvoje.
6 lentel÷. Tirtų C. jejuni padermių genotipai, išgyvenimas skirtingose temperatūrose ir geb÷jimas sudaryti biopl÷veles
Išgyvenimas (log10 KSV/ml) a Tirtos paderm÷s flaA tipas MLST sekų tipas -18°C +5°C +20°C +48°C S330 VIII 52 5,28 6,21 4,74 6,10 S382 IX 607 5,28 3,41 2,63 6,30 S266 I 607 5,85 3,83 2,22 5,49 S283 VII 607 5,38 6,30 3,86 6,91 S400 III 607 5,48 6,66 4,28 6,94 S353 V 607 5,67 4,80 3,40 6,45 S351 IV 607 5,19 4,65 3,78 6,67 S349 X 607 5,71 6,85 3,62 6,41 S348 II 45 5,94 5,48 4,03 6,00 S164 VI 51 5,81 7,28 3,60 5,75 F508 XI 21 4,85 4,70 5,57 5,20 H140 XII 122 4,91 5,85 5,25 5,88 a
gyvybingų bakterijų skaičius skirtingose temperatūrose, eksperimento pabaigoje
b
padermių geb÷jimas sudaryti biopl÷veles MH terp÷je, 37ºC temperatū-roje
Tai, kad C. jejuni izoliatai, išskirti iš skerdyklos aplinkos po dezinfekci-jos pasižym÷jo intensyviu biopl÷velių sudarymu per pirmas 24 inkubavimo valandas, paaiškina jų geb÷jimą išgyventi skerdyklos aplinkoje. Ant skerdi-mo įrangos paviršių, plikiniskerdi-mo vandenyje ar skerdenų likučių susidariusių biopl÷velių viduje esančios bakterijų ląstel÷s yra sunkiau pašalinamos bei yra geriau apsaugotos nuo medžiagų trūkumo, osmosinio sl÷gio bei deguo-nies poveikio ir tokiu būdu jos tampa svarbiu broilerių m÷sos užsikr÷timo kampilobakterijomis šaltiniu skerdykloje (Annous et al., 2009; Reeser et al., 2007). Skirtingai nei podezinfekcin÷s, C. jejuni sporadiškai išskirtos iš broi-lerių fil÷, nepasižym÷jo ypač intensyviu biopl÷velių sudarymu, tačiau d÷l geresnio išgyvenimo tiek žemoje, tiek aukštoje temperatūroje jos kelia riziką žmonių susirgimui kampilobakterijoze, kadangi d÷l šių savybių jos gali iš-gyventi atv÷sintuose broilerių m÷sos produktuose, bei tuomet, kai nesilai-koma terminio režimo jų apdorojimo metu (Chan et al., 2001).
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 H 1 4 0 S 1 6 4 S 2 6 6 S 2 8 3 S 3 3 0 S 3 4 8 S 3 4 9 S 3 5 1 S 3 5 3 S 3 8 2 S 4 0 0 F 5 0 8 K o n tr o l÷ Paderm÷ O D 5 4 0
24 val. 48 val. 72 val.
1 pav. C. jejuni padermių geb÷jimas sudaryti biopl÷veles MH terp÷-je, 37ºC temperatūroje po 24, 48 ir 72 val.
Ištyrus C. jejuni padermes Daugiažidininiu sekų nustatymo metodu (MLST), nustatyta, kad 5 iš 6 broilerių fil÷ padermių ir dvi podezinfekcin÷s paderm÷s buvo priskirtos tam pačiam sekų tipui ST-607 (6 lentel÷). Visos šios paderm÷s panašiai buvo sugrupuotos ir DNR mikrogardelių metodu. Be to, jos visos geb÷jo sudaryti biopl÷veles. Viena iš broilerių fil÷ padermių (S348) ir broilerių kloakos paderm÷, išskirta iš broilerių pulko (S164), buvo priskirtos skirtingiems MLST tipams, tačiau jos buvo sugrupuotos kartu DNR mikrogardelių metodu. Abi šios paderm÷s nesudar÷ biopl÷velių n÷ vienu tirtu periodu (24, 48 ir 72 val.). Trys C. jejuni paderm÷s, pasižym÷ju-sios geru išgyvenimu 20ºC temperatūroje, buvo priskirtos skirtingiems MLST sekų tipams (6 lentel÷) ir taip pat buvo tarpusavyje genetiškai nesusi-ję atlikus analizę DNR mikrogardelių metodu.
