Le Bande Oligoclonali nel Percorso Diagnostico di Sclerosi Multipla: l'Esperienza Ventennale del Laboratorio della Clinica Neurologica

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UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI GENOVA

SCUOLA DI SCIENZE MEDICHE E FARMACEUTICHE

Tesi di Laurea Magistrale in Medicina e Chirurgia

Le Bande Oligoclonali nel

Percorso Diagnostico di Sclerosi Multipla: l'Esperienza Ventennale

del Laboratorio della Clinica Neurologica

RELATORE CANDIDATO

Prof. Maria Matilde Inglese Joana Liti

Matricola 4287362

CORRELATORE

Dott.ssa Elisabetta Capello

ANNO ACCADEMICO 2020/2021

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INDICE

INTRODUZIONE ... 2

LA SCLEROSI MULTIPLA ... 2

SINTOMI DI SCLEROSI MULTIPLA ... 4

DECORSO DELLA SCLEROSI MULTIPLA ... 4

DIAGNOSI DI SCLEROSI MULTIPLA ... 5

PROGNOSI DELLA SCLEROSI MULTIPLA ... 8

TRATTAMENTO DELLA SCLEROSI MULTIPLA ... 8

LIQUOR ... 11

RACHICENTESI ... 11

ESAME DEL LIQUOR ... 12

CENNI STORICI SULLE BANDE OLIGOCLONALI ... 17

MATERIALI E METODI ... 18

SCOPO DELLA RICERCA ... 18

ESAME CITOCHIMICO DEL LIQUOR ... 19

DOSAGGIO DEL GLUCOSIO ( GLICORRACHIA) E PROTEINE (PROTEINORACCHIA) ... 19

ESAME IMMUNOCHIMICO DEL LIQUOR ... 20

IMMUNOBLOT SU LIQUOR E SIERO ... 21

STATISTICA ... 21

DISCUSSIONE ... 37

CONCLUSIONI ... 39

BIBLIOGRAFIA ... 40

RINGRAZIAMENTI ... 42

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INTRODUZIONE

LA SCLEROSI MULTIPLA

La sclerosi multipla è una malattia autoimmune e neurodegenerativa dove vengono danneggiate o distrutte delle porzioni di mielina, e le fibre nervose sottostanti nel cervello, nei nervi ottici e nel midollo spinale esitando cicatrici biottiche da demielinizzazione (placche).

La causa per cui avvengono queste demielinizzazioni delle fibre nervose è sconosciuta, ma può implicare un attacco da parte del sistema immunitario contro i tessuti del corpo quindi una reazione autoimmune.

Alcuni dei sintomi che possono essere problemi di vista e sensazioni anomale e i movimenti possono essere deboli e impacciati.

Di solito l’aspettativa di vita non viene compromessa, a meno che la malattia non sia molto grave.

Il termine “sclerosi multipla” si riferisce alle molte zone di cicatrizzazione (sclerosi) che derivano dalla distruzione dello strato lipidico che avvolge i nervi (guaina mielinica) nel cervello e nel midollo spinale. Questa distruzione è chiamata demielinizzazione. A volte vengono danneggiate anche le fibre nervose che inviano i messaggi (assoni). Con il tempo, le dimensioni del cervello possono ridursi a causa della distruzione degli assoni.

(Michael C. Levin 2021)

Le ricerche epidemiologiche stimano in circa 3 milioni le persone con SM nel mondo, di cui circa 50.000 solo in Italia. In pratica viene colpito un abitante ogni 1.200, con un “ picco” di uno ogni 700 in Sardegna. I nuovi casi in Italia sono circa 1.800 ogni anno.

(Battaglia & A.I.S.M. (Associazione italiana sclerosi multipla), 2000)

Gli studi descrittivi dimostrano che la SM ha una distribuzione geografica disomogenea in quanto la sua frequenza varia notevolmente in diverse parti del mondo e anche nell’ambito dello stesso Paese, apparentemente in rapporto alla latitudine. Sembra che la SM, seguendo un gradiente decrescente dai poli verso l’equatore, sia frequente nelle regioni a clima temperato e meno comune nei tropici, nelle regioni sub-tropicali e nelle aree molto fredde. Nel complesso la SM sembra interessare maggiormente i Paesi

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3 dell’Europa centro-settentrionale e le regioni extra-europee. Dagli studi sulla prevalenza della SM finora condotti nel nostro Paese, sembra emergere che la malattia sia distribuita abbastanza omogeneamente su tutto il territorio nazionale, ma con valori particolarmente elevati in Sardegna. (Battaglia & A.I.S.M. (Associazione italiana sclerosi multipla), 2000)

Più comunemente la sclerosi multipla insorge tra i 20 e i 40 anni, ma può iniziare in qualsiasi momento tra i 15 e i 60 anni. Colpisce maggiormente le donne con un rapporto di 2 a 1. Il rischio di sviluppare questa patologia in genere aumenta in funzione al livello parenterale con la persona affetta. Tale aumento è di circa 30 volte per gemelli monozigoti, 5 per gemelli dizigoti, 3 per fratelli, da 2 a 5 volte per figli. (Battaglia & A.I.S.M.

(Associazione italiana sclerosi multipla), 2000) La sclerosi multipla è poco comune nei bambini.

La maggior parte delle persone con sclerosi multipla ha periodi di relativo benessere (remissione) che si alternano a periodi di peggioramento dei sintomi (riacutizzazioni o recidive). Le recidive possono essere lievi o invalidanti. Il recupero durante la remissione è buono ma spesso incompleto. Nonostante ciò, la sclerosi multipla peggiora lentamente nel tempo. (Michael C. Levin 2021)

La causa della sclerosi multipla non è nota, ma una spiegazione plausibile potrebbe essere che le persone siano esposte nei primi periodi di vita a un virus (probabilmente l’herpesvirus o il retrovirus) o a sostanze sconosciute che in qualche modo stimolano un attacco del sistema immunitario contro i tessuti del corpo stesso (reazione autoimmune). Questa reazione autoimmune porta ad un’infiammazione, che danneggia la guaina mielinica e le fibre nervose sottostanti.

I geni sembrano avere un ruolo importante nella sclerosi multipla quindi, il fatto di avere un genitore o un fratello/sorella affetto da sclerosi multipla aumenta il rischio di contrarre la malattia. (Michael C. Levin 2021)

L’ambiente è importante nella sclerosi multipla. Il luogo in cui le persone trascorrono i primi 15 anni della loro vita influisce sulle probabilità di svilupparla.

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SINTOMI DI SCLEROSI MULTIPLA

I sintomi della sclerosi multipla variano da una persona ad un’altra e da un periodo ad un altro , perché bisogna considerare quali fibre nervose vengono demielinizzate:

• Se le fibre nervose che trasportano le informazioni sensoriali si demielinizzano, ne derivano problemi con le sensazioni (sintomi sensoriali).

