3. Materiali e metodi.
3.1 Terreni e reagenti.
Il terreno utilizzato per la cultura cellulare è il RPMI1640 addizionato con il 3% di plasma felino autologo, glutammina 2Mm, amminoacidi non essenziali all’1%, gentamicina 50 ng/ml che chiameremo terreno completo. Interleuchina felina (IL-4) e fattore stimolante le colonie di macrofagi felini (GMC-SF) ricombinanti sono stati comprati dalla R&D Systemes ( Minneapolis,MN). IL2 umana ricombinante è stata comprata dalla ditta ROCHE, (Milano Italia).
3.2 Anticorpi.
Gli anticorpi monoclonali usati nello studio sono: anti-MHC di classe II, ottenuto come come supernatante dal Dr Peter F. Moore, università della California, Davis; B7.1 felino (dono del Dr. Wayne Tompkins, North Carolina) anti-CD134-PE umano, clone BerACT35 ,(eBioscience, San Diego,CA) e il suo controllo isotipico un anti-CD134 felino monoclonale donato come supernatante, da Brian Willet, università di Galsgow. Abbiamo usato come controllo negativo mAb L8D8 per tutti gli anticorpi che non ne avevano uno specifico. Dove serviva, come anticorpo secondario è stato usato un antisiero policlonale anti-gatto fluoresceinato.
3.3 Animali.
Sono state usati gatti specific pathogen free di 12-36 mesi di età, di sesso femminile, provenienti dalla ditta IFFA Credo (L’Arblesle, France ). Per tutta la durata della sperimentazione, gli animali sono stati mantenuti nel nostro stabulario
secondo le leggi richieste dalla Comunità Economica Europea. Il sangue venoso è stato prelevato, in presenza di eparina, dalla giugulare degli animali anestetizzati.
3.4 Cellule.
3. 4.1 Cellule dendritiche ottenute da monociti di sangue periferico.
Le DC derivano da monociti ottenuti da 35ml di sangue periferico. Le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) sono state ottenute tramite centrifugazione su gradiente di Ficoll-Paque per 30 min. a 550 x g. Le cellule isolate sono state lavate con fisiologica apirogena, contate e risospese in terreno alla concentrazione di 3 x 106 cellule/ml . Le cellule sono state distribuite in piastre da 24 pozzetti in aliquote da 1 ml e incubate a 37° C in atmosfera umidificata al 5% di CO2. Dopo 24h le cellule non aderenti sono state rimosse
(usate per ottenere cellule attivate, come vedremo dopo), mentre le aderanti sono state lavate due volte con terreno caldo e poi risospese in 0,5 ml di terreno completo con aggiunta di10 ng/ml IL4 felina e 50 ng/ml GMC-SF. Dopo due giorni è stata aggiunta la seconda dose di citochine in 100μl di terreno. Al 5° giorno di coltura le DC immature (iDC) ricevevano una terza dose di citochine e venivano infettate oppure fatte maturare. Per indurre la maturazione alle iDC venivano aggiunti 20ng/ml di Lipopolisaccaride (LPS) di Escherechia Coli 0127:b8 (Sigma, st Louis,MO) secondo il protocollo di Freer et al., 2005).
3.4.2 Linfociti T attivati con ConA.
I linfociti T sono stati ottenuti dalle cellule non aderenti dei PBMC coltivati per 24 ore. Le cellule non aderenti venivano trasferite in piastre da 24 pozzetti e attivate con 2,5 µg/ml di concanavalina A ( ConA)
3.4.3 Linea cellulare MBM.
Le cellule MBM sono una linea T-linfoide ottenuta nel nostro laboratorio da PBMC di un gatto SPF, negativo per tutti i retrovirus felini attualmente noti. Le MBM sono risultate pan-T+, CD3+, CD4- e CD8- ( Matteucci et al. 1995). Queste cellule crescono in sospensione e sono dipendenti da IL-2 ConA. Come i linfoblasti di primo isolamento, anche le MBM sono sensibili all’infezione con diversi ceppi di FIV. Se vengono infettate con il ceppo FIV M2 presentano un effetto citopatico di tipo litico. Per il nostro esperimento le MBM sono state coltivate con terreno completo addizionato con 3% plasma normale di gatto. Questo terreno viene addizionato con 20 U/ml di IL-2 ricombinante umana e una volta a settimana con 5μg/ml di conA. Due volte a settimana le cellule vengono contate, viene valutata la vitalità previa colorazione con Trypan Blue che viene incorporato dalle cellule morte. Tutte le colture cellulari sono incubate in termostato a 37° in presenza di CO2.
3.4.4 Linea cellulare FL4.
Si tratta di una linea linfoidi cronicamente infetta con FIV-Pet, mantenuta in terreno RPMI 1640 (sigma, Aldrich) addizionato con 10% di siero fetale, 2mM di l-glutammina ,1% di aa non essenziali.