Palyginus C. jejuni padermių/grupių, pasižyminčių tam tikromis fenoti-pin÷mis savyb÷mis, genomus buvo nustatyti šioms padermių grup÷ms bū-dingi genai. Dvidešimt trys specifiniai genai nustatyti C. jejuni paderm÷je, išskirtoje iš broilerių kloakų skirtinguose paukštynuose per vienerius metus, 7 specifiniai genai nustatyti paderm÷se, pasižyminčiose geru išgyvenimu 20ºC temperatūroje, ir po 3 specifinius genus nustatyta paderm÷se, sudaran-čiose bei nesudaransudaran-čiose biopl÷velių.
IŠVADOS
1. Nustatytas didelis, t.y. 80,95%, Campylobacter spp. paplitimas broi-lerių pulkuose Lietuvoje. C. jejuni buvo nustatyta 73,8%, o C. coli 40,48% tirtų broilerių pulkų.
2. Nustatyta didel÷ C. jejuni genotipų įvairov÷ broilerių m÷giniuose, t.y. 50 skirtingų genotipų. Visuose paukštynuose nustatyti jiems būdingi C. je-juni genotipai. Didesn÷ C. jeje-juni įvairov÷ nustatyta šiltuoju metų laikotarpiu. Vienas C. jejuni genotipas (A32) aptiktas skirtinguose paukštynuose skirtin-gu metu per vienerius metus.
3. C. jejuni genotipai nustatyti skerdyklos aplinkoje po dezinfekcijos taip pat buvo dominuojantys ir ant broilerių fil÷ skerdimo proceso pabaigoje. Tokiu būdu buvo aiškiai parodyta, kad C. jejuni paderm÷s, išliekančios skerdyklos aplinkoje po dezinfekcijos yra svarbus broilerių m÷sos užsikr÷-timo šaltinis skerdykloje.
4. C. jejuni paderm÷s, išskirtos iš skerdyklos aplinkos, pasižym÷jo in-tensyviu biopl÷velių sudarymu. Broilerių fil÷ paderm÷s gerai išgyveno že-moje bei aukštoje temperatūroje bei sudar÷ biopl÷veles. Klinikin÷ bei Lietu-voje paplitusi C. jejuni paderm÷s pasižym÷jo geru išgyvenimu aplinkos temperatūroje.
5. Nustatytas ryšys tarp genetinių ir fenotipinių C. jejuni savybių. C. je-juni paderm÷s, išskirtos iš broilerių fil÷ bei skerdyklos aplinkos po dezinfek-cijos buvo genetiškai susiję ir geb÷jo sudaryti biopl÷veles. C. jejuni, išskirta iš broilerių kloakos, nesudar÷ biopl÷velių ir buvo genetiškai susijusi su viena iš broilerių fil÷ padermių, taip pat nesudarančia biopl÷velių.
REKOMENDACIJOS IR PASIŪLYMAI
1. Siekiant sumažinti žmonių susirgimų kampilobakterioze riziką varto-jant paukštienos produktus, turi būti stiprinamos tam tikros pastangos tiek iš broilerių m÷sos gamintojų, tiek iš veterinarinių ir už žmonių sveikatą atsa-kingų institucijų. Viena iš rekomenduojamų priemonių būtų nacionalinių programų, vykdančių Campylobacter spp. monitoringą bei stebinčių bioap-saugos priemonių užtikrinimą broilerių pulkuose, rengimas bei vartotojų žinių stiprinimas.
2. Skerdyklos aplinka yra potencialus broilerių m÷sos užsikr÷timo kam-pilobakterijomis šaltinis, tod÷l efektyvus skerdyklos aplinkos valymas bei dezinfekcija po skerdimo yra kritin÷s kontrol÷s priemon÷s, galinčios paša-linti gyvybingas bakterijas nuo skerdyklos įrangos paviršių.
3. C. jejuni prisitaikymas prie nepalankių aplinkos veiksnių, veikiančių skerdimo proceso metu, turi būti tiriamas toliau siekiant nustatyti efektyvias
kampilobakterijų kontrol÷s priemones paukštienos apdorojimo metu. 4. Tolimesni tyrimai, siekiantys išsiaiškinti genų, būdingų tam tikroms C. jejuni padermių grup÷ms, pasižyminčiomis specifin÷mis fenotipin÷mis savyb÷mis, funkciją pad÷tų geriau suprasti C. jejuni prisitaikymo aplinkoje mechanizmą.
5. Duomenys apie C. jejuni atsparumą antibiotikams, tam tikrų linijų paplitimą skirtinguose šaltiniuose ir žmon÷se tur÷tų būti reguliariai kaupia-mi. Šie duomenys būtų naudingi atliekant tolimesnius tyrimus identifikuo-jant potencialius žmonių užsikr÷timo kampilobakterioze šaltinius ir rizikos veiksnius Lietuvoje.
