III. Risultati
La prima domanda che ci siamo posti e alla quale abbiamo cercato di rispondere è stata se l’esperienza visiva, durante il periodo critico, fosse uno stimolo sufficiente ad attivare l’acetilazione degli istoni; abbiamo dunque voluto verificare se la cascata d’attivazione della via di ERK oltre all’’attivazione del fattore CREB inducesse l’attivazione delle acetiltransferasi e dell’acetilazione del nucleosoma.
Le analisi, compiute su corteccia di topi in periodo critico sottoposti a specifici trattamenti buio-luce, hanno permesso di constatare la presenza dell'attivazione dell'acetilazione dell'istone H3 in seguito alla sola esperienza visiva.
Come mostrato in figura 1, l’esposizione alla luce per un lasso di tempo variabile (40 o 90 minuti), successiva ad un periodo di stazionamento al buio (60 ore), induce l'acetilazione degli istoni H3. La concentrazione d'istone acetilato aumenta all'aumentare del tempo d'esposizione alla luce ed è quindi direttamente proporzionale alla durata dell'esperienza visiva. A dimostrazione del fatto che tale attivazione dipende dall'esperienza si noti come negli individui dr, che non hanno subito alcuna forma di stimolazione visiva, l'acetilazione degli istoni H3 non vada oltre al livello basale. L’acetilazione dell’isotne H3 è stata valutata per mezzo di tecniche di western blot in cui ciascun campione veniva caricato 2 volte sullo stesso gel. Dopo il trasferimento su filtro delle proteine, una corsia dello stesso campione veniva reagita con un anticorpo specifico per la forma acetilata dell’istone H3 e l’altra con un anticorpo che lega l’istone H3 in modo indipendente dalle sue modificazioni post-traduzionali. La specificità dell’anticorpo per l’istone acetilato è stata valutata su estratti di fibroblasti NIH3T3 in coltura trattati con TSA. La TSA è un inibitore delle istone deacetilasi, la cui azione determina un aumento dell’acetilazione di queste proteine. Come si può osservare in figura 1 la banda corrispondente alle cellule trattate con TSA rivelata con l’anticorpo per l’acetilistone è molto intensa. Con questo anticorpo non era apprezzabile alcuna banda negli estratti di cellule non trattate (dato non mostrato in figura). Per visualizzare meglio la banda corrispondente agli istoni acetilati negli estratti di corteccia visiva, le corsie in cui veniva in seguito effettuata la rivelazione con l’anticorpo specifico per l’acetilistone venivano caricate con una quantità di proteine totali cinque volte maggiore. Le lastre venivano esposte per differenti tempi e si eseguiva un analisi densitometrica delle bande nelle lastre in cui le bande non apparivano saturate. I campioni venivano codificati all’inizio del processamento ed il codice veniva rivelato dopo la densitometria. Per ciascun campione il rapporto tra
l’intensità della banda corrispondente all’istone acetilato e la banda degli istoni totali veniva preso come indice dell’acetilazione dell’istone H3.
Considerando la cinetica d'attivazione, dovuta ad esperienza visiva, degli elementi costitutivi la via di ERK, che ci viene fornita da precedenti studi, possiamo notare come l'attivazione di ERK raggiunga il valore massimo dopo 15 minuti d'attività visiva, così come l'attivazione di una chinasi, quale MSK, che si trova a valle nella cascata di traduzione. Il picco d'attivazione di CREB è invece spostato a 40 minuti d'attività visiva, lasciando intendere che l’induzione dell'espressione genica abbia bisogno di un'attivazione della via di segnale più consistente e stabile (Cancedda et al., 2003). In quest'ottica il nostro dato, che mostra una cinetica di attivazione di tipo più tardivo e sostenuto nel tempo sembra avvalorare la tesi, delineando la possibilità che ad una cascata d'attivazione "gerarchica" se ne aggiunga una "temporale" in cui per passare allo step successivo è indispensabile non solo l'attivazione dell'elemento precedente ma anche il mantenimento dello stato d'attivazione dell'intera via oltre un certo tempo.
