3. RISULTATI. 3.1. Studio della regione N-terminale di ERK1 ed ERK2.

3. RISULTATI.

3.1. Studio della regione N-terminale di ERK1 ed ERK2.

Nell’ottica di studiare la cinetica e le differenze funzionali e molecolari tra ERK1 ed ERK2 sono andato a studiare inizialmente il dominio N-terminale delle due proteine, e successivamente la regione 3’UTR dei rispettivi trascritti. Come è possibile osservare dai cDNA dei due geni, questi differiscono per una sequenza di nucleotidi presente nella regione codificante ( circa 160 ) di ERK1 e totalmente assenti in quella di ERK2 (Figura 13). Successivamente ho confrontato le due proteine riscontrando: una alta omologia tra le sequenze aminoacidiche, gli stessi domini funzionali, ed una regione di 20 aminoacidi presente solo all’ N-terminale della proteina ERK1 (Figura 14 ).

Principali domini dei geni ERK 1/2

ERK2 2870 NUCLEOTIDI

5’UTR

_3’UTR

ERK1 1765 NUCLEOTIDI

5’UTR

3’UTR

stop

stop

Regione codificante

Regione codificante

start

start

cDNA ottenuto dai trascritti di ERK1 ed ERK2.

Entrambi i geni sono costituiti da un dominio codificante centrale con un’alta omologia e da due domini fiancheggianti, non codificanti, di lunghezza diversa.

Allineamento delle sequenze aminoacidiche

Erk1 MAAAAAAPGGGGGEPRGTAGVVPVVPGEVEVVKGQPFDVGPRYTQLQYIG Erk2 MAAAAAAGP EMVRGQVFDVGPRYTNLSYIG

N-- N--

EGAYGMVSSAYDHVRKTRVAIKKISPFEHQTYCQRTLREIQILLGFRHENVIGIRDILRAPTLEAMRDVYIVQDLMETDLYKLL EGAYGMVCSAYDNLNKVRVAIKKISPFEHQTYCQRTLREIKILLRFRHENIIGINDIIRAPTIEQMKDVYIVQDLMETDLYKLL KSQQLSNDHICYFLYQILRGLKYIHSANVLHRDLKPSNLLINTTCDLKICDFGLARIADPEHDHTGFLTEYVATRWYRAPEIML KTQHLSNDHICYFLYQILRGLKYIHSANVLHRDLKPSNLLLNTTCDLKICDFGLARVADPDHDHTGFLTEYVATRWYRAPEIML NSKGYTKSIDIWSVGCILAEMLSNRPIFPGKHYLDQLNHILGILGSPSQEDLNCIINMKARNYLQSLPSKTKVAWAKLFPKSDS NSKGYTKSIDIWSVGCILAEMLSNRPIFPGKHYLDQLNHILGILGSPSQEDLNCIINLKARNYLLSLPHKNKVPWNRFLPNADS KALDLLDRMLTFNPNKRITVEEALAHPYLEQYYDPTDEPVAEEPFTFDDSKALDLLDRMLTFNPNKRITVEEALAHPYLEQYYD

KALDLLDKMLTFNPHKRIEVEQALAHPYLEQYYDPSDEPIAEAPFKFDDSKALDLLDKMLTFNPHKRIEVEQALAHPYLEQYYD PTDEPVAEEPFTFDMELDDLPKERLKELIFQETARFQPGAPEAP--C

PSDEPIAEAPFKFDMELDDLPKEKLKELIFEETARFQPGYRS--C

In giallo sono evidenziati gli aminoacidi che fanno parte del dominio chinasico; In marrone gli a.a. responsabili della dimerizzazione;

In ciano sottolineato sono evidenziati i siti di fosforilazione;

In arancio gli a.a. coinvolti nella ritensione citosolica indotta da MEK; In verde gli a.a. coinvolti nella traslocazione nucleare;

In ciano loop di attivazione

Figure 14

Allineamento delle sequenze aminoacidiche di ERK1 ed ERK2.Ingrandimento dei 20aa all’N-terminale di presenti solo in ERK1(in grassetto);sottolineato il

In seguito a queste osservazioni abbiamo puntato la nostra attenzione su i primi 39 amminoacidi . Dal momento che il codone 40 stabilisce l’inizio del dominio chinasico sono state generate quattro proteine di fusione costituite da EGFP fusa all’n-terminale e al c-terminale del full-lent del cDNA di ERK1 ( ERK1-GFPN, ERK1-GFPC ), di ERK2 ( ERK2-GFPN, ERK2-GFPC).