PASKELBTOS PUBLIKACIJOS
1. Kudirkien÷, E., Cohn, M.T., Stabler, R.A., Strong, P.C., Šernien÷, L., Wren, B.W., Nielsen, E.M., Brøndsted, L., Malakauskas, M., 2010. Ge-netic and phenotypic characterization of Campylobacter jejuni isolates rela-ted to the broiler meat production chain. (Rankraštis). Pateiktas publikavi-mui į “Applied and Environmental Microbiology” žurnalą.
2. Kudirkien÷, E., Bunevičien÷, J., Brøndsted, L., Ingmer, H., Olsen, J. E., Malakauskas, M., 2010. Evidence of broiler meat contamination with post-disinfection strains of C. jejuni from slaughterhouse. International Journal of Food Microbiology, doi:10.1016/j.ijfoodmicro.2010.06.024.
3. Kudirkien÷, E., Malakauskas, M., Malakauskas, A., Bojesen, A. M., Olsen. J. E., 2010. Demonstration of persistent strains of C. jejuni within broiler farms over one year period in Lithuania. Journal of Applied Micro-biology, 108: 868-877.
4. Kudirkien÷, E., Malakauskas, A., Šernien÷, L., Malakauskas, M., 2008. Isolation and identification of thermophilic Campylobacter spp. by PCR-RFLP in broiler flocks. Veterinarija ir Zootechnika. 42: 44-47.
DALYVAVIMAS KONFERENCIJOSE
Žodiniai pranešimai:
1. Kudirkien÷, E. “Discrimination of Campylobacter jejuni strains by rep-PCR method in comparison with AFLP analysis”. XI tarptautinis Lietu-vos biochemikų draugijos susitikimas “LBS 50”. 2010 m., Birželio 15-17 d., Lietuva.
2. Kudirkien÷, E. “The relationship between human campylobacteriosis and C. jejuni isolated along broiler meat chain”. 3-ioji Nacionalin÷ konfe-rencija: Mokslas - žmonių sveikatai. Kauno Medicinos Universitetas. 2010 m., Balandžio 7 d., Lietuva.
Stendiniai pranešimai:
1. Kudirkien÷, E., ir kt. “The survival properties of C. jejuni based on strain origin and phylogeny”. 22-as tarptautinis ICFMH Simpoziumas, FoodMicro2010. 2010 m., Rugpjūčio 30 d.-Rugs÷jo 3 d., Danija.
2. Kudirkien÷, E., ir kt. “Characterization of C. jejuni strains represen-ting broiler meat chain”. BIOTRACER EC apžvalginis ir 4-asis bendrasis susitikimas. Danijos Technikos Universitetas. 2010 m., Kovo 22-23 d., Da-nija.
3. Kudirkien÷, E., ir kt. “Discrimination of Campylobacter jejuni strains by rep- PCR method in comparison with AFLP analysis”. XIV ISAH Kongresas 2009. Vechtos Universitetas. 2009 m., Liepos 19-23 d., Vokieti-ja.
4. Kudirkien÷, E., ir kt. “AFLP genotyping of Campylobacter jejuni strains from broilers at flock, farm and country level”. Pirmasis tarptautinis maisto kontrol÷s tyrimų susitikimas. Helsinkio Universitetas. 2008 m., Spa-lio 15-17 d., Suomija.
RESUMÉ
Campylobacter spp. is widespread organisms in the environment and in-habits the gastrointestinal tract of various species of birds and animals. Campylobacter jejuni is a major food safety problem in the European coun-tries as well as in the developing world. In 2008, a total of 190 566 con-firmed human cases of campylobacteriosis was reported from 27 European Union countries, corresponding to an incidence of 40.7 per 100 000 of the population in EU. In Lithuania campylobacteriosis is second most prevalent foodborne zoonoses in humans with the incidence of 22.6 per 100 000 popu-lation (EFSA, 2010). The main source of human campylobacter infection is poultry meat (Tam et al., 2009), however untreated water and unpasteurized milk are important sources of infection as well (Altekruse et al., 1999).
Most of the world’s poultry production is colonized with campylobacters at farm before slaughter. However the prevalence of Campylobacter spp. in broiler flocks varies between different countries e.g., ranging from 6.5% in Finland to 79.0% in Poland (EFSA, 2010) and depends primarily on zoo-technical and hygienic measures at broiler farms (Newell and Fearnley, 2003). The external environment is considered significant for transmission of C. jejuni between broiler flocks, especially when strict hygiene and bio-security measures are not applied (Hiett et al., 2002). Certain niches for C. jejuni might be specific and constant on individual broiler farms, and might be of crucial importance for the colonization of broilers with persistent strains of C. jejuni (Petersen and Wedderkopp, 2001). However transmis-sion of predominant campylobacter strains from breeder hens is not well understood and could be a possibility (Bull et al., 2006).