3.5 Virus.
In questo esperimento sono stati usati due ceppi virali: FIV-M2 che appartiene al clade B cresciuto su MBM e FIV-Pet appartenente al clade A, che è stato ottenuto da supernatante di cellule FL4 cronicamente infette. Nei supernatanti si
misurava la p25 con metodo ELISA e se la D.O. risultava maggiore di 1.5 si procedeva alla titolazione virale.
3.6 Titolazione virale.
Per titolare il virus presente nei supernatanti si infettavano 105 MBM con 100μl di supernatante intero o diluito in base dieci in un volume finale di 200μl in piastre da 96 pozzetti, in quadruplicato. Dopo 3 giorni si cambiava metà terreno e si aggiungeva IL-2 e ConA alle colture. Dopo 7 giorni la piastra è stata centrifugata a 600 Xg 10 min a temperatura ambiente e sono stati prelevati 100μl di supernatante da ogni pozzetto e determinato il contenuto di p25 con il metodo ELISA. Il titolo è stato espresso comeDI50/ml con il metodo di Reed e Muench
(Reed e Muench 1938), che considera DI50 come il reciproco dell’ultima
diluizione in cui il contenuto di p25 è positivo. 3.7 Infezione delle cellule.
Le DC sono state infettate al 5° giorno di coltura. Al momento dell’infezione è stato rimosso il terreno e sono state aggiunte quantità diverse di M2 e FIV-Pet a seconda degli esperimenti. Per l’ infezione con il protocollo classico le cellule sono state incubate per 2h in termostato umidificato a 37° C. Per la spinoculazione le piastre vengono prima centrifugate a 1600 xg a 35° C per 45 minuti e poi incubate 2 ore a 37° C. A questo punto in entrambi i casi le cellule sono state lavate 2 volte e sono stati aggiunti 0.5 ml di terreno completo e la 3° dose di citochine. Le piastre poi sono state incubate in termostato fino ad un massimo di sei giorni. Nei giorni stabiliti sono stati prelevati 120μl di surpernatante da ogni pozzetto, per dosare la p25 e poter valutare l’eventuale crescita virale. Un’aliquota dell’ultimo lavaggio veniva prelevata da ogni pozzetto
e trasferita in una nuova piastra che veniva poi incubata come le piastre contenenti le cellule. La p25 misurata in questi pozzetti “cell-free” ci permette di valutare il virus residuo in ogni pozzetto ed è stato considerato come tempo zero. Quando necessario le DC presenti sul fondo dei pozzetti venivano staccate e usate in altri test.
3.8 Determinazione del contenuto di p25 con metodo ELISA.
La concentrazione del contenuto di p25 nel supernatante di cellule infette è stata determinata con il test dell’ELISA (Matteucci et al 1996). Sono stati utilizzati 100μl di supernatante raccolto a vari tempi. Per questo saggio sono stati usati due anticorpi monoclonali rivolti verso due epitopi diversi della p25, il primo che immobilizza la proteina sul substrato solido (coating), il secondo è biotinilato e serve alla rivelazione della proteina stessa. Il coating è stato effettuato con l’antiocorpo monoclonale DF3 diluito in tampone carbonato a PH 9,5 (Na2CO3
1,59 g/l, NaHCO3 2,93g/l, NaN3 0,2 gr/l) 100µl della diluizione sono stati
seminati in piastre ELISA, tenute a temperatura ambiente overnight. Il giorno dopo veniva lavata e veniva effettuato il post coating aggiungendo 100µl/pozzetto di anticorpo di PBS 1X-skin-milk 1% incubando la piastra per 1 ora. La piastra veniva di nuovo lavata e venivano seminati 10µl/pozzetto di tampone di lisi(Tween20 5ml/l, Triton 50ml/l,PBS 1X 950 ml/l) e 100µl/pozzetto di campione. La piastra è stata lasciata per 2 ore a temperatura ambiente e poi lavata. Sono stati aggiunti 100µl/pozzetto di PBS 1X-skin-milk 1% e siero fetale (0,5%) contenente l’anticorpo DF10 biotinilato diluito 1:4000 (da una soluzione madre a concentrazione 1mg/ml). La piastra è stata lasciata per 1 ora a temperatura ambiente lavata, 6 volte, dopodiché sono stati aggiunti 100µl/pozzetto di anticorpo secondario anti-biotina perossidata (SIGMA A4541)diluito 1:1000 in
una soluzione di PBS 1X- Tween 20 0,05%-skin-milk 1%. La piastra è stata lavata e lasciata a temperatura ambiente. Infine è stato fatto lo sviluppo con 100µl/pozzetto di una soluzione in parti uguali di perossido di idrogeno (0,02% in tampone) e substrato per la perossidasi ( TMB 4g/l in soluzione acquosa). I campioni positivi si colorano di blu più o meno intenso in base alla quantità di p25 presente. La reazione viene fermata aggiungendo ai pozzetti 100µl di H2SO4
1N che fa avvenire il viraggio dal blu al giallo della soluzione. La lettura delle piastre è stata fatta con uno spettrofotometro ad una densità ottica di 450-650 nm ( DO450 ). La DO450 di ogni pozzetto veniva confrontata don la DO450 dei pozzetti
contenenti solo PBS 1X. Un valore di DO450 5 volte superiore al valore del
campione negativo viene considerato positivo.