La linea cellule NIH 3T3 sono state trasfettate in maniera transientemente con i costrutti su detti, private dal siero ( 24 ore in siero all’1% ) e quindi stimolate in FGF. La microscopia confocale al seguito del periodo di trasfezione, ha rivelato che tutti i cloni hanno una simile distribuzione subcellulare. Infatti la fluorescenza delle proteine di fusione è stata visualizzata prevalentemente nel citoplasma mentre i nuclei risultavano scuri, come prevedibile per la forma inattiva di ERK. A seguito della stimolazione con FGF si riscontra la comparsa della fluorescenza in tutti i nuclei delle cellulei. La localizzazione cellulare di ERK1/2 in colture non stimolate, dipende dal livello di trasfezione, dal momento che una fluorescenza molto intensa ha mostrato invariabilmente una pronunciata traslocazione nucleare indipendentemente dall’attivazione di ERK. Questo effetto è stato osservato precedentemente ed è dovuto all’alterazione del rapporto relativo tra ERK e MEK. Dal momento che questo fenomeno può essere invertito dalla over espressione concomitante di MEK. E’ stato identificato un livello di espressione superiore compatibile con un normale patter di localizzazione di ERK1. Brevemente abbiamo realizzato un grafico delle relazioni tra l’indice di traslocazione e il livello di espressione di un gruppo di cellule starvate. A livelli bassi di espressione l’indice di traslocazione è minore uguale ad uno e la correlazione tra fluorescenza e indice di traslocazione è piuttosto modesta.

3.2. Confronto della traslocazione nucleare tra ERK1-GFP ed ERK2-GFP.

In seguito abbiamo fatto esperimenti di immaging dinamico per confrontare le cinetiche di attivazione di ERK e delle traslocazione tra i cloni sopracitati. Sono state condotte indagini sulla possibilità che la stimolazione del patter di ERK causi una qualche differenza nella distribuzione cellulare delle quattro proteine di fusione che presentano il full lenght ERK1/2 ( ERK1N/C-TERMINAL-GFP; ERK2N/C-TERMINAL-GFP ). L’immaging è stato condotto dopo un periodo di privazione di nutrienti ed entro venti minuti dalla stimolazione da FGF (referenza). A seguito della stimolazione con mitogeni ERKs sono velocemente fosforilati e una parte degli ERK attivi trasloca nel nucleo. A questo punto sono state confrontate le dinamiche del processo di traslocazione in esperimenti di time lipes. La stimolazione è stata fatta aggiungendo al mezzo 80ng/ml di FGF4. E’ stata caratterizzata la cinetica di inizio traslocazione acquisendo fotogrammi successi con una risoluzione temporale relativamente alta ( 30 sec ). La somministrazione di agenti stimolanti è stata seguita da un periodo di latenza nel quale non è stata osservata alcuna traslocazione distinguibile ( T10% che varia tra 2 e 4 minuti ). Successivamente ERK1-GFP ed ERK2-GFP traslocano nel nucleo

raggiungendo il 90% della risposta dopo nove minuti dall’inizio della stimolazione, seguendo una cinetica esponenziale (figura 16). Lo stesso trattamento somministrato a cellule trasfettate con il solo gene reporter, non ha prodotto alcun cambiamento nella distribuzione intracellulare della fluorescenza della GFP. Questi risultati non mettono in evidenza alcuna differenza nella cinetica o nell’ ampiezza della traslocazione tra ERK1 ed ERK2.

Traslocazione di ERK1/2

Figura 15

Cascata di trasduzione del segnale delle proteine ERKs in seguito ad uno stimolo con FGF. MEK1/2 FGF FGFR Ras Raf-1

Citoplasma

P

P

Nucleo

P

P

A

Confronto della traslòocazione in cellule vive trasfettate con ERK1-GFP e ERK2-GFP dopo stimolazione con FGF.