During broiler colonization with C. jejuni a high numbers (>107 cfu/g-1 of faeces) of this bacterium are found in the intestine of poultry (Mead et al., 1995). When Campylobacter-positive broiler flocks are slaughtered, broiler meat may be contaminated with intestinal contents of broilers particularly at the evisceration step, if intestines are damaged (Allen et al., 2007). Cross-contamination from equipment and scalding water containing C. jejuni is considered the main route of broiler carcass contamination at slaughter-house. During slaughtering Campylobacter spp. are exposed to many envi-ronmental stresses such as low and high temperature, osmotic changes and atmospheric air and C. jejuni must survive these stresses in order to be suc-cessfully transmitted to new hosts (Newell, 2002).
The aim and objectives of the study
The aim of this study was to investigate Campylobacter spp. prevalence in broiler flocks in Lithuania and to determine aspects related to C. jejuni
transmission and survival in broiler meat production chain in Lithuania. To achieve this aim, the objectives were as follows:
1. To investigate the flock prevalence of Campylobacter spp. in broiler flocks in Lithuania.
2. To investigate genetic diversity of C. jejuni in broiler farms in Lithua-nia and to identify possible persistent strains of C. jejuni.
3. To examine the changes in appearance of C. jejuni genotypes along the broiler meat production chain and to identify potential sources of broiler meat contamination in slaughterhouse.
4. To investigate differences among C. jejuni strain in stress adaptation and the ability to form biofilm and survive at different temperatures relevant to the poultry meat production chain.
5. To investigate relationship between phenotypic and genetic properties of C. jejuni strains isolated at particular point of broiler meat production chain.
Novelty, scientific and practical importance of the study
There is a lack of data on true Campylobacter spp. prevalence in broiler flocks in Lithuania. Thus, in the present study the prevalence of Campylo-bacter spp. in broiler flocks from different broiler farms representing about 70% of broiler production was investigated. Such knowledge allowed de-termining the role of broiler meat as a source for human campylobacteriosis in Lithuania. During this study information on farm management and hy-giene procedures has been collected. Also C. jejuni isolates obtained at this study were analyzed genetically to identify variation of this bacterium spe-cies at the flock, farm and country levels. Analysis of C. jejuni flock preva-lence and genotyping data in combination with farm management data al-lowed identifying possible interventions reducing the spread of this bacte-rium from broilers to people at the beginning of broiler meat processing chain, in Lithuania.
Although cross-contamination is considered as the main route of broiler carcass contamination at slaughterhouse with C. jejuni, alternative sources of C. jejuni may have been overlooked. Only limited number of studies fo-cus on sampling of broiler flocks along the entire food chain and not many include the slaughterhouse environment. Therefore, in the present study we have traced the changes of C. jejuni genotypes within one broiler flock from the beginning of rearing to the final product at the slaughterhouse with the aim to evaluate the dynamics and possible sources of carcass contamination with C. jejuni.
Previous studies indicate that not all genotypes of C. jejuni entering the slaughterhouse survive the slaughter processes, as only a few genotypes
were found on the meat [20, 28, 35], resulting in the hypothesis that surviv-ing strains may implement a more efficient stress adaptation. Enhanced sur-vival or adaptation properties may cause such C. jejuni isolates to contami-nate broiler meat or to survive in the environment. Consequently, to test this hypothesis we compared genotypic and phenotypic properties of different C. jejuni strains collected along the broiler meat chain (broiler cloacae, slaugh-ter house environment, broiler fillets) using a chicken meat juice food model (Birk et al., 2004) as an environment most similar to that C. jejuni experi-ence on broiler meat.
MATERIALS AND METHODS
The work undertaken in this study has been divided into four phases. In phase one, the prevalence of Campylobacter spp. in broiler flocks in Lithua-nia was investigated. In the second phase, C. jejuni isolates selected from the first stage were genotyped by AFLP method to evaluate genetic diversity of this bacterium at the country and farm level. In the third phase, one broiler flock was selected to investigate the changes of C. jejuni genotypes along broiler meat production chain and to determine the sources of broiler meat contamination. Lastly in phase four, C. jejuni isolates were selected from the second and third phases and tested for their phenotypic and genetic properties.
Prevalence of Campylobacter spp. in broiler flocks in Lithuania Nine broiler farms representing about 70% of the Lithuanian broiler pro-duction were sampled over one year period. Each farm was visited at least two times, in warm and cold periods of year. The cold period was defined as November-March and the warm period as April-October. For this study the number of individual broiler cloacae samples taken from each flock was calculated to 10 using the WinEpiscope 2.0 program (Blas et al., 1998). The flock was considered positive if at least one of ten cloacae samples was positive for Campylobacter. Data concerning farm management and sanitary practices were collected from a questionnaire administered to each farmer on the sampling day. Three biosecurity and hygiene levels (high, average and low) were established based on the answers to questions related to bio-security in the questionnaire.