Al fine di verificare se effettivamente l'acetilazione degli istoni H3 dipenda dall'attivazione della via di ERK, abbiamo testato l'effetto della stimolazione visiva su animali esposti a 90 minuti di luce e trattati con l'inibitore di ERK SL237 (Fig. 2). L'acetilazione degli H3 viene bloccata dall'inibizione della via di ERK, compresa l'attivazione basale, come dimostra il dato del dr. La somministrazione del solo veicolo invece, non comporta alterazioni del risultato ottenuto nel precedente esperimento, a dimostrazione del fatto che l'esperienza visiva induce l'attivazione dell'acetilazione degli istoni attraverso la via di ERK.
Tutti questi risultati si riferiscono alla situazione durante il periodo critico; nostro interesse era verificare se queste azioni dell’esperienza visiva fossero presenti nell'adulto, al fine di iniziare a comprendere la natura delle variazioni molecolari che rende gli individui meno plastici al di fuori del periodo critico.
Il dato di partenza ci viene fornito da studi precedentemente eseguiti in laboratorio in cui si dimostrava che l'attivazione di ERK e l'espressione genica mediata dal CRE in seguito ad esperienza visiva viene confrontata nell'adulto e durante il periodo critico in topi transgenici CRE-LacZ (Fig. 3). Come si può osservare, lo stato di fosforilazione di ERK nell'adulto non subisce variazioni se confrontato con il dato del periodo critico (vedere le colonne DR+L), il che significa che non vi è una diminuzione dell'attività a monte nella via di trasduzione del segnale.
Per quel che riguarda l'attivazione dell'espressione genica invece, il dato mostra inconfutabilmente una diminuzione del livello di trascrizione nell'adulto rispetto al periodo critico; tale differenza non appare significativa per gli individui dr e Nor (sottoposti al normale ciclo buio-luce), suggerendo che le differenze riguardino esclusivamente l'attivazione della trascrizione indotta da esperienza visiva e non dipendano da una generale riduzione dell'espressione dei geni sotto il controllo esclusivo di CRE.
Come detto, sulla base di questo dato abbiamo deciso di scavare oltre e di vedere se anche il livello d'acetilazione degli istoni H3 variasse nell'adulto. L'esperimento riassunto in figura 4 mostra come topi adulti testati nelle medesime condizioni sprimentali di cui sopra (dr, 40 minuti di luce, 90 minuti di luce) presentino una riduzione notevole del livello d'acetilazione degli istoni H3 se confrontati con il risultato degli individui in periodo critico.
L'insieme dei due esperimenti ci dice che la differenza più vistosa fra individui in periodo critico ed adulti, in materia d'attivazione di substrati molecolari indotta da esperienza visiva, riguardi l'attivazione dell'espressione genica. Un bassimo livello d'acetilazione degli istoni, legato ad un bassissimo livello di fosforilazione del CREB (Fig. 5) provocano, nell'adulto, la riduzione vistosa dell'espressione genica mediata dal CREB ed attivata dalla via di ERK e, prima ancora, dall'esperienza visiva.
A questo punto ci siamo chiesti quale dei due fattori, la mancata acetilazione degli istoni o la mancata attivazione di CREB, influenzasse negativamente l'altro producendo sulla trascrizione genica gli effetti descritti.
Considerata l'importanza dell'acetilazione degli istoni e del rimodellamento della cromatina nella promozione della trascrizione genica e, ancora di più, della deacetilazione degli istoni e dell'impacchettamento della cromatina nella sua soppressione, abbiamo deciso di osservare a quali risultati portasse, in termini d'espressione genica stimolata da esperienza visiva, indurre artificiosamente l'acetilazione degli istoni nella corteccia visiva di topi adulti.
Gli esperimenti sono stati condotti su topi adulti (>p70) CRE-LacZ; come già indicato nel capitolo "materiali e metodi", i topi transgenici CRE-LacZ vengono utilizzati per testare i livelli d'espressione dei geni sotto il controllo esclusivo della sequenza CRE; tale sequenza si lega al fattore di trascrizione CREB.
La trascrizione del gene LacZ porta alla sintesi della proteina β-galattosidasi, la quale metabolizza l'X-gal, un composto da noi fornito alle cortecce, producendo come effetto la colorazione in blu della cellula.