• Se le fibre nervose che trasportano i segnali ai muscoli si demielinizzano, ne risultano problemi con il movimento (sintomi motori). (Michael C. Levin 2021)

DECORSO DELLA SCLEROSI MULTIPLA

La sclerosi multipla può progredire e regredire in modo imprevedibile. Tuttavia, esistono diversi andamenti tipici dei sintomi: (Michael C. Levin 2021)

• Andamento recidivante remittente: le recidive (quando i sintomi si aggravano) si alternano alle remissioni (quando i sintomi si riducono o non si aggravano). Le remissioni possono durare mesi o anni. Le recidive possono manifestarsi spontaneamente o possono essere scatenate da un’infezione, come l’influenza. (Michael C. Levin 2021)

• Andamento progressivo primario: la malattia progredisce gradatamente senza remissioni o recidive ovvie, anche se possono esserci fasi temporanee durante le quali la malattia non progredisce. (Michael C. Levin 2021)

• Andamento progressivo secondario: questo andamento inizia con recidive che si alternano a remissioni (l’andamento recidivante-remittente), seguite da una progressione graduale della malattia. (Michael C. Levin 2021)

In media, se i pazienti non dovessero essere trattati, i soggetti hanno una recidiva ogni circa 2 anni, ma la frequenza può variare di molto.

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5 La demilielinizzazione può strutturarsi biologicamente senza evidenze cliniche, non raro ad oggi la gestione clinica di pazienti del tutto asintomatici come nelle sindromi radiologicamente isolate (RIS).

Frequente l’esordio con calo del visus, sotteso da neurite ottica

Frequenti anche i dolori parossistici, che possono assumere i seguenti aspetti:

a) nevralgia trigeminale: è indistinguibile dalla nevralgia «essenziale», se non per l’età̀ di insorgenza (giovanile), la frequente bilateralità̀ e l’eventuale presenza di altri segni della malattia; (Fazio Loeb et al, 2003)

b) segno di Lhérmitte: si nota maggiormente quando viene colpita la parte posteriore del midollo spinale nel collo, sono sensazioni folgoranti tipo «scossa elettrica» a carattere per lo più̀ sgradevole ma, talora, anche intensamente doloroso, che si irradiano lungo il corpo e gli arti in seguito a movimenti di flessione del capo. Questo segno è presente in circa il 40% dei malati con sclerosi multipla. Poi ci potrebbe essere una perdita della forza o della destrezza in una gamba o una mano che può irrigidirsi. (fazio loeb et al, 2003)

Qualsiasi sistema funzionale, dal piramidale al cerebellare, può essere espressivo di attività di malattia, pertanto un paziente giovane che giunge per disturbi di forza, coordinazione, sensibilità, che perdurano e progrediscono per più di 72 ore deve essere sempre indagato in tal senso.

DIAGNOSI DI SCLEROSI MULTIPLA

Dal momento che i sintomi sono molto vari, non è facile riconoscere la malattia ai suoi esordi. Si sospetta la sclerosi multipla nei giovani che sviluppano improvvisamente vista offuscata o doppia, oppure problemi di movimento o sensazioni anomale in varie parti del corpo non correlate. La variabilità dei sintomi e un modello di recidive e remissioni sostengono la diagnosi.. (Michael C Levin 2021)

Quando c’è sospetto di sclerosi multipla, si deve effettuare un’attenta valutazione neurologica. In seguito bisogna esaminare la retina. Il disco ottico (il punto in cui il nervo ottico si unisce alla retina) può essere insolitamente pallido, il che indica un danno al nervo ottico.

Si possono effettuare diversi esami per riconoscere la presenza della sclerosi multipla in un paziente:

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• La risonanza magnetica per immagini (RMN): è l’esame di diagnostica per immagini migliore per rilevare la sclerosi multipla. Solitamente consente di individuare le aree di demielinizzazione nel cervello e nel midollo spinale.

Tuttavia, la RMN non riesce a stabilire se la demielinizzazione sia in corso da lungo tempo e sia stabile oppure se sia molto recente e stia ancora progredendo.

Per ovviare a questo problema si ricorre alla RMN con gadolinio, che è un mezzo di contrasto paramagnetico, nel flusso sanguigno. Il gadolinio aiuta a distinguere le aree di demielinizzazione recenti di quelle più vecchie. Questo aiuta a pianificare il trattamento. Alcune volte la sclerosi multipla viene individuata quando viene eseguita una risonanza magnetica per altri motivi, prima ancora che provochi qualunque sintomo.

• La rachicentesi (puntura lombare): viene prelevato un campione di liquido cerebrospinale per essere analizzato. Il contenuto di proteine del liquido può essere superiore al normale. La concentrazione di anticorpi può essere alta e viene rilevato un pattern specifico di anticorpi alla corsa elettroforetica (chiamato fascia oligoclonale) nella maggior parte delle persone con sclerosi multipla. (Michael C Levin 2021)

• Le risposte evocate: per questo esame vengono usati degli stimoli sensoriali, come luci lampeggianti, per attivare alcune aree del cervello, e vengono registrate le risposte elettriche cerebrali. Nelle persone con sclerosi multipla, la risposta del cervello agli stimoli può essere lenta perché le fibre nervose demielinizzate non sono in grado di condurre normalmente i segnali. Questo esame può anche rilevare un danno leggero e asintomatico al nervo ottico.

(Michael C Levin 2021)

Va da se l’importanza della diagnosi precoce di malattia per permettere l’avvio della terapia modificante il decorso e rallentare la progressione.

Fondamentalmente la diagnosi si articola, come abbiamo già detto, su RMN del nevrasse ed esame liquorale.

Negli ultimi decenni si sono succedute delle linee guida internazionali, che hanno indirizzato il clinico al percorso diagnostico.

I criteri di Mc Donald, l’autore che li ha proposti e rivisti, sono stati proposti per la prima volta nel 2001 e da allora sono stati revisionati tre volte, nel 2005, nel 2010 e nel 2017.

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7 I criteri di McDonald del 2010 hanno posto poca enfasi sull’importanza delle bande oligoclonali liquorali per la diagnosi di SM, sebbene esse siano state riconosciute come indicatore accurato della sintesi di IgG intratecali e quindi come valido supporto diagnostico. (Capone & Zuliani, 2018)

Però nel 2017 sono state reintrodotte, infatti esse ora possono sostituire la disseminazione temporale (DIT) in una sindrome clinicamente isolata (CIS) in cui sia stata già dimostrata la disseminazione spaziale (DIS). Esistono prove sufficienti che, negli adulti con CIS, controllando per variabili cliniche, demografiche e radiologiche, le bande oligoclonali sono un perditore indipendente di una seconda ricaduta. (Capone & Zuliani, 2018)

Il Panel raccomanda che, con una presentazione tipica di CIS, la soddisfazione dei criteri clinici o di RM per la DIS, e in assenza di una spiegazione alternativa, la dimostrazione della presenza di bande oligoclonali liquorali consente una diagnosi di SM anche se i risultati della RM al basale non soddisfano i criteri per la DIT e in assenza di un secondo attacco o di una nuova lesione o attività di malattia all'imaging seriato. Ciò consente di considerare le bande oligoclonali in sostituzione della DIT. (Capone & Zuliani, 2018)

Nei criteri di McDonald del 2017, il Panel raccomanda l’esecuzione di una puntura lombare nei seguenti casi:

• in presenza di un’inequivocabile evidenza clinico-radiologica di SM;

• quando vi è una presentazione non classica, inclusa la SM progressiva;

• quando vi è una presentazione clinica, radiologica e laboratoristica atipica per SM;

• in popolazioni specifiche

(Capone & Zuliani, 2018)

In fine bisogna dire che i criteri di McDonald non sono stati sviluppati per differenziare la SM da altre malattie, ma per individuare la patologia in soggetti con CIS che è tipica quando vengono escluse tutte le altre conclusioni.