For the direct plating, Campylobacter Blood-Free Selective Agar Base (modified CCDA-Preston) was used. A selective enrichment procedure was performed using Bolton selective enrichment broth. After incubation, the cultures were streaked onto plates with mCCDA agar. Following incubation on mCCDA, up to 5 colonies suspected of being Campylobacter were
ob-tained from each plate and examined by phase-contrast microscopy, and further purified on blood agar plates Blood Agar Base No. 2, and subse-quently stored at -80ºC in freezing broth.
Genomic DNAs were extracted from 48-h-old cultures using GenEluteTM Bacterial Genomic DNA Kit according manufacturer instruction.
Campylobacter isolates were identified to the species level by a slight modification of the method and primers described by Wang et al. (2002). Primers 23SF and 23SR were used for identification of Campylobacter spp. Primers CJF, CJR and CCF, CCR were used to identify C. jejuni and C. coli, respectively.
Genetic diversity of C. jejuni in broiler farms
C. jejuni isolates (190) from seven broiler farms, named from A to G, which sampled positive for C. jejuni, were used for genetic characterization. In order to estimate within flock genetic variability, up to five isolates from each sample obtained from farm A were typed by AFLP method, whereas only one isolate from each of individual samples from other farms (B-G) was examined to estimate the genetic variability between farms.
The genotyping of selected C. jejuni isolates was performed by using a protocol described by Bojesen et al. (2003) with minor changes. Chromo-somal DNA was digested with BglII and BspDI restriction enzymes. Sam-ples were electrophorised on denaturing polyacrylamide gels on an ABI PRISMTM 377 DNA automated sequencer. GeneScan 3.1 software and Gel-Compar II program were used for data analysis.
Changes of C. jejuni genotypes within one broiler flock at farm and during slaughtering
One broiler flock was investigated from farm to the final product at slaughterhouse. During each visit at the farm (on day 15, 24 and 35) thirty broiler cloacae samples were collected. In total 184 broiler cloacae and 48 environmental samples were collected at farm level.
Environmental samples were taken at the slaughterhouse just before slaughtering, at the beginning of slaughter (first three hours), when the slaughter process has been operating for 4-6 hours and finally at the end of the day (7-8 hours). Broiler cloacae, neck skin and breast fillets samples were collected at different stages during the slaughter process including de-feathering, evisceration and chilling. Samples of the processing environment at slaughterhouse were also taken three times: (i) before broiler slaughtering (after disinfection), (ii) within 4-6 and (iii) within 7-8 hours of the slaughter process. In total 30 broiler cloacae, 30 neck skin, 10 breast fillets and 30 environmental samples were collected at the slaughterhouse.
di-rect plating and bacteria enrichment, respectively. Following isolation, cells were examined by phase-contrast microscopy, and purified on blood agar plates (Blood Agar Base No. 2). Genomic DNAs were extracted from 48-h-old cultures using GenEluteTM Bacterial Genomic DNA Kit according manufacturer instruction. Campylobacter isolates were identified to the spe-cies level by a slight modification of the method and primers described by Wang et al. (2002).
A total of 345 isolates of C. jejuni were genotyped using PCR-RFLP of the flaA gene method, which was performed according to CAMPYNET pro-tocol described previously (Harrington et al., 2003). HpyF31 (DdeI) restric-tion enzyme was used for the restricrestric-tion fragment length polymorphism (RFLP) analysis of the PCR product.
Characterization of C. jejuni strains in broiler meat production chain
To investigate the effect of genotype on C. jejuni phenotypic properties ten strains (S164, S266, S283, S330, S348, S349, S351, S353, S382, S400) were selected out of 345 isolates obtained through the rearing and slaughter-ing of one broiler flock. Additionally one strain (H140) isolated from a clinical case linked to eating chicken and one broiler cloacae strain (F508) that persisted for one year within Lithuanian broiler farms were included.
C. jejuni survival was tested under low (5ºC and -18ºC), ambient (20oC) and elevated (48oC) temperatures relevant to storage of poultry meat, the kitchen environment and slaughterhouse conditions, respectively. Chicken juice prepared as described by Birk et al. (2004) was used as a food model system to test survival of C. jejuni at different temperatures. Stationary phase bacterial cultures were adjusted to an OD600=0.2, and inoculated 1:10
into sterile chicken juice and incubated for 30 days at 5°C, 35 days at -18ºC and 18 days at 20°C. The experiment at 48ºC was performed as described by Birk et al. (2004). In each temperature samples were withdrawn at particular time points for CFU's estimation. All experiments were repeated twice.
