L’identificazione di Torquetenovirus, avvenuta in Giappone nel 1997 in un paziente affetto da epatite criptogenetica, ha dato il via ad una lunga serie di indagini volte ad identificare il possibile ruolo di questo virus nelle patologie dell’uomo.
Dopo il grande entusiasmo iniziale circa la presunta correlazione di TTV con alcune malattie del fegato, gli studi più recenti hanno invece dimostrato un probabile ruolo del virus in patologie acute e/o croniche dell’apparato respiratorio in età pediatrica. Ruolo che potrebbe non essere marginale.
Tuttavia, fin dalle prime ricerche è stata evidenziata la sorprendente capacità di TTV di indurre una viremia persistente in un’altissima percentuale della popolazione mondiale (circa 80%), tanto da far ritenere il virus un commensale della normale flora microbica umana.
Nel corso degli anni si sono poi accumulate informazioni sulla struttura del genoma virale, sulle proprietà generali del virus, sulla tassonomia, sulla possibile interazione con l’ospite, ma alcuni aspetti dell’infezione da TTV rimangono ancora irrisolti, primo fra tutti il suo reale ruolo patogenetico.
Particolare attenzione è stata rivolta all’elevata eterogeneità genetica di TTV, inaspettata per un virus a DNA.
Questa diversità, particolarmente elevata nella porzione codificante del genoma, ha condotto all’identificazione di numerosi sottotipi virali ed è stata utilizzata per raggruppare gli isolati di TTV in 5 genogruppi principali costituiti da più di 40 genotipi.
I criteri utilizzati per classificare i vari genotipi di TTV sono basati sull’analisi delle singole sequenze e sulle differenze nucleotidiche tra gli isolati, fattori che conducono ad incrementare sempre di più la diversità genetica di TTV.
La classificazione tassonomica di TTV è stata ed è un aspetto particolarmente complesso e difficile da affrontare, soprattutto per la continua e frequente identificazione di nuovi isolati del virus. Spesso infatti accade che, nel corso degli studi di prevalenza dell’infezione da TTV, dopo l’amplificazione di sequenze del virus e il loro sequenziamento, vengano identificati isolati che non mostrano omologia con quelli depositati in banca dati e che contribuiscono gradualmente ad aumentare la già vasta eterogeneità genetica di TTV (Hallett et al., 2000; Devalle and Niel, 2004).
Anche in questo lavoro di tesi, l’approfondito studio di un transitorio aumento della carica virale in un soggetto viremico
Il picco nella carica plasmatica di TTV, osservato nel soggetto in studio, era di particolare interesse perché estremamente elevato, brusco e transitorio.
Il soggetto MON presentava infatti un notevole incremento della carica plasmatica di TTV (ben 3.75 logaritmi) al trentesimo giorno dopo la vaccinazione contro l’epatite B, aumento che è stato dimostrato non essere imputabile ad un incremento dei titoli virali dei genogruppi di TTV già presenti nel soggetto prima della vaccinazione (genogruppi 1, 3 e 4).
Analisi più approfondite hanno dimostrato che questo aumento poteva essere attribuito esclusivamente ad una superinfezione da parte di un nuovo isolato di TTV, che veniva amplificato dalla PCR universale, ma non dalle PCR genogruppo-specifiche da noi utilizzate per caratterizzare il virus.
L’amplificazione e il sequenziamento dell’intero genoma del virus superinfettante ci hanno quindi permesso di dimostrare che il soggetto era stato infettato con un ceppo di TTV, denominato ViPi04, che rappresentava un distinto genotipo all’interno del genogruppo 2.
La sequenza nucleotidica del virus lo rendeva infatti geneticamente omologo ai genotipi appartenenti a questo gruppo, sebbene differisse da essi per il 35-39% a livello nucleotidico.
Tenendo conto della sequenza identificata, è stato possibile, tramite la costruzione di primer specifici, realizzare una nuova PCR per il genogruppo 2 che può amplificare, con la stessa efficienza, sia l’isolato ViPi04 che gli altri genotipi appartenenti allo stesso gruppo.
Numerosi studi (Biagini et al., 2006; Devalle et al., 2004;
Hallett et al., 2000; Maggi et al., 2003; Maggi et al., 2005a), condotti su soggetti sani o portatori di varie malattie, hanno focalizzato l’attenzione sulla distribuzione e sulla prevalenza dei vari genogruppi di TTV nella popolazione generale.
Da questi studi è emerso chiaramente che i genogruppi virali più diffusi nella popolazione mondiale sono principalmente l’1 e il 3, seguiti dal 4 e dal 5, mentre il genogruppo 2 di TTV risulta essere sempre il meno comune.
In un precedente lavoro del nostro gruppo di ricerca (Maggi et al., 2005a), condotto su 239 soggetti TTV positivi, è stata analizzata la prevalenza dei vari genogruppi del virus: i
genogruppo 2 sia molto più raro rispetto agli altri, con una percentuale di frequenza circa 35 volte minore rispetto al prevalente genogruppo 3.
Un’analisi della prevalenza del genogruppo 2 di TTV è stata effettuata anche in questo lavoro di tesi.
La nuova PCR, ridisegnata specificatamente per amplificare sia l’isolato ViPi04 che gli altri genotipi del gruppo 2, è stata infatti utilizzata per analizzare di nuovo la prevalenza del genogruppo 2 di TTV nella popolazione.
A tale scopo sono stati esaminati 73 campioni tra plasma e tamponi nasali e dai risultati è emerso che il nuovo isolato ViPi04 è molto raro nella popolazione esaminata, così come rari sono gli altri membri del gruppo 2.