Ai topi transgenici sono state innestate monolateralmente delle minipompe contenenti una soluzione di TSA, inibitore dell'istone deacetilasi; le minipompe rilasciano il liquido direttamente nella corteccia dell'animale, dove è libero di diffondere.
Successivamente i topi sono stati messi al buio per 60 ore e stimolati con 12 ore di luce al termine del quale i cervelli sono stati asportati, fatti reagire con l’X-gal ed analizzati.
L'effetto macroscopico di tale trattamento è mostrato in figura 7. La corteccia sinistra, ipsilaterale rispetto al sito d'innesto della minipompa, presenta un'evidente colorazione blu, indice dell'avvenuta trascrizione del gene reporter LacZ. Come era lecito attendersi, l'espressione genica è stata indotta nella corteccia trattata più di quanto non sia accaduto nella corteccia controlaterale, raggiunta da una concentrazione di gran lunga
inferiore di TSA e che ha dunque beneficiato meno degli effetti dell'inibizione.
Come ricordato in precedenza, la tricostatina A (TSA) induce l'acetilazione degli istoni mediante l'inibizione dell'istone deacetilasi, uno dei due enzimi, insieme all'istone acetiltransferasi, che determina il livello di acetilazione della cromatina in ciascuna cellula; l'acetilazione dell'istone H3 indotta da TSA è probabilmente dovuta all'attività basale dell'istone acetiltransferasi (HAT).
Questo primo dato sembrerebbe dunque suggerire che il semplice ripristino di alti livelli d'acetilazione degli istoni possa portare al recupero dell'espressione genica mediata da CREB indotta da esperienza visiva nell'adulto.
Anche analisi microscopiche su sezioni di corteccia sembrano confermare il dato macroscopico (Fig. 7A); in questo caso non ci siamo limitati ad osservare il risultato ma abbiamo cercato di quantificare la differenza d'espressione genica fra le due cortecce.
La conta delle cellule blu esprimenti la β-galattosidasi è stata effettuata in campi di corteccia visiva ipsi e contro-laterale. I risultati confermano quanto anticipato dall’analisi macroscopica; il numero di cellule marcate appare essere maggiore nelle cortecce trattate che in quelle controlaterali (Fig. 7B e 7C); il dato risulta essere significativo tanto se si confrontano le medie delle cellule marcate per campo di corteccia visiva trattata e non trattata (Fig. 7B), quanto se si confrontano le medie delle cellule marcate per individuo nei campi di corteccia visiva ipsi e contro-laterale (Fig.7C).
Un ulteriore analisi ha riguardato le sezioni corticali, al di fuori della corteccia visiva, prossime al sito d'innesto della minipompa. Abbiamo voluto valutare l'effetto farmacologico della TSA sull'induzione dell’espressione genica in una regione non influenzata dall'esperienza visiva. Come dimostra la figura 8, la corteccia ipsilaterale presenta, anche al di fuori dei fenomeni riguardanti l'attivazione della trascrizione genica indotta dall'esperienza visiva, una maggiore concentrazione di cellule marcate rispetto alla corteccia controlaterale. Questa analisi è stata effettuata su un numero minore di animali (N=3) e il dato, seppur mostrando una chiara tendenza, non raggiunge ancora la significatività statistica.
Il dato conferma quanto già ricordato sulla stretta connessione che lega l'acetilazione della cromatina e l'espressione genica.
Infine, il dato riportato in figura 9 rivela come i risultati ottenuti non dipendano da un effetto aspecifico della tecnologia utilizzata, ma siano la diretta conseguenza dell’utilizzo dell’inibitore dell’istone deacetilasi; infatti gli individui controllo, impiantati con una minipompa contenete solo il veicolo (etanolo 0.01% in soluzione salina), presentano livelli di espressione del gene significativamente più bassi rispetto agli animali trattai con tricostatina.
Ac H3 H3
Trico dr
40min 90min
0 6
1
AcH3/H3 ratio
15 KDa
dr 40min 90min
20 KDa
Fig. 1. Analisi degli effetti della stimolazione visiva sull'acetilazione dell'istone H3 durante il periodo critico.