Attached biofilms were examined as described by Reeser et al. (2007) with minor changes. Twenty four well polystyrene plate containing Mueller Hinton (MH) broth were inoculated 1:10 with stationary phase bacterial cultures adjusted to OD600=0.25. Plates were incubated at 37°C
microaero-bically for 24, 48 and 72 h. Following incubation, biofilms were stained with crystal-violet (CV) and decolorized with 80% ethanol-20% acetone. Biofilm formation was determined at 540 nm (A540) using a microplate reader. The assay was repeated three times.
Multilocus sequence typing (MLST) (Dingle et al., 2001) and DNA mi-croarray (Champion et al., 2005) methods were used for genetic
characteri-zation of C. jejuni strains used in this study.
Statistical analyses of the quantitative data were performed using the SPSS version 9.0. One-way ANOVA, LSD and Bonferroni methods were used to determine differences between strains.
RESULTS AND DISCUSSION
Prevalence of Campylobacter spp. in broiler flocks in Lithuania Broiler farms representing majority of broiler production in Lithuania, were examined to determine the prevalence of Campylobacter spp. in broiler flocks. The results of the study revealed the contamination rates of Campy-lobacter spp. from 60 to 100% flock prevalence depending on farm investi-gated. However, in two out of nine broiler farms Campylobacter spp. was not detected. The most common species identified was C. jejuni (73.8%), however surprisingly C. coli was fairly prevalent (40.48%), as well. The analysis of farm management data did not show significant differences be-tween farms and usually low to average biosecurity levels were identified among 9 farms examined, thus indicating that poor farm management may have a significant role to a high prevalence’s detected in this study (Newell and Fearnley, 2003).
Genetic diversity of C. jejuni in broiler farms
Using AFLP genotyping method a high genetic diversity, resulting 50 genotypes of this bacterium, has been determined. Possibly the low biosecu-rity level at farms could also have impact on high genetic variation of C. jejuni population detected in broilers, particularly in warm period of year (Johnsen et al., 2006; Newell and Fearnley, 2003). Both in warm and cold periods of year C. jejuni clones colonizing several broiler flocks at the same farm over time were detected. Detection of farm specific clones indicates that transmission between different flock at farm may occur or alternatively may show the presence of a common source(s) (e.g. water) of C. jejuni at farm (Petersen and Wedderkopp, 2001).
Significant finding of this study was identification of persistent strain of C. jejuni (A32), which was detected over one year period in five broiler farms located in different geographical regions, in Lithuania. Such strains present at the beginning of broiler meat chain may represent highly adapted clones of C. jejuni, eventually having better chances to survive along all broiler meat chain and reach the consumer (Manning et al., 2001).
Changes of C. jejuni genotypes within one broiler flock at farm and during slaughtering
One broiler flock was traced from the beginning of rearing until the final product at the end of slaughtering to investigate the possible sources of
broiler meat contamination with C. jejuni. High prevalence (66.6%) of C. jejuni on the surfaces and scalding water at slaughterhouse after disinfection was detected. Same C. jejuni genotypes also dominated on broiler fillets at the end of processing. Even though, the slaughterhouse environment as a source of C. jejuni was already suspected by the other authors (Newell et al., 2001; Peyrat et al., 2008), however it was not before demonstrated that it may also be the main source of broiler meat contamination at the end of processing. The presence of C. jejuni in the environment of slaughterhouse may occur due to insufficient cleaning and disinfection of slaughterhouse or can be related with resistance of these strains to disinfectants (Peyrat et al., 2008). We also theorized that some C. jejuni may survive better in the envi-ronment then others, thus may be further transmitted to a new host.
Characterization of C. jejuni strains in broiler meat production chain
C. jejuni isolates, representing different genotypes selected throughout all broiler meat chain were examined for their ability to form biofilm and to adapt to extreme temperatures present in the slaughterhouse. The results showed that C. jejuni isolated from slaughterhouse environment after disin-fection formed biofilm most extensively compare to strains isolated from broiler fillets or broiler cloacae. Within biofilm bacterial cells are protected from the environmental stresses such as starvation, osmotic and temperature changes. Due to biofilm formation C. jejuni may survive and persist for a longer periods in the environment and remain a significant source of broiler meat contamination in slaughterhouse (Annous et al., 2009). The study also revealed that different C. jejuni strains sporadically found on the surface of meat at the end of slaughtering survived significantly better than other tested strains at both low and high temperatures. We suppose that such adaptation might be important for survival of such sporadic C. jejuni strains during processing and it is relevant to public health because survival of these strains during refrigeration may cause the risk to human health (Chan et al., 2001).