L’esame liquorale, almeno in Europa non è mai stato minimizzato dalle indicazioni del panel americano.

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8 Possiamo pertanto dire che la diagnosi di SM si fonda ancora dopo più di un secolo sull’esame liquorale.

PROGNOSI DELLA SCLEROSI MULTIPLA

Gli effetti della sclerosi multipla e la rapidità con la quale progredisce variano notevolmente e in modo imprevedibile. Le remissioni possono durare da mesi a 10 anni o più. Tuttavia, alcune persone, come gli uomini che sviluppano la malattia nella mezza età e che hanno attacchi frequenti, possono diventare rapidamente disabili.

Ciononostante, circa il 75% delle persone con sclerosi multipla non ha bisogno di una sedia a rotelle nell’arco della vita e per il 40% non c’è interruzione delle attività. (Michael C Levin 2021)

TRATTAMENTO DELLA SCLEROSI MULTIPLA

La sclerosi multipla viene trattata di solito con corticosteroidi, ma possono essere anche utilizzati farmaci che aiutano ad evitare che il sistema immunitario attacchi la propria guaina mielinica L’efficacia dei vari trattamenti dipende grandemente sia dal decorso della malattia che dalle caratteristiche individuali del singolo paziente .

Corticosteroidi

Per un attacco acuto, generalmente vengono utilizzati i corticosteroidi. Probabilmente agiscono sopprimendo il sistema immunitario. Vengono somministrati per brevi periodi per calmare i sintomi immediati (come la perdita di vista, forza o coordinazione) se questi interferiscono con le funzionalità. Ad esempio, il prednisone può essere assunto per via orale, oppure il metilprednisolone può essere somministrato per via endovenosa.

Anche se i corticosteroidi possono ridurre le recidive e rallentare la progressione della sclerosi multipla, non la interrompono. (Michael C Levin 2021)

I corticosteroidi sono usati raramente per un lungo periodo perché possono avere molti effetti collaterali, come aumento di sensibilità alle infezioni, diabete, aumento di peso, affaticamento, osteoporosi e ulcere. I corticosteroidi sono iniziati e interrotti in base alle necessità. (Michael C Levin 2021)

Vengono anche utilizzati farmaci che possono aiutare a evitare che il sistema immunitario attacchi le guaine mieliniche. Questi farmaci aiutano a ridurre il numero di recidive future. (Michael C Levin 2021) In questa categoria ci sono:

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• L’interferone beta, viene somministrato per iniezione, riduce la frequenza delle recidive e può contribuire a ritardare l’invalidità. (Michael C Levin 2021)

• Il glatiramer acetato, somministrato per iniezione, può avere benefici simili per le persone con sclerosi multipla lieve precoce. (Michael C Levin 2021)

• Il natalizumab è un anticorpo monoclonale somministrato mediante infusione endovenosa una volta al mese. È più efficace di altri farmaci nel ridurre il numero di recidive e nel prevenire un danno ulteriore al cervello.

Tuttavia, il natalizumab può aumentare il rischio di un’infezione rara e letale dell’encefalo e del midollo spinale (Leucoencefalopatia Multifocale Progressiva PML). (Michael C Levin 2021)

• Fingolimod, ozanimod, siponimod, teriflunomide, cladribina e dimetilfumarato sono stati segnalati casi di PML anche per fingolimod e dilmetilfumarato, anche se in numero significativamente inferiore rispetto al natalizumab. Possono essere usati per trattare la sclerosi multipla che si manifesta con andamento recidivante. Questi farmaci possono essere assunti per via orale. Il fingolimod e il dimetilfumarato aumentano inoltre il rischio di leucoencefalopatia multifocale progressiva, nonostante il rischio sia molto inferiore rispetto a natalizumab. (Michael C Levin 2021)

• L’ocrelizumab è un anticorpo monoclonale usato per trattare la sclerosi multipla con andamento recidivante o progressivo primario. Viene somministrato come infusione endovenosa ogni 6 mesi. Può causare reazioni all’infusione, che possono comprendere eruzione cutanea, prurito, difficoltà respiratorie, edema della gola, capogiri, ipotensione arteriosa e tachicardia. (Michael C Levin 2021)

• L’alemtuzumab (usato per trattare la leucemia), un altro anticorpo monoclonale, è efficace nel trattamento della sclerosi multipla con andamenti recidivanti (andamento recidivante-remittente e recidivante progressivo) e viene somministrato per via endovenosa. Tuttavia, aumenta il rischio di gravi disturbi autoimmuni e di alcuni tipi di tumore. Di conseguenza, alemtuzumab viene solitamente usato solo quando il trattamento con due o più altri farmaci si è rivelato inefficace. (Michael C Levin 2021)

La ciclofosfamide,, può ridurre la frequenza delle recidive e rallentare la progressione della malattia. Viene somministrato solo quando altri farmaci

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10 non funzionano e, in genere, solo per un massimo di 2 anni perché alla lunga può causare danni cardiaci. (Michael C Levin 2021.

Quando l’escalating therapy non riesce a fermare l’attività di malattia si può ricorrere al trapianto di cellule staminali ematopoietiche (ASCT) che consiste in intensa immunosoppressione seguite da rinfusione delle cellule staminali ematopoietiche precedentemente prelevate al paziente. In tal modo si ottiene un reset del sistema immunitario e un controllo a lungo termine dell’attività di malattia. Tale approccio terapeutico è evidentemente molto delicato e potenzialmente gravato da importanti eventi avversi nella fase di aplasia midollare. Nella casistica italiana tuttavia la mortalità si attesta al di sotto del 2%.

In ogni momento dell’evoluzione clinica di malattia non meno importante è l’utilizzo della terapia sintomatica, che consente, almeno in parte, di migliorare la qualità di vita del paziente. Vengono più utilizzati i farmaci che modulano la spasticità, il dolore e la vescica neurologica.

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LIQUOR

Il liquor (o liquido cerebrospinale), è un secreto plasmatico prodotto dai plessi corioidei dei ventricoli cerebrali, che diffonde dalle cavità ventricolari agli spazi subaracnoidei encefalici e spinali ed è riassorbito in massima parte dal seno longitudinale superiore.

