Zwick roell device
A B
Fig. 1 Apparecchiatura e schema relativo al calcolo del modulo elastico.
A. Immagine dell’apparecchiatura Zwick roell usata per lo svolgimento delle prove meccaniche in trazione e in compressione.
B. Schema rappresentativo dell’interpretazione delle curve ottenute dall’analisi della prova meccanica. Il modulo elastico è calcolato nel primo tratto lineare della curva stress-strain.
Fig. 2 Realizzazione e caratterizzazione meccanica dei polimeri sintetici A. Immagini rappresentative dei polimeri sintetici realizzati .
B. Grafico dei valori del modulo elastico dei polimeri sintetici considerati.
A
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
PLGA PCL Blend PLLA
Modulo elastico, MegaPa
B
PCL PLGA PLLA BLEND
genep ina
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85
Modulo elastico, kPa
0,1% gp (w/v) 0,2% gp (w/v)
NS
Concentrazione di gelatina (% p/v)
NS NS NS
NS NS
NS
NS
NS NS
NS
NS NS
NS
NS
C
A B
gelatina gelatina
gelatina gelatina Cross-linkaggio intramolecolare
Campioni gelatina- colagene 1:1-
genepina
2 2,5 3 5 coll 1:1 4 5 7,5 10
Fig. 3 Realizzazione e caratterizzazione meccanica dei campioni naturali a base di gelatina cross-linkata con genepina.
A. Schema del meccanismo di cross-linkaggio intramolecolare della gelatina con genepina. Il composto eterociclico della genipina lega i residui contenenti gruppi amminici primari della gelatina .
B. Immagine rappresentativa dei provini di gelatina-genepina polimerizzati all’interno di una multiwell da 24. I provini preparati con gelatina reticolata con genepina in presenza del collagene hanno un colore blu più chiaro.
C. Grafico della variazione del modulo elastico dei polimeri naturali in funzione della concentrazione di gelatina, cross-linkata con genepina sia allo 0,1% che allo 0,2% peso/volume (w/v) sottoposti a prove meccaniche in compressione. Nel grafico sono stati riportati con la sigla NS i valori non significativi, mentre tutti gli altri hanno dei valori statisticamente significativi (**:p<0,01).
Intensità di fluorescenza
Fig. 4 Andamento della crescita cellulare su polimeri sintetici analizzata con Alamar test a 1 giorno, 2, 3 e rispettivamente 7 giorni.
A. Foto dei nuclei delle C2C12 prese con il microscopio a fluorescenza con videocamera Olympus IX a 1 giorno rispettivamente 7 giorni dalla semina.
B. Il grafico mostra la crescita cellulare analizzata con Alamar test. Le cellule seminate sul blend sembrano ad avere un andamento simile al controllo in tutti i periodi dell’analisi. Le differenze non statisticamente significative presentano il simbolo(NS):
p>0,01.
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
1giorno 2gg 3gg 7gg
pcl plga plla blend ctrl
50um 50um
1 giorno
plla blend ctrl
pcl plga
Intensità di fluorescenza
50um
7 gg
A
B
NS NS NS
NS NS
NS NS
NS NS NS
NS NS
Fig. 5 Andamento della crescita cellulare C2C12 sui polimeri naturali.
Analisi della proliferazione cellulare mediante alamar blue assay a 1, 2, 3,7 giorni dalla semina in terreno di coltura, su controllo e su polimeri naturali con diversa stiffness. Le differenze statisticamente significative presentano il
simbolo(**): p<0,01.
0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 40000 45000 50000
1giorno 2gg 3gg 7gg
8,7±3 kPa 9,5±0,8 kPa 14,4± 5 kPa 17,8± 4 kPa 55,5± 4 kPa ctrl
** **
**
**
**
**
**
**
**
Intensità di fluorescenza
Fig 6. Analisi della crescita cellulare su polimeri di origine naturale attraverso la microscopia a fluorescenza.
A. Foto dei nuclei delle cellule C2C12 prese con il microscopio a fluorescenza con videocamera Olympus IX a 1 giorno rispettivamente 7 giorni dalla semina sui vetrini.
B. Grafico dell’andamento della crescita cellulare su polimeri naturali con diversi valori della stiffness ottenuto dalla conta dei nuclei marcati con il marcatore Hoechst 33258. L’analisi è stata effettuata a 1 giorno dalla semina, 2, 3 rispettivamente 7 giorni; (**: p<0,01).