Finally, with the application of advanced molecular techniques as com-parative microarray and MLST typing for genetic analysis of C. jejuni strains we found that there is a relationship between genetic and phenotypic properties of C. jejuni. The specific genes present in persistent strain of C. jejuni and between strains groups forming and non-forming biofilm were identified. The knowledge obtained during this study will be helpful in a future studies on evaluating the mechanism of C. jejuni persistence and sur-vival in the environment and on identification of genes that may serve as a targets for C. jejuni control at particular points of broiler meat production chain.
CONCLUSIONS
1. Over one year period a high prevalence of Campylobacter spp. (80.95%) in broiler flocks from nine broiler farms was determined, in Lithuania. Out of 42 broiler flocks examined, C. jejuni was found in thirty one (73.8%) and C. coli in 17 broilers flocks (40.48%).
2. The new AFLP method using BspDI and BglII applied for genotyping of C. jejuni enabled detection of high variation of C. jejuni population in broiler farms. Each farm showed one or more predominant AFLP types. One AFLP type (A32) was found in five broiler farms over one year period, which was considered as persistent.
3. Broiler fillets were mainly contaminated with flaA genotypes found on the surfaces of slaughterhouse equipment and in the scalding water after cleaning and disinfection. Finally, it was clearly demonstrated that C. jejuni isolates remaining in slaughterhouse environment after disinfection is a po-tential source of broiler meat contamination.
4. It was found that the environmental strains produced biofilm more extensively compare to all other strains tested, thus they may had more chances to attach to the surfaces of equipment and survive for a long time periods in the slaughterhouse. Meanwhile, broiler fillets isolates showed enhanced survival at both high and low temperatures, suggesting that such adaptation may cause superior survival of those strains during broiler meat processing.
5. It was demonstrated that C. jejuni isolates originating from both broiler fillets and the slaughterhouse environment were genetically very similar and shared the ability to form biofilm. The broiler cloacae strain failed to biofilm and was phylogenetically related to broiler fillets strain which did not form biofilm as well. These findings suggest that a relation-ship between particular phenotypic properties of C. jejuni strains and genetic features exists in the C. jejuni population.
SUGGESTIONS FOR FUTURE INVESTIGATIONS AND REC-OMMENDATIONS
1. Higher prevalence of Campylobacter spp. in broilers at farm is re-lated with higher risk for human infection through broiler meat contami-nated with campylobacters. In order to reduce the risk on consumer health efforts must be taken by the poultry meat industry, veterinary and public health authorities. The suggested measures are the establishment of national programs focusing on Campylobacter monitoring and biosecurity in broiler flocks and also improvement of consumer knowledge on broiler meat
prepa-ration in the kitchen.
2. Slaughterhouse environment is a potential source of broiler meat con-tamination with C. jejuni, therefore the efficient cleaning and disinfection of the slaughterhouse equipment after processing are critical to eliminate this bacterium from the surfaces of equipment.
3. Further studies improving the understanding the physiology of C. je-juni particularly focusing on its adaptation to adverse environmental condi-tions present in slaughterhouse would benefit for the control of Campylo-bacter spp. along broiler meat production chain.
4. According to the results of this study some strains or lineages of C. jejuni in respect to physiological properties are specifically adapted to the particular point of broiler meat production chain. Further investigations of the role of genes which were found being specific for strains/strains groups possessing specific phenotypic properties would be useful to get more in-sight into the adaptive properties of C. jejuni.
5. For future studies it would be useful if more data e.g. antimicrobial susceptibility, prevalent genetic lineages from a different sources and clini-cal cases on C. jejuni population in Lithuania would be collected as a matter of a routine. Such information would be useful for further research and iden-tification of potential sources and risk for human campylobacteriosis in Lithuania.
PUBLICATIONS
1. Kudirkien÷, E., Cohn, M.T., Stabler, R.A., Strong, P.C., Šernien÷, L., Wren, B.W., Nielsen, E.M., Brøndsted, L., Malakauskas, M., 2010. Ge-netic and phenotypic characterization of Campylobacter jejuni isolates re-lated to the broiler meat production chain. (Manuscript). Submitted to Ap-plied and Environmental Microbiology.
2. Kudirkien÷, E., Bunevičien÷, J., Brøndsted, L., Ingmer, H., Olsen, J. E., Malakauskas, M., 2010. Evidence of broiler meat contamination with post-disinfection strains of C. jejuni from slaughterhouse. International Journal of Food Microbiology, doi:10.1016/j.ijfoodmicro.2010.06.024.
3. Kudirkien÷, E., Malakauskas, M., Malakauskas, A., Bojesen, A. M., Olsen. J. E., 2010. Demonstration of persistent strains of C. jejuni within broiler farms over one year period in Lithuania. Journal of Applied Micro-biology, 108: 868-877.