(Loeb et al, 2003)

RACHICENTESI

È la tecnica più̀ utilizzata per misurare la pressione del liquor e raccoglierne un campione sufficiente per l'analisi. Di norma la rachicentesi deve essere eseguita in pazienti digiuni da almeno 6 ore.

La posizione del paziente è molto importante per una rapida corretta esecuzione dell'esame. Il paziente dev'essere posto sulla sponda di un letto rigido in decubito laterale destro, con il dorso perpendicolare al piano del letto, ed in posizione genupettorale, onde aumentare al massimo la distanza interapofisaria. Sono necessari dei cuscini adeguati per mantenere il capo in asse ed il dorso perpendicolare, è anche molto utile un secondo operatore che aiuti a mantenere il capo stabile e gli arti in flessione. Spesso però è necessario ricorrere alla posizione seduta (quella più comunemente vista nei reparti) con iperflessione del capo e degli arti inferiori, dorso a filo della sponda del letto e cuscino premuto sull'addome: in tal caso, la misurazione della pressione liquorale, inficiata dall'ortostatismo, perde gran parte del suo significato.

La puntura è di regola effettuata nell'interspazio fra le apofisi spinose L3-L4, ma in caso di difficoltà (grave osteoartrosi con deformità̀ della colonna) si prestano altrettanto bene gli interspazi sottostanti (L4-L5) o, nell'adulto, sovrastanti ma non più̀ rostrali di L2-L3, dato il rischio di lesioni midollari accidentali. (Loeb et al, 2003)

Gli aghi da rachicentesi sono lunghi circa 8 cm., hanno calibro n° 18 o 22, sono muniti di mandrino e hanno punta obliqua tagliente, per cui, onde evitare una sezione trasversale delle fibre longitudinali della dura madre con formazione di fistola liquorale, il taglio dell'ago deve mantenersi parallelo all'asse della colonna. (Loeb et al, 2003)

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12 Per l'esame analitico è sufficiente estrarre complessivamente 5-10 ml di liquor in 2-3 quote sequenziali raccolte in provette sterili, numerate in ordine progressivo. Dopo la rachicentesi il paziente è posto per una mezzora o un’ora in posizione prona per favorire la chiusura dell'eventuale breccia durale e possibilmente minimizzare il rischio di cefalea post- rachicentesi.

Poiché́ questa complicanza transitoria insorge assumendo la posizione eretta, e si manifesta quasi esclusivamente negli adulti, è stata avanzata l'ipotesi che dipenda essenzialmente dallo spostamento di liquor verso il compartimento subaracnoideo spinale causato dalla posizione ortostatica (con conseguente iperpulsatilità dei vasi venosi cerebrali), anziché́, come comunemente ritenuto, dall'ipotensione liquorale conseguente al prelievo (o da un'eventuale esito in liquorale). Il prelievo liquorale dev'essere di regola affiancato da un prelievo di sangue venoso. (Loeb et al, 2003)

ESAME DEL LIQUOR

ASPETTO

Il liquor cerebrospinale ha un peso specifico solo lievemente superiore a quello dell'acqua distillata e risulta limpido ed incolore, queste sono le caratteristiche del liquor non patologico.

La trasparenza del liquor si modifica proporzionalmente all'aumento delle cellule liquorali, o pleiocitosi (ipercitosi liquorale). Invece la fluidità si riduce nelle sindromi da iperviscosità liquorale per eccesso di particolari ed abnormi soluti liquorali. Le modificazioni patologiche del colore possono dipendere da una contaminazione da parte di eritrociti o pigmenti ematici, o da contaminazione da parte di leucociti e costituenti batterici.

L’aspetto ematico è dato da una contaminazione eritrocitaria che conferisce al liquor un colore rossastro più o meno marcato, da lievemente rosato ad un colore rosso-vino intenso. La presenza di sangue nel liquor può essere un fenomeno del tutto accidentale, causato dalla puntura di un vaso intratecale durante l'inserimento dell'ago da rachicentesi. (Loeb et al, 2003)

Però in quest’ultimo caso, frazionando la raccolta del liquor in più provette, l'intensità del colore generalmente decresce dalla prima provetta all'ultima e, dopo centrifugazione e sedimentazione degli eritrociti, il sopranatante risulta limpido ed incolore. L’aspetto xantocromico è invece un indice di emolisi, che indica una permanenza del sangue nel liquor sufficientemente prolungata da permettere lisi degli eritrociti e la formazione di

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13 metaboliti pigmentati dell'emoglobina di colore giallo-brunastro. L’aspetto purulento del liquor comprende un’intensa torbidità e colore grigio o giallo-verdastro, ed è rapportabile all'elevato numero di leucociti, batteri e pigmenti da essi eventualmente prodotti. (Loeb et al, 2003)

CELLULE

Sono sempre di provenienza ematica. Normalmente si tratta di linfociti (60-70%) e monociti (40-30%) che attraversano le cellule endoteliali del capillare cerebrale, grazie al processo di emperipolesi, cioè migrazione transcellulare di leucociti in vacuoli giganti dal versante luminale a quello abluminale della cellula endoteliale. Normalmente e nell'adulto, il liquor non contiene più di 5 cellule per mm3. Valori tra 6 e 10 si considerano anormali; più di 10 cellule per mm| rappresentano un reperto sicuramente patologico. Il semplice conteggio può essere integrato da tecniche citologiche più sofisticate e precise.

Lo studio citomorfologico dei preparati allestiti per sedimentazione o citocentrifugazione e colorazioni istologiche consente di riconoscere la natura delle cellule liquorali, identificando eventuali elementi neoplastici o particolarmente caratteristici di determinate condizioni, quali macrofagi fagocitanti eritrociti o contenenti granuli emosiderinici nel caso di pregresse emorragie. Lo studio immunocitochimico del sedimento liquorale consente poi di identificare mediante gli anticorpi monoclonali i diversi fenotipi cellulari. (Loeb et al, 2003)

GLUCOSIO

Proviene solo dal sangue e la sua concentrazione dipende da quella plasmatica e dal metabolismo glucidico del tessuto nervoso. Nei soggetti normoglicemici, la glicorrachia varia da 0,45 a 0,8 g per litro. Il rapporto glicorrachia/ glicemia è normalmente compreso tra 0.6- 0.7, ed a scopo clinico esso risulta più importante della glicorrachia assoluta, dato che l'iperglicemia, entro certi limiti, comporta un certo aumento della glicorrachia.

Entrambe, quindi, devono essere determinate effettuando la rachicentesi a digiuno. In caso di iperglicemia elevata, tuttavia, l'eccesso di substrato può paradossalmente causare una saturazione del trasportatore del glucosio ed una conseguente riduzione del rapporto glicorrachia/glicemia fino a 0,4. Questo sottolinea ulteriormente l'importanza della valutazione contemporanea di glicemia e glicorrachia.(Loeb et al, 2003)

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14 PROTEINE

Quasi tutte le proteine presenti nel liquor derivano dal plasma, salvo alcune frazioni di sintesi intratecale. La transtiretina o prealbumina, deputata al trasporto della tiroxina e della proteina legante il retinolo, viene sintetizzata sia nel fegato che nei plessi corioidei, il che spiega perché́ la sua concentrazione liquorale sia percentualmente più̀ alta di quella plasmatica. La concentrazione normale di proteine nel liquor lombare dell'adulto è tra 0.2 - 0.5 g per litro. L'aumento delle proteine liquorali, o iperproteinorrachia, è sempre patologico e contraddistingue molte malattie neurologiche, esprimendo in modo aspecifico l'esistenza di un danno anatomico o funzionale delle strutture di barriera.

