INDICE
ABSTRACT I RIASSUNTO III
1. INTRODUZIONE 1
1.1. Il carcinoma della mammella 1
1.1.1 Epidemiologia e fattori di rischio 1
1.1.2 Il ruolo di BRCA1 nella cancerogenesi 3
1.1.3. BRCA1 e l’associazione specifica ai tumori della mammella e dell’ovaio 6
1.2. Il gene BRCA1:struttura, regolazione e funzione 7
1.2.1. La struttura 7
1.2.1.1. Il dominio RING finger 7
1.2.1.2. I domini di transattivazione 8
1.2.1.2.1. Il dominio BRCT 8
1.2.1.2.2. Il dominio AD1 12
1.2.1.3. Il dominio di legame al DNA 13
1.2.1.4. I segnali di localizzazione nucleare 13
1.2.2. Espressione cellulare e regolazione 14
1.2.3. Le funzioni di BRCA1 16
1.2.3.1. Trascrizione 17
1.2.3.2. Riparazione del DNA e ricombinazione omologa 20
1.2.3.3. Ciclo cellulare 25
1.2.3.3.1. BRCA1 e checkpoint G1/S, S e G2/M 26
1.2.3.3.2. BRCA1 e segregazione cromosomica 28
1.2.3.3.2.1. Il checkpoint della decatenazione 28
1.2.3.3.2.2. Il checkpoint del fuso 29
1.2.3.4. Ubiquitinizzazione 31
1.3. I microarray e la PCR real time negli studi di espressione genica 33
1.4. Scopo della tesi 41
2. MATERIALI E METODI 43
2.1. Estrazione dell’RNA totale da cellule di lievito 43
2.2. Quantificazione e controllo di qualità dell’ RNA 43
2.3. Esperimento microarray 44
2.3.1. Sintesi e marcatura delle sequenze target 44
2.3.2. Quantificazione dell’efficienza di marcatura 44
2.3.3. Ibridazione sui microarray 46
2.3.4. Acquisizione mediante scanner e analisi statistica 46
2.3.5. Inserimento dei geni differenzialmente espressi in vie cellulari note 48
2.4. PCR real time con SYBR GREEN 48
2.4.1. Disegno dei primer 49
2.4.2. Verifica del funzionamento dei primer e ottimizzazione delle condizioni di reazione 50
2.4.2.1. Retrotrascrizione 50
2.4.2.2. PCR “fredda” 51
2.4.2.3. Ottimizzazione delle condizioni di reazione per la PCR real time 51
2.4.2.3.1. Curve di diluizione e di denaturazione 52
2.4.3. PCR real time 53
2.4.3.1. Fase sperimentale 53
2.4.3.2. Analisi dei dati 53
2.4.3.2.1 Valutazione della stabilità dei geni housekeeping 53
2.4.3.2.2 Calcolo del fold-change 54
3. RISULTATI 56
3.1. Valutazione della quantità e dell’integrità dell’RNA 56
3.2.Valutazione dell’efficienza di marcatura delle sequenze target 56
3.3.Utilizzo di un “reference design” per l’esperimento microarray 56
3.4. Analisi dei dati microarray 57
3.5. Selezione dei geni per la validazione in RT-PCR real time 58
3.6. Selezione dei geni housekeeping 58
3.7. Verifica del funzionamento dei primer e ottimizzazione delle condizioni di reazione per l’RT-PCR real time. 59
3.7.1 Verifica della specificità delle coppie di primers mediante PCR “fredda” 59
3.7.2. Determinazione dell’efficienza, della linearità e della specificità delle coppie
primer in RT-PCR real time 60
3.8. RT-PCR real time 61
3.8.1. Fase sperimentale 61
3.8.2. Analisi dei dati 63
3.8.2.1. Valutazione della stabilità dei geni PGK1, PDA1 e ORC5 63
3.8.2.2. Calcolo del fold-change e confronto con il dato microarray 64
4. DISCUSSIONE 66
BIBLIOGRAFIA 82
SIGLE PRINCIPALI
ATM Ataxia Telangiectasia Mutated
ATR Ataxia Telangiectasia and Rad3 Related BACH1 Brca1-Associated Carboxyl Terminal helicase BARD1 BRCA1 Associated RING-domain 1
CHK2 CHK2 checkpoint Homolog (Saccharomyces pombe) CstF Cleavage stimulation factor
CtIP CtBP-Interacting Protein NLS Nuclear localization signal
PCNA Proliferating Cell Nuclear Antigen RFC Replication Factor C
RSC Remodels the Structure of Chromatin
RT-PCR (real time) Reverse-Transcription Polymerase Chain Reaction (real time) WT Wild Type
