dell’induzione al nuoto. In sanguisughe in cui sia stata tagliata la

RIASSUNTO

Questo lavoro sperimentale fa parte di un ampio progetto di ricerca iniziato già da alcuni anni all’interno dei nostri laboratori, che ha come scopo quello di valutare gli effetti della acetil-L-carnitina (ALC) nel sistema nervoso della sanguisuga Hirudo medicinalis.

Questo invertebrato mostra un’ampia gamma di complessi atti comportamentali le cui reti neurali sono state caratterizzate in dettaglio.

Per questo lavoro di tesi è stato utilizzato il modello comportamentale

dell’induzione al nuoto. In sanguisughe in cui sia stata tagliata la

connessione tra il ganglio cefalico e il primo ganglio segmentale,

l’applicazione nella regione caudale di una stimolazione elettrica (treno di

impulsi della durata di 5 msec ciascuno, alla frequenza di 8,3 Hz, per una

durata totale del treno di 1,6 sec) ad un’opportuna intensità, determina un

ciclo di nuoto con un intervallo di tempo costante tra l’applicazione dello

stimolo e l’inizio della risposta natatoria (latenza). Una stimolazione

ripetuta ad intervalli costanti (1/min) determina un progressivo aumento

della latenza (abitudine). L’applicazione di uno stimolo nocicettivo

(brushing) sulla cute dorsale dell’animale produce un immediato

potenziamento della risposta che corrisponde ad un accorciamento della

latenza sia in animali naif (sensitizzazione) sia in animali precedentemente abituati (disabitudine).

In passato, nei nostri laboratori è stato dimostrato che la serotonina (5HT), un neurotrasmettitore endogeno, è in grado di mimare l’effetto sensitizzante (o disabituante) del brushing e che tale azione si esplica attraverso l’attivazione della via dell’adenosin monofosfato ciclico (cAMP).

Esperimenti recentemente condotti dal nostro gruppo di ricerca hanno evidenziato che l’iniezione della ALC (1 mM o 2 mM) determina il blocco della sensitizzazione e una riduzione della disabitudine indotte da brushing. Inoltre, esperimenti in cui la stimolazione nocicettiva era stata

sostituita dall’iniezione di 5HT (200 µM) hanno dimostrato che la ALC (2 mM) è in grado di bloccare anche la sensitizzazione indotta da questa monoammina.

Partendo da tali risultati, con questo lavoro sperimentale abbiamo

proseguito l’indagine sull’azione della ALC nella sensitizzazione indotta

da 5HT. Sono state somministrate diverse concentrazioni della ALC (1

mM, 0,5 mM, 0,1 mM, 0,05 mM e 0,01 mM) e sono stati valutati gli effetti

di questa sostanza nel tempo (2 ore, 6 giorni, 11 giorni) su questa forma di

apprendimento.

Inoltre, abbiamo analizzato l’azione della ALC anche sulla disabitudine indotta da 5HT, valutando analogamente il “time-course” degli effetti di diverse concentrazioni di questa sostanza.

Da questi due tipi di esperimenti, sensitizzazione e disabitudine, indotte da 5HT, è emerso che la ALC è in grado di influenzare queste due forme di apprendimento non associativo; in particolare è in grado di bloccare la sesnsitizzazione e ridurre la disabitudine indotte da 5HT, in modo dose- e tempo-dipendente.

Infine, allo scopo di identificare i possibili targets molecolari della ALC, abbiamo analizzato gli effetti di questa sostanza sulla sensitizzazione e sulla disabitudine indotte mediante iniezioni di 8Br-cAMP (1 mM), un analogo permeabile del cAMP in grado di mimare l’effetto potenziante del brushing. Tali esperimenti dimostrano che la ALC è ancora in grado di

bloccare la sensitizzazione indotta da 8Br-cAMP a partire da 2 ore dal

trattamento, mentre l’effetto di riduzione del processo di disabitudine

compare solo dopo 11 giorni dal trattamento. Possiamo quindi concludere

che l’effetto della ALC non si esplica a livello della formazione del cAMP,

ma ancora più a valle.

SUMMARY

This experimental thesis is a part of an interesting research project at the aim of analyzing the effects of acetyl-L-carnitine (ALC) on the nervous system of the leech Hirudo medicinalis.

This invertebrate exhibits a wide range of complex behaviours related to well identified neural networks. For this research we have used swim induction as experimental behavioural model.

In leeches with the cephalic ganglion surgically disconnected from the segmental nerve cord, the application of a single train of weak electrical impulses (1,6 s total duration, with 5 ms pulses at a frequency of 8,3 Hz) onto the caudal region of the body wall elicits swimming activity with an almost constant interval between the stimulus and the onset of the swim episode (i.e., latency).