Peraltro, anche la stessa iperproteinorrachia, superati certi valori, può rallentare il riassorbimento aracnoideo delle proteine, per cui nelle meningiti purulente o in altre condizioni con elevati livelli di proteine liquorali si può instaurare un "circolo vizioso" che tende progressivamente ad aggravare il quadro. (Loeb et al, 2003)

Per esempio l’iperproteinorrachia lieve o moderata (dai 0,5 - 1 g per litro) si può osservare nella sclerosi multipla e non solo. (Loeb et al, 2003)

La determinazione della proteinorrachia totale, anche se indispensabile, fornisce delle informazioni diagnostiche aspecifiche e parziali. Soprattutto nelle malattie neurologiche infiammatorie o a patogenesi immunitaria, il SNC dimostra di essere in grado di comportarsi da organo immunocompetente, di suscitare risposte immunitarie autonome o intratecali in tutto o in parte indipendenti da quelle dell'immunità sistemica. (Loeb et al, 2003)

IMMUNOGLOBULINE E ALBUMINA

Queste risposte autoctone caratterizzano le meningiti virali, la sclerosi multipla, le malattie neurologiche associate all'HIV, e comportano alti livelli liquorali di vari "markers" di attivazione immunitaria (citochine, neopterina, interferoni). Queste condizioni sono contraddistinte da una sintesi intratecale di immunoglobuline di classe G (IgG), A (IgA), M (IgM), indice diagnostico oggi universalmente considerato irrinunciabile in molte condizioni infiammatorie. La sintesi intratecale di immunoglobuline può essere dimostrata quantitativamente tramite dosaggio nel liquor, o qualitativamente mediante tecniche elettroforetiche. Il dosaggio quantitativo delle singole frazioni proteiche liquorali è effettuato mediante immunonefelometria (albumina, IgG e IgA), tecnica ELISA (IgM) o RIA (IgD e IgE). Queste due ultime frazioni hanno una concentrazione liquorale minima

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15 e l'utilità della loro determinazione nella pratica clinica corrente non è ancora stata definita. (Loeb et al, 2003)

Nel nostro laboratorio di neurologia comunque per il momento vengono dosate solo le IgG che sono quelle più significative a scopo clinico perché sono la frazione maggiormente rappresentata. Tuttavia l'aumento della concentrazione liquorale di immunoglobuline da sola non è sufficiente a definire l'esistenza di una risposta immunitaria intratecale. (Loeb et al, 2003)

L'interpretazione di una iperglobulinorachia richiede quindi la disponibilità di parametri aggiuntivi, quali concentrazione delle immunoglobuline plasmatiche e stato della barriera ematoencefalica. Quest'ultimo è espresso abbastanza fedelmente dal rapporto Albumina Liquor/Albumina Siero. L'albumina, infatti, è sintetizzata solo nel fegato, per cui tutta l'albumina liquorale è di origine ematica. L'innalzamento dei livelli liquorali di albumina, espresso dall'aumento del valore di “Albumin Ratio”, può quindi dipendere soltanto da un danno della barriera ematoencefalica. Su questo assunto si basa l'indice di IgG liquorale o Indice di Link derivato dalla formula: (IgGLiquor/IgG siero): (Albumina Liquor/Albumina Siero). I valori normali non sono superiori a 0,69: qualunque innalzamento di questo parametro esprime sintesi intratecale di IgG. (Loeb et al, 2003)

La sintesi intratecale di IgG si osserva in più̀ dell'80% dei casi di sclerosi multipla definita.

(Loeb et al, 2003)

Sintesi intratecale di IgA ed IgM, spesso concomitante a quella di IgG, si può̀ osservare nella sclerosi multipla, ma il reperto è più̀ frequente nelle condizioni infettive con predominante risposta IgM nelle fasi più̀ acute. (Loeb et al, 2003)

L’analisi qualitativa delle immunoglobuline è basata su tecniche elettroforetiche che ci permettono di separare le varie frazioni proteiche in rapporto al loro peso molecolare e carica elettrica o in alternativa, in funzione del loro punto isoelettrico. Quest’ultima tecnica permette alle immunoglobuline di migrare e raccogliersi in distinte "bande oligoclonali"

corrispondenti ai relativi, specifici pI. Le bande oligoclonali (BO) possono essere visualizzate direttamente, o essere trasferite ed adsorbite su nitrocellulosa e quindi identificate e visualizzate immunochimicamente ("immunoblot"). A tale scopo il foglio di nitrocellulosa è incubato in soluzioni di anticorpi anti- IgG umane coniugate con HRP (perossidasi), e gli immunocomplessi formatisi sono infine rivelati mediante reazione enzimatica con idonei cromogeni. L'immunoblot è stato indicato come il metodo più

(17)

16 adeguato per identificare la presenza di BO nel liquor. L'immunoblot, permette di visualizzare soltanto quelle bande a cui l'anticorpo specifico primario si è legato, e che corrispondono quindi per certo ad immunoglobuline di classe IgG. (Loeb et al, 2003)

Il reperto di BO di IgG caratterizza il 90% dei casi di sclerosi multipla. Una peculiarità della sclerosi multipla è che, nello stesso paziente, il tracciato delle BO liquorali resta immodificato nel tempo.(Loeb et al, 2003)

a b c

(Loeb et al, 2003)

Fig1 Immunoblot su gel di agarosio delle proteine liquorali e sieriche visualizzate con anticorpi anti-IgG umane coniugate con perossidasi e reazione cromogena. Si osservano in sequenza: a) tracciato normale (bande oligoclonali assenti su liquor e siero); b) bande oligoclonali presenti solo su liquor; c) bande oligoclonali liquor-siero con aspetto speculare. (Loeb et al, 2003)

Mentre nelle malattie infettive le immunoglobuline che costituiscono le bande sono quasi esclusivamente costituite da anticorpi specifici contro l'agente eziologico, nella sclerosi multipla la specificità anticorpale di gran parte delle bande oligoclonali è ignota, e si ritiene che esse esprimano una risposta immunitaria plasmacellulare aspecifica, che è una conseguenza e non è una causa della disregolazione immunitaria che sta alla base della malattia. (Loeb et al, 2003)

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17

CENNI STORICI SULLE BANDE OLIGOCLONALI

Le bande IgG oligoclonali sintetizzate per via intratecale nel liquido cerebrospinale sono il segno immunologico della sclerosi multipla. (Holmøy, 2009) La scoperta di queste bande oligoclonali può risalire al 1959, sono state scoperte applicando le tecniche elettroforetiche. Per dire se le frazioni di IgG che appaiono come BO fossero intratecali oppure no, bisogna includere i campioni di siero cosa che non facevano all’inizio Lowenthal, van Sande e Karcher (che studiavano le BO). Quello che ha sottolineato l’importanza di mettere a confronto i pattern di BO di siero e liquor è stato Laterre.