Gli animali sono stati sottoposti ad un periodo di buio (60 ore) e, successivamente, riesposti alla luce per 40 e 90 minuti o non riesposti affatto (dr). Abbiamo utilizzato la tecnica del western blot per valutare lo stato d'acetilazione dell'istone H3 e la quantità totale di istone H3 presente.
Si noti come la concentrazione dell'istone acetilato aumenti con l'aumentare del tempo d'esposizione alla luce (ANOVA ad una via p<0.01; post-hoc Tukey p<0.05 per entrambi i tempi rispetto al dr). La corsia trico vale come controllo per la specificità dell’anticorpo per l’istone acetilato e rappresenta il segnale originato da NIH3T3 trattate con tricostatina A.
Dr Veicolo SL237 0
1 2
AcH3/H3 ratio
20 15
20 15
H3
Ac H3
90min+veh 90min+SL dr
Fig. 2. Inibizione dell'acetilazione degli istoni H3 indotta da esperienza visiva durante il periodo critico, ad opera dell'inibitore di ERK SL327. I topi vengono iniettati con SL327, o con il veicolo, via intraperitoneale e sottoposti al ciclo buio-luce (60 ore di buio-90 minuti di luce). I topi dark (dr) non vengono stimolati con la luce. Si noti come l'attivazione dell'acetilazione degli istoni indotta dall'esperienza visiva sia notevolmente diminuita negli animali trattati con l'inibitore di ERK, fino a raggiungere valori addirittura inferiori a quelli riscontrati nel dark; questo test fornisce la dimostrazione che l'attivazione dell'acetilazione degli istoni indotta dall'esperienza visiva durante il periodo critico è dipendente dall'attivazione della via di ERK (ANOVA a una via p<0.01; post hoc Tukey test p< 0.05 per veicolo rispetto a Dr e SL237; p>0.05 per DR vs. SL237) .
0 100 200 300
β -gal cellule densità
adulto
Periodo critico
Nor DR DR+L Nor DR DR+L
pERK Espressione genica
mediata da CRE
0 50 100 150 200 250
pERK cell densità
Nor DR DR+L Nor DR DR+L Periodo critico adulto
Fig. 3. Confronto fra l'espressione genica mediata da CRE nell'adulto e durante il periodo critico. I topi sono stati divisi in tre gruppi: normale ciclo buio-luce, animali allevati al buio per un certo periodo (DR), animali allevati al buio e successivamente esposti alla luce (DR+L). Negli animali DR+L adulti l’attivazione dell’espressione genica mediata dal CRE è ridotta rispetto a gli animali in periodo critico. Si ponga l'attenzione sul fatto che lo stato d'attivazione di ERK non è mutato nelle due classi di animali, a testimonianza del fatto che la repressione della trascrizione genica nell'adulto dipende da meccanismi che agiscono a valle dell'attivazione di ERK.
1
AcH3/H3 ratio
* *
6
Periodo critico
0 1
AcH3/H3ratio
Adulto
6
0
40min
dr 90min
Fig. 4. Confronto fra l'acetilazione degli istoni H3 indotta da esperienza visiva durante il periodo critico e nell'adulto. Gli animali sono stati sottoposti ad un periodo di buio (60 ore) e, successivamente, riesposti alla luce per 40 e 90 minuti o non riesposti affatto (dr). Nell'adulto il livello d'acetilazione degli istoni è nettamente inferiore rispetto a quanto riscontrato nei topi in periodo critico, indipendentemente dal tempo d'esposizione alla luce (ANOVA a una via p>0.05); non solo, i dati testimoniano come nell'adulto la stimolazione visiva non sia sufficiente ad alterare lo stato d'acetilazione degli istoni ovvero non provoca induzione dell'acetilazione.
periodo critico
0 9 18
pCREB/CREB ratio
50
37
dr min15 min40 pCREB
CREB
adulto
18
pCRE
B/CREB ratio
CREB
0 9
pCREB
50
37
dr min15 min40
dr 15min 40min
Fig. 5. Confronto tra i livelli di fosforilazione del CREB nell’adulto e durante il periodo critico. Gli animali sono stati sottoposti ad un periodo di buio (72 ore) e, successivamente, riesposti alla luce per 15 e 40 minuti o non riesposti affatto (dr). Si noti come nell’adulto l’attivazione del CREB non solo non presenti la progressione temporale che si manifesta durante il periodo critico (ANOVA ad una via p<0.01; post hoc Tukey p>0.05 per 15 e 40 min rispetto al DR; 40 min vs. 15 min p< 0.05) ma sia essenzialmente bloccata al livello basale (ANOVA ad una via p>0.05).