3.9 Staining intracellulare per p25.
Ai tempi indicati dall’infezione le DC o altri tipi di cellule sono state raccolte e fissate in PBS all’1% paraformaldeide e tenute per 20 min a 4°. Poi le cellule sono state lavate ed incubate in FACS-buffer (PBS, 0.2% BSA,0.01% NaN3) contenente saponina al 0.5% e 1 μg di DF10 un anticorpo monoclonale biotinilato anti-p25, per 1 h a temperatura ambiente. Le cellule sono state lavate in FACS buffer contenente 0.1% di saponina e marcate con streptavidina- FITC. Per esperimenti di infezione in trans è stata usata una miscela di DF10 e 0.1 μg/ml di anticorpo monoclonale PAK3-2C1 (AbD Serotec,Raleigh,NC). In questo caso, è stato usato come anticorpo secondario un antisiero anti-IgG di topo policlonale(Sigma). Dopo essere state risospese in FACS-buffer la cellule sono state analizzate al FACS.
La ricerca dell’effetto citopatico su DC infettate è stata fatta osservando le colture al microscopio ottico. Una volta accertata la presenza di sincizi le colture sono state colorate con cristal violetto al 0.3% in 20% di metanolo, per 10 minuti, lavate con acqua distillata, come descritto da Tozzini et al 1992. Campi di interesse sono stati fotografati con camera digitale con ingrandimento 400x .
3.11 Determinazione dei marcatori di superficie.
Il giorno dell’analisi, le DC sono state accuratamente staccate e risospese. Per proteggere la vitalità delle cellule la marcatura è stata fatta in RPMI, 0.2% BSA,0.1% Na azide in ghiaccio per 30 min. Le DC sono state colorate con anti-MHC di classe II e anti-B7.1 felino. Abbiamo usato come controllo negativo mAb L8D8 per tutti gli anticorpi che non ne avevano uno specifico. Le cellule venivano lavate in FACS-buffer e quindi marcate con un anti-siero policlonale anti-IgG di topo fluoresceinato per 30 minuti in ghiaccio. Prima dell’analisi le cellule venivano fissate in PBS,al 1% di paraformaldeide per 20 min in ghiaccio. Infine venivano acquisiti 10.000 eventi nel gate delle cellule vive con il software
cells quest con un FACScan (Becton-Dickinson, Milano, Italia) e l’ analisi è stata
fatta con WinMDI(gratis online).
3.12 Reazione allogenica.
Abbiamo valutato la maturazione delle DC misurando la loro abilità di stimolare PBMC allogenici a proliferare. Le DC vengono staccate e contate, aggiunte a 105 PBMC allogenici in piastre da 96 pozzetti in triplicato in rapporto
stimulator:responder 1:100 o 1:33. Le cellule vengono coltivate per 5 giorni in
RPMI 1640, al 10% di siero umano, 18 ore prima della raccolta si aggiunge 1 μCi/pozzetto di timidina triziata ( Amershan Biosience, Milano, Italia). Le cellule
vengono raccolte e l’incorporazione di timidina misurata con un beta-scintillation
counter; il risultato è espresso in colpi per minuto (cpm)
3.13 Saggio di trasmissione di FIV da DC a cellule T.
Le DC ottenute da 3 x 106 PBMC coltivati in piastre da 24 pozzetti al 5° giorno di coltura erano spinoculate con 450 o 150 DI50 di FIV-Pet, incubate per due ore a
37°C e lavate 2 volte. I PBMC non aderenti venivano coltivati per 48 ore in presenza di 2.5 µg/ml di ConA, dopo di che 5x105 venivano aggiunti alle DC infette e trattati come le DC. Abbiamo introdotto come controllo: 1) PBMC spinoculati con la stessa quantità di virus; 2) spinoculati con la stessa quantità di virus ma non lavati; 3) non infettati. Tutte le cellule venivano coltivate in un volume finale di terreno contenente IL-4, GMCSF, e 20ng/ml IL-2 per 48 e 96 h, poi le cellule venivano analizzate per l’espressione intracellulare della p25 con il FACS. A questi tempi veniva misurata la p25 nel supernatante delle colture.