4. Kudirkien÷, E., Malakauskas, A., Šernien÷, L., Malakauskas, M., 2008. Isolation and identification of thermophilic Campylobacter spp. by PCR-RFLP in broiler flocks. Veterinarija ir Zootechnika, 42: 44-47.
PRESENTATIONS IN CONFERENCES
1. Kudirkien÷, E., et al. The poster: “The survival properties of C. jejuni based on strain origin and phylogeny”. 22nd International ICFMH Sympo-sium, FoodMicro2010, Denmark, from 30th August to 3rd of September, in 2010.
2. Kudirkien÷, E. Oral presentation: “Discrimination of Campylobacter jejuni strains by rep-PCR method in comparison with AFLP analysis”. XI international meeting of Lithuanian Biochemical Society “LBS 50”. Lithua-nia. 15-17 of June, in 2010.
3. Kudirkien÷, E. Oral presentation: “The relationship between human campylobacteriosis and C. jejuni isolated along broiler meat chain”. 3th Na-tional conference: Science-for human health. Kaunas University of Medi-cine, Lithuania. 7th of April, in 2010.
4. Kudirkien÷, E., et al. The poster: “Characterization of C. jejuni strains representing broiler meat chain”. BIOTRACER EC Review Meeting and 4th General Meeting. Technical University of Denmark. 22-23 of March, in 2010.
5. Kudirkien÷, E., et al. The poster: “Discrimination of Campylobacter jejuni strains by rep- PCR method in comparison with AFLP analysis”. XIV ISAH Congress 2009. University of Vechta, Germany. 19-23 of July, in 2009.
6. Kudirkien÷, E., et al. The poster: “AFLP genotyping of Campylobac-ter jejuni strains from broilers at flock, farm and country level”. The first international meeting on food control research”. University of Helsinki, Finland. 15-17 of October, in 2008.
CURRICULUM VITAE
Egl÷ Kudirkiene was born in Rageliai village, district of Rokiškis, Lithuania on the 1st of November, in 1980. In 2006, in March, she com-pleted five years of undergraduate studies at the Faculty of Veterinary Medicine, Lithuanian Veterinary Academy and obtained the diploma Doctor of Veterinary Medicine by defending the final degree thesis titled “The bac-teriological investigation of microflora in dog eyes”. The thesis results were published in peer-reviewed scientific journal “Veterinarija ir Zootechnika” in 2006. E. Kudirkiene was interested in microbiology and after graduation applied for PhD studies at the Department of Food Safety and Animal Hy-giene, Faculty of Veterinary Medicine, Lithuanian Veterinary Academy.
Training and courses:
February 2007 Course: Methodology of Research. Estonian Uni-versity of Life Sciences, Tartu, Estonia. Duration: 1 week.
December 2007 Genotyping Workshop: Typing and Tracing of Bacteria. University of Bern, Switzerland. Dura-tion: 2 days.
May 2008 Course: Infection Microbiology. University of Co-penhagen, Denmark. Duration: 1 month.
October 2008 Training on Chicken juice based food model. Uni-versity of Copenhagen, Denmark. Duration: 1 week.
December 2008 Course of Bioinformatics. Lithuanian veterinary academy, Lithuania. Duration: 2 days.
July 2009 Training on DNA microarray and methods to study gene expression. Federal Institute of Risk Asses-ment, Germany. Duration: 1 week.
June 2010 Nordic Summer School in Methods of Infectious Disease Epidemiology (NordForsk course). Den-mark. Duration: 1 week.
Awards obtained:
• Prize for oral presentation in XI international meeting of Lithuanian Biochemical Society “LBS 50” in Lithuania, received from MBI “Fermen-tas”, on 15-17 of June, in 2010.
• Financial support for participation in XIV ISAH Congress 2009. Uni-versity of Vechta, Germany obtained from “Prof. Tielen fund” Foundation, on 19-23 of July, in 2009.
• Scholarship for 2 months research visit to Department of Veterinary Disease Biology, Copenhagen University obtained from Danish Agency for International Education (CIRIUS) and Lithuanian Ministry of Education and Science, from 31st of March to 29th of June, in 2009.
• Scholarship for 3 months research visit to Department of Veterinary Disease Biology, Copenhagen University obtained from Danish Agency for International Education (CIRIUS) and Lithuanian Ministry of Education and Science, from 6th of September to 6th of November, in 2008.
• Yearly research grants from Lithuanian State Science and Studies Foundation in period 2007-2010.
Maketavo R. Trainien÷,
Leidybos organizavimo specialist÷
Už teksto turinį ir redagavimą atsakingas autorius Spausdino LSMU VA Spaudos ir leidybos skyrius Tilž÷s g. 18, LT-47181 Kaunas