Quest’ultimo ha anche dimostrato che le bande oligoclonali sintetizzate per via intratecale erano rilevabili con l’elettroforesi su agar nell’86,9% dei pazienti con sclerosi multipla certa. (Holmøy, 2009)

La base per la mobilità elettroforetica variabile delle bande oligoclonali (BO) è che le sequenze di amminoacidi variano tra le regioni costanti di diverse sottoclassi di IgG e anche tra le regioni variabili (idiotipi) delle molecole di IgG prodotte da diversi cloni di cellule B. Le differenze nella glicosilazione e nelle modifiche post-traduzionali possono aggiungere ulteriore eterogeneità e le molecole di IgG di diversa origine clonale differiscono quindi leggermente per dimensioni e carica. Sebbene l'elettroforesi a confine mobile di Tiselius consentisse una misurazione accurata della mobilità di gruppi di proteine, non consentiva la completa separazione dei componenti di una miscela. La risoluzione era quindi troppo bassa per separare le molecole di IgG prodotte da diversi cloni di cellule B. (Holmøy, 2009) Per far sì che la risoluzione fosse quella cercata, l'elettroforesi doveva essere eseguita in un mezzo di supporto. (Holmøy, 2009)

(19)

18

MATERIALI E METODI

SCOPO DELLA RICERCA

In questa tesi ci siamo proposti di estrapolare, analizzare e valutare un database di dati liquorali che il laboratorio del liquor della Clinica Neurologica conserva dal 2000. Infatti, avere l’accesso a dati attendibili di oltre 20 anni su tutta la popolazione della regione Liguria, sarebbe uno strumento di incalcolabile valore statistico in campo neurologico.

L’estrazione dei dati dalla piattaforma obsoleta per renderli fruibili ai software di calcolo e statistici, la verifica della riproducibilità degli stessi in intervalli ampi di tempo, la correlazione con più variabili e alcuni esempi di analisi statistiche complesse, ci permetteranno di controllare il database e renderlo disponibile per studi neurologici su un ampio spettro di malattie, a diagnosi nota. Il possibile accoppiamento dei dati liquorali di una così vasta popolazione con i dati diagnostici oltre ad una selezionata banca dei fluidi, sarebbe un significativo passo avanti nello studio delle variabili complesse nelle malattie neurologiche.

Con queste premesse analizzeremo un sottocampione del database, con sole diagnosi in entrata (quindi ancora ipotetiche) che rispecchi il più possibile un campione ideale di pazienti con la sclerosi multipla. Su questi campioni confronteremo il risultato dell’immunoblot per le bande oligoclonali con un focus specifico su quei pazienti che presentavano bandeggio positivo solo su liquor, risultato che attesta forte sospetto di sclerosi multipla. Questi risultati verranno paragonati agli altri gruppi con pattern di bandeggio diverso per sottolinearne le differenze all’interno di tutte le variabili per la comune diagnosi liquorale.

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19

ESAME CITOCHIMICO DEL LIQUOR

Inizialmente avviene l’osservazione del campione .

Il quale può presentare diverse caratteristiche visive limpido incolore, torbido, paglierino, Iievemente ematico o ematico.

Se il liquor dovesse risultare con aspetto differente da limpido e incolore deve essere necessariamente specificato.

In seguito avviene la conta delle cellule: globuli bianchi (GB), globuli rossi (GR) (cellule normalmente presenti).

DOSAGGIO DEL GLUCOSIO ( GLICORRACHIA) E PROTEINE (PROTEINORACCHIA)

In seguito ad alcune metodiche si esegue la lettura allo spettrofotometro Bisogna leggere prima tutti i liquor e poi tutti i sieri.

I valori ottenuti sia per le proteine che per il glucosio vengono inseriti e poi elaborati nel programma ANALAB.

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20

ESAME IMMUNOCHIMICO DEL LIQUOR

Attraverso questo esame si ottengono i valori dell’albumina sierica e liquorale e delle lgG con i loro relativi rapporti attraverso l’esame nefelometrico.

Attraverso la formula di Reiber ottenuta dal rati albumina e IgG liquorali e sieriche si può caratterizzare l’integrità o meno della barriera emato-encefalica (BBB) e determinare quindi la sintesi di IgG all’interno del SNC, tipica della SM.

Fig2. (Bernardi, Gaetano, et al.)

Grafico di Reiber. Se il punto ricavato dai dati del paziente cade sopra la linea del quoziente limite (QLim), è presente sintesi intratecale (SI). La parte del grafico contrassegnata dal numero 1 corrisponde all’area di normalità; l’area 2 caratterizza il danno di barriera senza SI (ad es., meningite batterica). Le aree di SI sono invece quelle contrassegnate dai numeri 4 - quando cioè il punto si trova al di sopra della linea per valori di QAlb <8 (assenza di danno di barriera) - e 3 - quando si trova al di sopra della linea con valori di QAlb >8. Se le coordinate (QAlb e QIgG) individuano un punto in area 5, è possibile che si sia verificato un errore nel dosaggio di uno dei 4 parametri. (Bernardi, Gaetano, et al.)

(22)

21

IMMUNOBLOT SU LIQUOR E SIERO

Attualmente effettuata da molti con l’uso di Kit commerciali.

Nel nostro laboratorio invece il protocollo non è stato modificato e viene effettuato con preparazione manuele del gel di agarosio.

L’esame viene effettuato su due giorni consecutivi di lavoro.

STATISTICA

L’analisi statistica dei liquor studiati è stata effettuata interamente con il software Graphpad Prism 9.0. Per l’analisi dei gruppi, è stato sempre utilizzato il test One-Way ANOVA corretto con il post test di Tukey per le comparazioni multiple. Per i grafici di correlazione lineare è stato utilizzato il coefficiente di correlazione di Spearman per dati non parametrici. La Principal Component analysis, effettuata in un primo tempo su tutte le dodici variabili analizzate, è stata ristretta alle sole 6 più significative e legate al cambiamento tra gruppi. La significatività è sempre stata rilevata con p<0.05.

(23)

22

RISULTATI

Fig3.

I1 senza bande

I2 bande solo su liquor I4 bande su liquor e siero

I5 bande addizionali (bande solo su siero)

(24)

23 Fig4.

Abbiamo raccolto i dati liquorali di 6200 casi analizzati dal lab liquor della Clinica neurologica tra gli anni 2001-2004 (3716 casi) e 2017-2020 (2484 casi)che contenevano diagnosi di entrata di ogni tipo.