Non è ancora del tutto chiaro quali siano le ragioni di questa diversa distribuzione dei genogruppi virali, sebbene alcune ipotesi siano state avanzate.
Una delle possibilità più plausibili è che la diversa prevalenza dei cinque genogruppi di TTV rifletta, almeno in parte, una loro differente capacità di persistenza; questo potrebbe anche spiegare perché l’isolato ViPi04 sia stato riscontrato nel soggetto in studio solo per un brevissimo intervallo di tempo.
Bisogna inoltre considerare che i genogruppi 1 e 3 potrebbero essere i più diffusi perché contengono un più vasto numero di genotipi e sottotipi virali (Maggi et al., 2005a).
Parallelamente ai campioni di plasma, in questo lavoro di tesi sono state analizzate anche cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC). In queste cellule non sono state osservate variazioni significative della carica virale totale durante tutto il periodo di osservazione e l’andamento nel tempo dei tre genogruppi presenti rispecchiava solo in parte quello osservato nel plasma. I genotipi di TTV già presenti prima della vaccinazione mostravano infatti un andamento più costante nei PBMC, con un solo periodo di eclissi del genogruppo 3, peraltro minore rispetto a quello riscontrato nel plasma. Inoltre, nei PBMC, l’isolato ViPi04 è stato identificato non solo al giorno 30, ma anche al giorno 45 e 60.
Questi risultati mostrano che il virus è in grado di persistere più a lungo nelle cellule del sangue periferico rispetto al plasma e che la scomparsa del virus in quest’ultimo rappresenta probabilmente un indice della completa eradicazione del genotipo superinfettante dal sangue del soggetto.
studio manifestava una sintomatologia aspecifica simil- influenzale che interessava anche il tratto respiratorio.
Lo sviluppo di questa sintomatologia rafforza ulteriormente le ipotesi a favore di una possibile correlazione tra TTV e le patologie a carico dell’apparato respiratorio.
In un precedente studio condotto su bambini di età inferiore ai due anni con malattie respiratorie acute (ARD), i dati raccolti hanno infatti evidenziato come il tratto respiratorio possa rappresentare una possibile sede di replicazione ed eliminazione di TTV (Maggi et al., 2003).
Sebbene non sia stato dimostrato con certezza il ruolo di TTV nel determinare direttamente infezioni respiratorie, sembra comunque sempre più convincente l’ipotesi di un coinvolgimento del virus nell’aggravamento di queste patologie.
Di particolare interesse è stato anche notare che nel sangue di MON erano presenti, prima della vaccinazione, tre diversi genotipi di TTV, appartenenti ai gruppi 1, 3 e 4, e che il soggetto aveva sviluppato anticorpi contro di essi.
La presenza di infezioni multiple da TTV è una condizione molto frequente nella popolazione ed è stata ampiamente descritta anche in altri lavori (Ball et al., 1999; Forns et al., 1999; Niel et al., 2000; Romeo et al., 2000; Peng et al., 2002;
Al-Moslih et al., 2004; Maggi et al., 2005a), rappresentando un’ulteriore indicazione dell’ubiquitarietà ed eterogeneità dell’infezione.
Ciò che destava particolare interesse nel soggetto MON non era quindi valutare la presenza di infezione multipla da TTV, bensì esaminare se il soggetto avesse sviluppato anticorpi contro questi virus.
A questo scopo il plasma di MON a tutte le date disponibili è stato analizzato, tramite immunoprecipitazione, per valutare se i virus fossero associati a immunocomplessi.
Dai risultati è emerso che il soggetto aveva sviluppato anticorpi contro gli isolati di TTV presenti prima della vaccinazione, essendo una parte di questi risultata immunocomplessata.
In concomitanza con l’aumento della carica virale totale al giorno 30 e quindi con l’infezione da parte del nuovo isolato ViPi04, si è osservata una significativa diminuzione della percentuale di TTV immunocomplessato, a dimostrazione che la maggior parte del virus superinfettante circolava nel sangue del soggetto in forma libera, non legato ad anticorpi.
Analisi più approfondite hanno infatti successivamente
Il soggetto MON era quindi inizialmente sprovvisto di anticorpi con cui difendersi dal virus superinfettante; tuttavia le analisi hanno dimostrato che questa superinfezione ha avuto una durata molto breve, dal momento che già al giorno 45 non era più possibile identificare nel plasma l’isolato ViPi04.
Questi risultati hanno quindi portato a cercare un possibile meccanismo responsabile dell’eradicazione del virus.
E’ infatti possibile che, durante il breve periodo in cui l’isolato ViPi04 circolava nel sangue di MON, si siano verificati fenomeni di cross protezione, grazie ai quali gli anticorpi già presenti nel soggetto e diretti contro i genogruppi 1 e 4 siano stati capaci di neutralizzare il nuovo isolato ViPi04.
Come dimostrato infatti da un precedente lavoro (Hangartner et al., 2006), gli anticorpi preformati sono in genere più efficaci a neutralizzare una nuova infezione rispetto ad una stabilizzata da tempo; ciò potrebbe quindi indicare che gli anticorpi rivolti contro i TTV di gruppo 1 e 4 abbiano contribuito all’eradicazione dell’isolato superinfettante.
In conclusione, questo lavoro di tesi ha confermato l’esistenza di un’ampia eterogeneità genetica di TTV, caratterizzando un nuovo genotipo del virus appartenente al genogruppo 2 ed ha suggerito la possibilità che tipi diversi di TTV abbiano una differente capacità di persistenza.