controllo (destra) tricostatina
(sinistra)
Fig. 6. Visione macroscopica degli effetti della tricostatina sull'attivazione dell'espressione genica mediata da CRE, in topi transgenici CRE-LacZ sottoposti ad un ciclo di 60 ore di buio e 12 ore di luce.
La corteccia sinistra, ipsilaterale rispetto al sito d'innesto della minipompa, presenta un'alta concentrazione di cellule esprimenti il gene LacZ (sotto controllo esclusivo di CRE) che risulta nella colorazione blu assunta dall'intera corteccia.
tricostatina
(sinistra)
controllo
(destra)
A
0 20 40 60 80 100 120
1 p<0.001
numero cellule marcate/campo
destra sinistra 0
2 4 6 8 1 0 1 2
numero cellule marcate corteccia sx / corteccia dx
B
C
Fig. 7. I topi transgenici CRE-LacZ, trattati con TSA (N=6), sono stati sottoposti ad un ciclo di 60 ore di buio e 12 ore di luce.
A: immagini, acquisite al computer, delle sezioni di corteccia visiva di topi CRE-LacZ trattati con tricostatina A. L'immagine della corteccia sinistra, ipsilaterale al sito d'innesto della minipompa, presenta una concentrazione di cellule esprimenti il gene LacZ superiore a quanto riscontrato nell'immagine della corteccia destra.
B, C: conta delle cellule blu esprimenti il gene LacZ. (B) In questo grafico confrontiamo il numero medio di cellule marcate nei campi di corteccia visiva destra e sinistra. Si noti come i campi della corteccia sinistra, ipsilaterale al sito d’innesto della minipompa, presentino, in media, un numero di cellule significativamente maggiore rispetto ai campi della corteccia destra controlaterale (t-test per dati appaiati, p<0.001).
(C) In questo grafico è mostrato il rapporto tra il numero di cellule marcate nell’emisfero trattato e quello non trattato per ciascun animale. Notare come il rapporto sia in tutti gli animali maggiore di 1. il numero di cellule marcate nelle cortecce ipsilaterali risulta infatti essere significativamente maggiore rispetto alla media di cellule marcate nella corteccia controlaterale(t-test per dati appaiati, p<0.05).
0 50 100 150 200 250 300
1
corteccia non visiva
numero cellule marcate/campo
destra sinistra
Fig. 8. Conta delle cellule esprimenti il gene LacZ in sezioni di corteccia non visiva di topi CRE-LacZ trattati con tricostatina A e sottoposti allo specifico ciclo buio-luce (60 ore-12 ore). Sono state scelte sezioni di corteccia prossime al sito d’innesto della minipompa al fine di valutare l’effetto farmacologico della tricostatina A nell’attivazione dell’espressione genica mediata da CRE. In questo grafico confrontiamo il numero medio di cellule marcate per campi di corteccia non visiva destra e sinistra. La corteccia sinistra, trattata con tricostatina, presenta un numero di cellule marcate maggiore rispetto alla corteccia destra, indicando che gli effetti della TSA sono indipendenti dall'esperienza visiva. Dato che questa analisi è stata eseguita solo in tre animali, i dati mostrano una tendenza che non ha significatività statistica (t-test per dati appaiati, p=0.14).
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
1
numero cellule marcate/campo
veicolo tricostatina A
Fig. 9. Media ed errore standard del numero cellule esprimenti il gene reporter in cortecce di ciascun animale trattate con tricostatina A o con il veicolo (controllo, N=6). Analogamente a quanto riportato in figura 7, si noti come gli animali trattati con TSA presentino una maggiore induzione del gene reporter rispetto agli animali trattati con veicolo (Mann-Whitney test, p<0.01). Anche in questo caso tutti gli animali sono stati sottoposti ad un ciclo di 60 ore di buio e 12 ore di luce.