Poi abbiamo preso in considerazione solo i pazienti con diagnosi di entrata di sclerosi multipla, sclerosi multipla probabile e neuriti ottiche, per restringere il campo e avvicinarsi quanto più possibile ad un campione omogeneo.

Poi abbiamo visto in percentuale quali immunoblot erano più rappresentati in questa categoria di diagnosi in entrata.

Nella seguente tabella sono messi in relazione tutti i dati che abbiamo considerato fra gli intervalli di anni presi in considerazione, cioè 2001-2004 e 2017-2020.

Come si può notare, le due popolazioni presentano dati assolutamente sovrapponibili con scarti minimi dovuti alla ben nota variabilità individuale

(25)

24

Fig5.

Nei seguenti grafici sono rappresentati, nei vari anni 2001-2004 e 2017-2020, le distribuzioni in percentuali del pattern di bandeggio per il sottogruppo analizzato per le diagnosi in entrata di SM e neuriti ottiche

Brevemente, è utile ricordare che il bandeggio può essere assente, presente solo su liquor, mirror su liquor e siero (senza dare gammopatia monoclonale), e mirror con bande addizionali su liquor In questa tesi ci soffermeremo in modo particolare sul gruppo che presenta bandeggio solo su liquor (dati in rosso).

Come si può notare nei vari intervalli di tempo le percentuali non sono cambiate o comunque le variazioni sono minime, quindi senza significato. Il pattern solo su liquor rappresenta da solo quasi il 50% di tutti i casi, a seguire con il 40% l’assenza di bande.

Fig6.

Nei seguenti grafici vengono considerati il genere del paziente,

Di colore rosa come si può vedere dalla legenda sono considerate le femmine ed in azzurro invece vengono segnati i maschi.

La distribuzione di genere anche in questo caso viene considerata in percentuale nei diversi pattern di bandeggio. Si può notare come il genere femminile sia prevalente, soprattutto nel bandeggio solo liquorale, dato questo atteso dai dati di letteratura sulla sclerosi multipla.

2001/04

Distribuzione bandeggio (%)

assenti liquor

liquor/siero addizionali 0

10 20 30 40 50

2017/20

Distribuzione bandeggio (%)

assenti liquor

10 20 30 40 50

2001/04

Distribuzione genere (%)

assenti liquor

50 100 150

maschi femmine

2017/20

Distribuzione genere (%)

assenti liquor

50 100 150

maschi femmine

(26)

25

Fig7.

Nei seguenti grafici a forma di violino viene considerata l’età dei pazienti,

La line centrale e più in evidenza rappresenta la media, mentre l’intervallo compreso tra le due linee ai lati della media rappresentano il 75% del campione.

Dal grafico nel intervallo di tempo 2017-2020 si può osservare che è significativa (quattro asterischi) la relazione tra i campioni bande su liquor, con bande assenti e bande su liquor e siero. La media di età del campione bande su liquor è circa 39,77, negli altri campioni invece l’età media è più elevata.

2001/04

Età

assenti liquor

20 40 60 80 100

✱✱

✱✱✱✱

✱✱

2017/20

Età

assenti liquor

20 40 60 80 100

✱✱✱✱ ✱✱✱✱

✱✱

(27)

26 Fig8.

Nei seguenti grafici a forma di violino viene considerata la proteinorrachia (concentrazione proteine nel liquor) dei pazienti. Si può osservare nel intervallo di tempo dal 2017 al 2020 che è significativa (quattro asterischi) la relazione del campione di bande su liquor, con i due campioni di bande assenti e bande su liquor e siero. In questo caso il valore medio delle proteine nel liquor, considerando il campione bande su liquor, è 0,3950 gr/dl (i valori normali vano da 0,130 a 0,52 gr/dl) invece negli altri due casi è più elevata. Nel caso delle bande su liquor e siero il valore medio è 0,6315 quindi è superiore del normale. Negli altre due tipologie di campioni il valore medio è superiore rispetto al campione con le bande sul liquor ma rientra comunque nei valori normali.

assenti liquor

liquor/siero addizionali 0.0

0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

2001/04

Proteinorachia

✱

2017/20

Proteinorachia

assenti liquor

0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

✱✱✱✱

(28)

27 Fig9.

Nei seguenti grafici a forma di violino viene considerata la glicorrachia (concentrazione glucosio nel liquor) dei pazienti. Nel grafico che viene considerato l’intervallo di tempo dal 2017 al 2020 la media del glucosio nel liquor, nei casi in cui le bande sono presenti nel liquor, è di circa 57,27 mg% (i valori normali rientrano tra 44 e 75 mg%). Gli altri campioni hanno le medie tutti nella norma e simili al campione preso in considerazione, tranne le bande addizionali che la media è un po’ più elevata, ma rimane sempre nella norma.

Fig10.

Nei seguenti grafici a forma di violino viene considerata la glicemia (concentrazione glucosio nel siero e quindi nel sangue) dei pazienti. Nel grafico che rappresenta il periodo di tempo compreso dal 2017 al 2020, la glicemia media del campione (bande su liquor) è 80,15 L/S. Le medie degli altri campioni sono simili.

2001/04

Glicorachia

assenti liquor

50 100

150 2001/04

Glicorachia

assenti liquor

50 100 150

glucosio siero 01/04

Glicemia

assenti liquor

100 200 300

glucosio siero 17/20

Glicemia

assenti liquor

100 200 300

(29)

28 Fig11.

Nei seguenti grafici a forma di violino vengono considerate le cellule nel liquor dei pazienti. Nel grafico con l’intervallo di tempo compreso tra 2017 e 2020, la significatività non è molto elevata (due asterischi) ed è presenta tra campioni con bande su liquor e campioni con bande assenti. La media delle cellule presenti sul campione (bande su liquor) è di circa 5,302 mm3 (valori nella norma 0,3 e 4 mm3) quindi il valore è al di fuori della norma. Il campione con bande assenti presenta un numero medio di cellule molto inferiore, rispetto a quello considerato in precedenza, che è di 1,899 che rientra anche nei valori normali.

Gli altri due campioni invece sono simili al campione con bande su liquor e quindi anche le loro medie sono fuori dalla norma.

assenti liquor

5 10 15 20

2001/04

cellule/mm3

✱

assenti liquor

5 10 15 20

2017/20

cellule/mm3

✱✱

(30)

29

Fig12.

Nei seguenti grafici a forma di violino viene considerata la QIgG (quoziente di IgG, rapporto tra livelli liquorali e sierici) dei pazienti. Considerando il grafico nel intervallo di tempo dal 20017 al 2020 è presente un alta significatività (quattro asterischi) tra il campione bande su liquor e bande assenti. La media di QIgG, nel gruppo bande su liquor, è 5,179 (valori normali 0,82-3,26). L’unica media che rientra nei valori normali è, quella del campione di bande assenti, 3.202.

Fig13.