A) Cellule dopo 8 e 15 minuti dal trattamento con FGF

B) Time course cumulativo dell’Indice di Concentrazione delle cellule stimolate con FGF4 (80 ng/ml). ERK1-GFP indicato in magenta (n=18), ERK2-GFP indicato in verde (n=12).

Erk1 Erk1 Erk2

B

3.3. ERK1-GFP ed ERK2-GFP si muovono attraverso la membrana nucleare con cinetiche diverse.

Le proteine ERK1 ed ERK2 passano continuamente dal nucleo al citoplasma a seconda del loro stato di attivazione, e questo movimento è sufficientemente rapido da riempire il nucleo di ERK. Fino ad ora nessuno a investigato le differenze della cinetica di ERK1 ed ERK2 in movimento. La questione è stata affrontata studiando e osservando il ripristino della fluorescenza di ERK1-GFP ed ERK2-GFP dopo fotospegnimento del compartimento nucleare ( FRAP ).

La fluorescenza del compartimento nucleare è stata schiarita effettuando ripetuti scanner con un laser potente Successivamente sono stati eseguiti successivi timel apes imaging ad intervalli di 5 secondi. Dato che il fotospegnimento è un processo irreversibile, un ritorno di fluorescenza nel nucleo deve essere dovuto ad un ritorno di ERK-GFP non schiarito proveniente dal citoplasma. Visto che la concentrazione proteica nel nucleo non è influenzata dal fotospegnimento, tele influsso è in equilibrio con un efflusso di chimera schiarita, e la costante temporale del ritorno della fluorescenza è inversamente proporzionale alla permeabilità. La figura 4 mostra che ERK1-GFP così come ERK2-GFP viene scambiata continuamente con una cinetica diversa tra il nucleo e il citoplasma, come dimostrato dal ritorno della fluorescenza nucleare. La cinetica del ritorno della fluorescenza in tutte le cellule misurate è stata adattata con notevole accuratezza da un solo esponenziale, come predetto dall’equazione che controlla il mixing di due compartimenti comunicanti. Così la cinetica del processo di ripristino si può descrivere semplicemente dalla relativa costante temporale e dal suo valore asintotico. La costante temporale τ dipende dalla velocità della proteina in movimento attraverso la membrana, e si è scoperto che accelera di 3,2, minuti dopo la stimolazione nel caso di ERK2 e di 3,6 minuti nel caso di ERK1 ( P ≤ 0,0 ). Il valore asintotico del ripristino sarebbe pari ad 1 se in presenza di una frazione di proteina di una frazione di

proteina immobilizzata nel nucleo. E’ importante ricordare che poiché la fluorescenza viene misurata sull’intera area occupata dal nucleo, questi dati permettono solo di concludere che la frazione immobile resta intrappolata nel nucleo, senza indicare niente sulla sua mobilita entro il dipartimento nucleare stesso. In alcuni casi è stato possibile misurare il ripristino della fluorescenza nella stessa cellula prima e dopo la stimolazione (figura 17 B). Ogni cellule viene plottata a seconda dell’ottavo indice di concentrazione e della costante temporale del ripristino della fluorescenza, dalla condizione di deprivazione e dopo la stimolazione con FGF4.

A B

ERK1-GFP e ERK2-GFP traslocano continuamente attraverso la membrana nucleare con cinetichee differenti.

A) Registrazione di cellule trasfettate con ERK1-GFP ed ERK2-GFP durante un esperimento di FRAP ( Fluorescence Recovery After Photobleaching) nucleare in condizioni di privazione da nutrienti nei seguenti punti temporali: prima del bleaching, subito dopo il bleaching ed a 3, 5 e 15 minuti dopo il bleaching.

B) Time course del recupero della fluorescenza nucleare nelle cellule mostrate nel panello A. La curva esponenziale indicata il recupero di fluorescenza in un lasso di tempo, e viene utilizzata per calcolare le costanti di tempo, ERK1 indicato in verde, ERK2 indicato in magenta. Le due curve esponenziali dimostrano un turnover attraverso la membrana nucleare più veloce per ERK2-GFP (262 s) rispetto a ERK1-GFP (653 s).