Such a stimulation, repeatedly applied with a 1 min inter-trial interval, induces a progressive increase of latency (habituation). The delivery of a nociceptive stimulation (brushing) on the dorsal skin of the leech provokes a sudden potentiation of the behavioural response (that is a latency decrement) both in naif animals (sensitization) and in previously habituated animals (dishabituation).

Earlier experiments in our laboratories demonstrated that serotonin (5HT),

en endogenous neurotransmitter, mimics the sensitizing (or dishabituating)

effect of brushing through the cyclic adenosine monophosphate (cAMP)- pathway activation.

More recently, our research group showed that ALC (1 mM or 2 mM) injection blocks sensitization and decreases dishabituation induced by brushing. Moreover, 2 mM ALC is able to block also sensitization induced by injection of 200 µM 5HT.

An aim of this experimental thesis is to better evaluate ALC effects on 5HT-induced sensitization. The effects of various doses of ALC (1 mM, 0,5 mM, 0,1 mM, 0,05 mM e 0,01 mM) have been tested at different times (2 hours, 6 days and 11 days) on this learning process. In addition, ALC effects have been studied on 5HT-induced dishabituation, too, and the time-course of different doses has been analyzed. These experiments show that ALC blocks 5HT-induced sensitization and reduces 5HT-induced dishabituation; these effects are dose- and time-dependent.

In conclusion, at the aim of identifying ALC molecular targets, the effects

of this drug have been evaluated on sensitization and dishabituation

induced by injection of 1 mM 8Br-cAMP, a cAMP cell-permeable

analogue that can mimick the potentiating effect of brushing. These

experiments show that ALC is again able to block 8Br-cAMP-induced

sensitization since 2 hours after the treatment, and to reduce 8Br-cAMP-

induced dishabituation 11 days after the treatment. We may conclude that

ALC does not seem to act on the cAMP formation but it is likely involved

more downstream in the molecular cascade underlying these forms of

learning.

Indice

1. INTRODUZIONE p. 1

1.1. La Acetil-L-carnitina p. 4

1.2. Caratteristiche morfologiche della sanguisuga p. 12

1.3. Il sistema nervoso di Hirudo medicinalis p. 16

1.3.1. Organizzazione generale p. 16

1.3.2 I neuroni identificati p. 18 1.3.3. Le cellule sensoriali p. 19 1.3.4. L’ iperpolarizzazione postuma (AHP) p. 22 1.3.5. I neuroni serotoninergici p. 26 1.3.6. Il circuito neurale del nuoto p. 30

1.4. La serotonina p. 34 1.4.1 La serotonina in Hirudo medicinalis p. 36 1.4.2 I recettori serotoninergici p. 38 1.4.3 Recettori serotoninergici in H. medicinalis p. 43

1.5. L’apprendimento non associativo p. 46 1.5.1. Apprendimento non associativo in Hirudo medicinalis p. 53

2. SCOPO DELLA TESI p. 61

3. MATERIALI E METODI p. 64

3.1 Materiali p. 64

3.2 Metodi neuroetologici p. 65

3.3 Analisi dei dati sperimentali p. 69

4. RISULTATI p. 71

4.1. Effetti della acetil-L-cartinina (ALC) sulla p. 71 sensitizzazione indotta da serotonina (5HT)

4.1.1 Effetti di ALC (1 mM) sulla sensitizzazione p.72

indotta da 5HT

4.1.2 Effetti di ALC (0,5 mM) sulla sensitizzazione p. 79

indotta da 5HT

4.1.3 Effetti di ALC (0,1 mM) sulla sensitizzazione p. 85

indotta da 5HT

4.1.4 Effetti di ALC (0,05 mM) sulla sensitizzazione p. 90

indotta da 5HT

4.1.5 Effetti di ALC (0,01 mM) sulla sensitizzazione p. 96 indotta da 5HT

4.1.6 Istogramma dose-effetto sulla sensitizzazione p. 101

indotta da 5HT

4.2. Effetti della acetil-L-cartinina (ALC) sulla p. 105 disabitudine indotta da serotonina (5HT)

4.2.1 Effetti di ALC (2 mM) sulla disabitudine p. 105

indotta da 5HT

4.2.2 Effetti di ALC (1 mM) sulla disabitudine p. 112

indotta da 5HT

4.2.3 Effetti di ALC (0,5 mM) sulla disabitudine p. 118

indotta da 5HT

4.2.4 Istogramma dose-effetto sulla disabitudine p. 124 indotta da 5HT

4.3. Effetti della acetil-L-cartinina (ALC) sulla p. 126

sensitizzazione indotta da 8 Br-cAMP

4.4. Effetti della acetil-L-carnitina (ALC) sulla p. 133 disabitudine indotta da 8 Br-cAMP

5. DISCUSSIONE p. 139

6. BIBLIOGRAFIA p. 145