A
0 500 1000 1500 2000 2500
1 giorno 2gg 3gg 7gg
cellule/mm2
3% 5%col 4% 5% 7.5% ctrl
**
1 giorno
8,7 ± 3 kPa 9,5±0,8 kPa
14,4 ± 5 kPa 17,8 ± 4 kPa 55,5 ± 4 kPa
ctrl
7 giorni
A
B
50um
** **
**
**
**
**
**
**
**
**
**
** **
**
**
**
**
**
**
** **
**
**
**
**
**
**
**
**
**
**
**
**
Illuminazione UV
Fotomaschera Fotoresist Wafer di silicone
Fotoresist con
microstruttura PDMS pre- trattato
Trattamento
Membrana di PDMS
a
b c
a= 50-100-200 µm (struttura) b= 100 µm (canale)
c= 40 µm
a b c
50 µm
d
50 µm
Fig . 7 Realizzazione dello scaffold di gelatina-genepina con pattern desiderato A. Descrizione schematica del processo di softlitografia applicato per ottenere gli scaffold con pattern desiderato.
B. Rappresentazione schematica delle dimensioni utilizzate per realizzare il pattern.
C. Immagini al microscopio ottico di strutture con pattern di gelatina-genepina realizzate con la softlitografia con porzione superiore di larghezza variabile, 50 µm (a) 100 µm (b) 200 µm (c) e struttura a gradiente 50-100-200 µm (d), altezza 40 µm, separate da un canale di 100 µm. La barra indica 50 µm.
A
B C
F-ACTIN; Hoechst; f-ACTIN
200 µm 100 µm 50µm- 200 µm
a b c
50 µm
Fig. 8 Immagini rappresentative della coltura cellulare C2C12
A. Immagine rappresentativa della coltura delle cellule C2C12 su scaffold di polimeri naturali con nanostruttura (a) 50 µm -200 µm (b) 100 µm (c) 200 µm e aventi un modulo elastico di 12 kPa. Con il verde è rappresentata la F- actina mentre con il blu i nuclei. La barra è di 100 µm. La fraccia in giallo indica l’orientamento del citoscheletro.
B. Immagine al microscopio ottico della coltura delle cellule C2C12 a 4 giorni dalla semina su scaffold con l’ampiezza delle strisce (a) 50 µm (b) 100 µm (c) 200 µm. Le barra indica 50 µm.
A
B
a
b
c
0 0,5 1 1,5 2 2,5
50 um 100 um 200 um canale 100um
Rapporto della distribuzione cellulare su struttura/canale
**
**
Rapporto cellulare struttura/canale
Fig. 9 Rapporto della distribuzione cellulare su struttura-canale
Il grafico mostra il rapporto del numero delle cellule distribuite sulle strutture e sul canale. Dal grafico si può notare una netta preferenza delle cellule verso la struttura di grandezza 200 µm. La differenza risulta ad essere significativa sia rispetto alla struttura di larghezza 100 µm, sia rispetto al canale di 100 µm. (**), P <0,01.
0 10 20 30 40 50 60
0-10 10-20 20-30 30-40 40-50 50-60 60-70 70-80 80-90
Conta cellulare normalizzata (%)
Il grado di orientamento dei nuclei
canale 50 um 100 um 200 um senza pattern
** ** **
**
**
Fig. 10 Il grado di orientamento delle cellule su strutture allineate e non allineate.
Il grafico mostra il grado di orientamento dei nuclei delle cellule C2C12 dopo 4 giorni dalla semina su scaffold senza nanostruttura e su scaffold con strisce di larghezza 50-100-200 µm, divise da una canale di 100 µm ed avente un’altezza di 40 µm. Il grado di orientamento è stato definito come angolo formato tra l’asse maggiore del nucleo e l’asse l’asse della striscia. Gli angoli compresi tra i valori di 0°- 10° sono considerati perfettamente allineati. Allineamento nucleare è espresso come percentuale di cellule (%) mostrando incrementi di 10° rispetto all'orientamento nucleare preferito. (**): P <0,01.
** **
**
**
** ** **
** **
** ** ** **
Fig. 11 Indice di forma delle cellule su strutture allineate e non allineate e rapporto del numero cellulare su struttura/canale.
Il grafico mostra l’indice di forma delle cellule calcolato per valutare l’allungamento cellulare. I dati mostrano che il canale a 200 µm presenta il valore più basso, mentre il valore più alto è dato dal canale di larghezza 100 µm. (**), P <0,01.
Indice di forma
Grandezze struttura-canale
0,805 0,81 0,815 0,82 0,825 0,83 0,835 0,84 0,845 0,85 0,855
canale 50 um 100 um 200 um senza struttura
Ellitticità
**
**
**
**