DATI RIASSUNTIVI DEGLI

ESPERIMENTI DI FRAP

1

100

1

200

1

300

1

400

1

500

1

600

1

700

1

800

1

900

2

000

1

0

0

2

0

0

3

0

0

4

0

0

5

0

0

6

0

0

7

0

0

n=39

n=45

n=

49

Starv Stim

n=65

Stim. ERK1 178s

ERK2 84s

Starv. ERK1 653s

ERK2 266s

Figura 18

In cellule private di nutrienti ERK1 è 3,7 volte più lento di ERK2;

In cellule stimolate ERK1 è 3,1 volte più lento di ERK2.

3.4 Studio della regione 3’UTR di ERK1 ed ERK2.

La regione 3’UTR dei trascritti è il più importante sito di regolazione, post-trascrizionale, della traduzione. All’interno di questa porzione terminale al 3’del trascritto sono presenti numerosi siti di regolazione della stabilità ( AREs di prima classe), della destabilità (ARES di seconda classe), di poliadenilazione citoplasmatica ( CPE e PAE), di ritenzione citoplasmatica, dell’interferenza da RNA e molte altre. Nella seconda parte della mia tesi sono andato a studiare la possibilità di una differenza nella regolazione, post-trascrizionale, dei geni in questione.

3.5. Caratterizzazione della regione 3’UTR di ERK1 ed ERK2.

Ho proseguito il mio lavoro di tesi andando a confrontare le sequenze della regione 3’UTR dei due trascritti, non trovando alcuna omologia. Successivamente, sempre nelle suddette regioni, sono andato a ricercare sequenze consensus stabilizzatrici, destabilizzatrici e della poliadenilazione citoplasmatica. Nella caratterizzazione del 3’UTR di ERK1 non ho riscontrato la presenza di alcuna delle sequenze prima citate fino ad ora conosciute, tranne tre motivi destabilizzanti (Eden). Al contrario la caratterizzazione di ERK2 ha rivelato la presenza di numerose sequenze AREs, Eden e di altre due ( CPE e PAE ) poste a monte dell’inizio della coda di poli-A necessarie sufficienti a determinare l’allungamento della stessa nel citoplasma. Le osservazioni fatte fino ad ora portano a pensare che ERK1 ed ERK2 siano regolati differenzialmente a livello citoplasmatico da un meccanismo di poliadenilazione. Per vagliare l’ipotesi sperimentale ho condotto dei saggi di RACE-PAT e di LM-PAT, test specifici per determinare l’allungamento della coda di adenosine.

c

a

gccagaggg cccctaacaa gaacagacac ccctgtcctt ttggatctgg tcctgctcct cctgctcct tctctgcaga ttgttagaaa gtgaactttg ctcaacccag accccggcag cccaggctgg accaagggtg ggcctggcca ccttctctca ctttgctggg gtctcctgct tcaagcaggc ttctcccact ccaatcccct gccccatctc cccatagcct gagtgatgag gtggccccag agctgatctc tgctgctgtg tctttatcta cccttgctag ccccggctct ggtagaccgt tctggaatgg aggggctatg atcgtcctag gacctgtgct acggaggggt ggagggcact gagtagggct ctgccctatt catcttgttg gaaccccacc ccattttccc tgacagaaca ttcctaagtc tcaagggcta gtttccctga ggagcccagg cctaaccctc tctctctcaa gctgccacat gtaacgccct tgctgcttct gtgtgtgggt gattggatgt gggggtgggg cccgtggaga gccggtgccc ctccccatct ccccgtgcct gtatctaata tataaatata gagatgtgta tatggaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa

3’UTR di ERK1

__3’ 5’__

ttctgttgca ggagtccttt ggggctattt tcctgtgtat catgttagtc ctaaatttaa ggtatgtact atttgcccag ctttttaaaa atttgatcat tgtttaaatg aaataggaag gaagcattgc accagcagta tctgttgttc tgcagatttt atatggttac ttgtatcgta atggaggtgg acgtcttgcc aaaatgttag atgctatcct tagccagaga gtgaaagtaa cagctgtgct tgtcatttac tgaaaggtgg acacacacaa agctgtggaa gtttccagaa cagtagagag caagctgacc tagatgttca gggcagagct ccatataacc ttgaacagcc acacagaagg ctgtttgcgt aaccacattc actacctagg gatttagcta aaaggaacac tgcatcttta aatgagaaag tgtacagttc ttctcctgca gcatgtcagc atctcgagct cacttttcag cagtgtaatg acttgtatgt aataaagcct tgatgggctc tcctcatgaa gctctgctct gttgccaagt tagagatgtt tctggtactg ctgagttaat gtcataaaag gctagcagta actgttcgag ctctctttta tttccttctc tcctatattt tgttcctgca ctgtgtgctg tggagttgat ggtgttatcc cagtgcggtg cctccagacc ccctcactgc tctctgatga gaaatatgcc ttgttcaata cttactgtgc tcttgcatga ctgttaaggt ttctgtgcag agaccaatgt ccaagtgtca catcctttga ttgaacgaaa tctgttgtga cctctgagtt gtattccatg aagagaatgc tacccagaag ataatgtaca aaagataatt atattgttaa cttttcattt ctcagctgtc cttttgtttt cttggttttt attttttatt ttgacatcaa tggaaaatgg gttctataaa gactgcctgc tagtatgaac agcaatgcaa tgcacttgta actcatggaa ataaatgtac atctttatct ttacacccat aaaaaaaaaa

5’__

__3’

3’UTR di ERK2

SEQUENSE CONSENSUS REGOLANTI LA POLIADENILAZIONE CITOPLASMATICA

Figura 19. Caratterizzazione delle regioni 3’UTR di ERK1 ed ERK2. In verde sono evidensiate le sequenzeEden, in giallo le sequenze CPE, in blu le sequenze PAE, in fiola

3.6. Saggio di RACE-PAT condotto su ERK2.

La tecnica della RACE-PAT o per esteso “rapid amplification of cDNAends-polyadenylation test, permette di valutare l’estensione della coda di poliadenosine di un particolare trascritto.

L’mRNA totale viene retrotrascritto utilizzando un anchor primer costituito da un oligo d ( t )12,

dalla quale ottengo un pool di cDNA di lunghezza variabile. Successivamente amplifico li ss-cDNA con un primer specifico per la regione 3’ UTR di ERK2 e lo stesso oligo d (t ). Un mRNA maturo possiede al suo 3’ una coda di circa 200-300 adenosine, mentre se questo subisce il processo di poliadenilazione citoplasmatica può avere una coda circa dieci volte più grande. Il campione ottenuto lo ho corso in un gel al 2% di agarosio, successivamente è stato osservato al transilluminatore con il quale ho ottenuto una foto della corsa elettroforetica. Quest’ultima è stato trasferita su di un foglio di nilon su quale ho effettuare un saggio di Southern blot utilizzando un priner nested, posto a valle del prime utilizzato per la RACE-PAT, specifico per la regione 3’UTR di ERK2 in modo da effettuare una ulteriore selezione sull’amplificato prima di effettuare l’autoradiografio. Come si può osservare dalla figura 20 ottenuta dal procedimento descritto fino ad ora, le cellule private di nutrienti presentano una banda minima di circa 100 paia basi ed un leggero smear sopra, mentre le cellule stimolate con FGF4 hanno una banda minima di 100 paia basi ed un smear che arriva alle 1500 paia basi.

RACE-PAT di ERK2

pb

st

stim

100

•

•

200

1500

400

700

•

•

•

Figura 20

Stim, cellule stimolate con fattori di crescita

Successivamente ho condotto saggi di LM-PAT ( ligasi mediated-polyadenylatin test ), una variante della RACE-PAT che permette di ottenere un risultato più preciso, sempre sul trascritto di ERK2. Come si può osservare dall’immagine 21, le cellule privatri di nutrienti non hanno allungamento della coda in quanto la smear è compreso tra 100 e 250 paia basi, mentre le cellule stimolate mostrano uno smear compreso tra le 100 e le 1500 paia basi indicando un allungamento della coda.

LM-PAT di ERK2

•

•

•

•

•

bp

100

1000

400

700

300

stim

st

Figura 21

Stim, cellule stimolate con fattori di crescita

I dati ottenuti dagli esperimenti di RACE-PAT e di LM-PAT sono in accordo, ed indicano per ERK2 un meccanismo di poliadenilazione citoplasmatico stimolato da mitogeni.