Nei seguenti grafici a forma di violino viene considerata la QAlb (quoziente di albumina, il rapporto tra i livelli liquorali e sierici di albumina) dei pazienti. Osservando il grafico con l’intervallo di tempo compreso tra 2017 e 2020 è presente una significatività (quattro asterischi) tra il campione di bande su liquor e bande su liquor e siero. La media di Qalb, del campione bande su liquor, è 5,686 (valori normali 1,92-7,30) quindi valore nella norma. Le uniche medie molto più alte del campione considerato e fuori dalla norma sono dei gruppi dande su liquor e siero e quelli addizionali.

assenti liquor

5 10 15

2001/04

QIgG

✱✱✱✱

assenti liquor

5 10 15

2017/20

QIgG

✱✱✱✱

✱✱✱

assenti liquor

5 10 15 20

2001/04

QAlb

✱

✱✱✱

✱✱

assenti liquor

5 10 15 20

2017/20

QAlb

✱✱✱✱

(31)

30

Fig14.

Nei seguenti grafici a forma di violino viene considerato l’indice di Link (che è l’indice di IgG liquorale) dei pazienti. Prendendo in considerazione il grafico con l’intervallo di tempo dal 2017 al 2020 ci sono due significatività (quattro asterischi tra il campione con bande su liquor con quello senza bande e con bande su liquor e siero. La media dell’indice di link, del campione bande su liquor, corrisponde a 0.9482 (valori normali 0,236-0,669) valore fuori dalla norma. Gli altri due campioni con in quali c’era una significatività invece rientrano nella norma.

Fig15.

Nei seguenti grafici sono rappresentati, nei vari anni 2001-2004 e 2017-2020, il reperto immunochimico in percentuale.

assenti liquor

0.5 1.0 1.5 2.0

2001/04

Indice di Link

✱✱✱✱ ✱✱✱✱

✱✱✱✱

✱✱✱

✱✱✱✱

assenti liquor

0.5 1.0 1.5 2.0

2017/20

Indice di Link

✱✱✱✱

✱✱✱✱ ✱✱✱✱

2001/04

Distribuzione immunochimico (%)

Reperto normale sintesi IgG

DDB DDB+sintesi 0

20 40 60 80

2017/20

Distribuzione immunochimico (%)

DDB DDB+sintesi 0

20 40 60 80

(32)

31

Fig16.

Nei seguenti grafici sono rappresentati, nei vari anni 2001-2004 e 2017-2020, la distribuzione di immunochimico nel sottogruppo bande solo su liquor. Questa viene considerata nei vari reperti: reperto normale, sintesi IgG, danno di barriera (DDB), danno di barriera con sintesi. La sintesi IgG è intorno al 50% dei campioni mentre il reperto normale si attesta sul 30% dei campioni con presenza di bande oligoclonali.

Fig17.

Nei seguenti grafici sono rappresentati, nei vari anni 2001-2004 e 2017-2020, la percentuale di bandeggio su sintesi (sintesi in assenza di danno di barriera).

Come si nota dal grafico il 90% dei campioni avente sintesi IgG all’immunochimico presenta le bande oligoclonali al blot, la quasi totalità.

2001/04

Immunochimico in bande su liquor

DDB DDB+sintesi 0

20 40 60

2017/20

Immunochimico in bande su liquor

DDB DDB+sintesi 0

20 40 60

2001/04

Bandeggio su Sintesi (%)

assenti liquor

20 40 60 80 100

2017/20

Bandeggio su Sintesi (%)

assenti liquor

20 40 60 80 100

(33)

32 Abbiamo voluto correlare tra loro le variabili fin qui esposte soffermandoci solo nel sottogruppo dei pazienti con bande sul liquor nell’intervallo di tempo più recente, visto la assoluta ripetibilità dei due campioni.

Fig18.

Questo grafico rappresenta la correlazione tra l’indice di Link e l’età dei pazienti. tra queste due variabili non c’è nessuna correlazione.

Fig19.

Questo grafico rappresenta la correlazione tra l’indice di Link (che sarebbe l’indice di IgG nel liquor) e la proteinorrachia (concentrazione proteine nel liquor) dei pazienti.. Tra queste due variabili non c’è nessuna correlazione.

Indice di Link

età

0 1 2 3 4 5

0 50 100 150

Indice di Link

Proteinorachia

0 1 2 3 4 5

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5

(34)

33 Fig20.

Questo grafico rappresenta la correlazione tra l’indice di Link (che sarebbe l’indice di IgG nel liquor) e la glicorrachia (concentrazione glucosio nel liquor) dei pazienti. Tra queste due variabili non c’è nessuna correlazione.

Fig21.

Questo grafico rappresenta la correlazione tra l’indice di Link (che sarebbe l’indice di IgG nel liquor) e la glicemia (glucosio nel sangue) dei pazienti. Tra queste due variabili non c’è nessuna correlazione.

Indice di Link

Glicorachia

0 1 2 3 4 5

0 50 100 150 200

Indice di Link

Glicemia

0 1 2 3 4 5

0 100 200 300 400

(35)

34 Fig22.

Questo grafico rappresenta la correlazione tra l’indice di Link (che sarebbe l’indice di IgG nel liquor) e le cellule (nel liquor) dei pazienti.

Questa è una correlazione positiva significativa con P<0,001 cioè 0,1%.

Il coefficiente di correlazione di Spearman è r = 0,1938.

In questo caso la mia correlazione si avvicina al 20% quindi non una correlazione altissima ma comunque utile per spiegare una piccola parte della variabilità del campione

Indice di Link

Cellule/mm3

0 1 2 3 4 5

0 20 40 60 80

(36)

35 Fig23.

Questo grafico rappresenta la correlazione tra l’indice di Link (che sarebbe l’indice di IgG nel liquor) e QIgG dei pazienti.

Questa è una correlazione positiva significativa con , quindi P<0,0001 cioè 0,01%.

Il coefficiente di correlazione di Spearman è r = 0,6446.

In questo caso la correlazione è del 64% quindi una correlazione molto alta, dato atteso e di conferma visto la sovrapponibilità dei due tipi di dati.

Fig24.

Questo grafico rappresenta la correlazione tra l’indice di Link (che sarebbe l’indice di IgG nel liquor) e QAlb dei pazienti.

Questa è una correlazione negativa significativa con , P<0,05 cioè 5%.

Il coefficiente di correlazione di Spearman è r = - 0,1344. Dato inatteso, che potrebbe essere dovuto al campione analizzato.

Indice di Link

QIgG

0 1 2 3 4 5

0 10 20 30 40

Indice di Link

QAlb

0 1 2 3 4 5

0 10 20 30 40

(37)

36 Fig25.

Con una Principal component analysis abbiamo dimostrato che le variabili più importanti a determinare le differenze tra i gruppi sono l’età, la proteinorrachia (concentrazione proteine nel liquor), le IgG nel liquor, QIgG, QAlbumina e l’indice di Link (indice di IgG liquorale). Come si vede dal grafico i campioni con bande liquorali si discostano grandemente da quelli senza le bande e dal gruppo con bande liquor siero, a rimarcare le differenti patologie presenti nei diversi gruppi.

-6 -4 -2 0 2

PC scores

PC1

PC2

Immunoblot 1 2