Modulo 5: Gli enzimi

Modulo 5: Gli enzimi

Cinetica della catalisi enzimatica

Se la stessa reazione è catalizzata da un enzima la sua cinetica cambia in questo modo. Si raggiunge una velocità massima (reazione di ordine 0)

v

[S]

P S

Effetto di saturazione La velocità di una reazione catalizzata da un enzima è influenzata da :

- quantità dell’enzima

- concentrazione di substrato - temperatura

- pH

V0

V₀

La velocità di reazione diminuisce con il passare del tempo:

• Il substrato si consuma

• La reazione è reversibile e la formazione del prodotto innesca la reazione contraria

• Il prodotto di reazione puo’ inibire l’attivita’ dell’enzima

• L’enzima puo’ andare incontro a denaturazione

k₃

Effetto della [S] sulla V _{0 :}

P E

ES S

E +

+

K_-1

k₂

Come valuto

l’effetto della variazione di [S] su V₀

V₀ = k₂[ES] vel. Iniziale di formazione di P

- La [S] >>>[E]

- La velocità di formazione di ES è uguale alla velocità di dissociazione del complesso

v formazione = k1[E][S]

v dissociazione =k_-1 [ES] + k2[ES]

Formazione dello STATO STAZIONARIO v_formazione = v dissociazione

k1[E][S] = [ES] (k-1 + k2) [E][S]/[ES] = (k-1 + k2)/k1

- k3 <<< k2 è perciò trascurabile

ASSUNZIONI

SI VUOLE trovare la relazione quantitativa tra [S] e V₀

Si ipotizza la formazione di un [ES]

a concentrazione costante

k₃

E P

ES S

E +

+

K_-1

k₂

- [E] = [E]_T - [ES]

Effetto della concentrazione di S sulla V _{0 :}

Come esprimo in quantità note [ES]? Non è facile da misurare sperimentalmente

Vel. di formazione ES: k₁[E][S] = k₁([E]_T - [ES])[S]

Vel. di scissione ES: (k_-1 + k₂)[ES]

k₁([E]_T - [ES])[S]=(k_-1 + k₂)[ES] ([ES] non varia nel tempo)

k₁[E]_T[S] – k₁[ES][S] = (k_-1 + k₂)[ES]

k₁[E]_T[S]= k₁[ES][S] + (k_-1 + k₂)[ES]

k₁[E]_T[S] = (k₁[S] + k_-1 + k₂)[ES] risolvo per [ES]

[ES]= k₁[E]_T[S] /k₁[S] + k_-1 + k₂ semplifico combinando le costanti

[ES]= [E]_T[S] /[S] + (k_-1 + k₂)/k₁ K_M = costante di M-M

P E ES

S

E +

+

K_-1

k₂

[ES]= [E]_T[S] /[S] + K_M

..riprendiamo l’equazione della velocità di formazione di P V₀ = k₂[ES]

Sostituisco [ES]:

V_o= k₂ [E]_T[S]/([S]+K_M) si può ulteriormente semplificare considerando

La velocità massima (V_max) si raggiunge quando tutti i siti catalitici sono occupati: [ES]=[E]_T

V_max= k₂[E]_T

V_o= V_max[S]/([S]+K_M) EQUAZIONE di MICHAELIS-MENTEN

Equazione della velocità di una reazione a singolo Substrato catalizzata da un enzima

Effetto della concentrazione di S sulla V

: l’equazione di Michaelis-Menten

L’equazione di Michaelis-Menten descrive la relazione tra la velocità₀, la velocità max e la concentrazione₀ di substrato.

P E

ES S

E +

+

K_-1

k₂

Assumendo che : 1. [E] << [S];

2. [P] » 0 ;

3. d[ES]/dt » 0 4. T, pH, = costanti

Km = costante di Michaelis K_m= (K_-1 + K₂)/ K₁

Cinetica enzimatica: dipendenza della V ₀ dalla concentrazione di S

Consideriamo i seguenti casi:

1. Quando [S] << K_m allora v = V_max[S]/K_m con V₀ proporzionale ad [S] (reazione di 1° ordine)

2. Quando [S] >> K_M; (K_m + [S]) ® [S]; V₀

® V_max la velocità diventa indipendente da [S].

1. Nel caso in cui [S] = K_M allora l’equazione 1 diventa v=1/2 Vmax

(1)

La K_m è numericamente uguale alla concentrazione di substrato alla quale la V₀ della reazione è metà della velocità massima (unità di misura della costante è la M)

Tale equazione si adatta alle osservazioni sperimentali?

K _M e V _max sono calcolati sperimentalmente

Dall’equazione: E’ difficile calcolare sia il valore di Vmax (è un valore asintotico), sia K_m

Si u?lizza, quindi, un sistema doppi dei reciproci per trasformarla in equazione di una reAa in cui 1/V₀ è espresso in funzione di 1/S.

1/ V₀ = K_m / V_maxS + 1/ V_max

Grafico dei doppi reciproci (Lineweaver-Burk)

y = mX + q m= K_m / V_max q = 1/V_max

Il valore di V_max e quello di K_M sono sperimentalmente calcolabili per ogni coppia enzima-substrato dalla v₀ di catalisi a diverse concentrazioni di substrato:

Significati della K _m

I valori di K_M variano da 10^-1 a 10^-7 M Significati:

1. è numericamente uguale alla [S]

alla quale metà dei siti di E sono saturati in cui V=1/2 V_max.

2. K_M fornisce una misura della concentrazione di S richiesta per la catalisi, spesso coincide con la concentrazione in vivo

Nel caso in cui k_-1 >>k₂ (comune) approssima la K_d del complesso ES quindi K_m è una forza del complesso ES: un piccolo valore di K_m indica un’elevata affinità per il substrato

P E

ES S

E +

+

K_-1

K₂ K_m= (K_-1+ K₂)/ K₁

La costante catalitica K _cat

Enzima Substrato k_cat(sec^-1) K_M(M)

Catalasi H₂O₂ 4.0x10⁷ 1.1

Anidrasi Carbonica CO₂ 6.0x10⁵ 1.2x10^-2 Acetilcolinesterasi Aceticolina 1.4x10⁴ 9.0x10^-5

Fumarasi Fumarato 8.0x10² 5.0x10^-6

Quando l’enzima è totalmente saturato dal substrato: V_max = k₂[E_T]

k₂ è sostituita da una costante più generale k_cat per enzimi che seguano il modello di reazione di M & M e con reazioni a più passaggi.

V_max = k_cat[E]_T

La costante catalitica K_cat(numero di turnover) dell' enzima rappresenta il numero massimo di molecole di substrato convertite in prodotto per sito attivo e per unità di tempo.

Il rapporto k

/K

è una misura dell’efficienza catalitica

Enzima Substrato k_cat(sec^-1) K_M(M) k_cat/ K_M (M^-1) (sec^-1)

Catalasi H₂O₂ 4.0x10⁷ 1.1 4.0x10⁷

Anidrasi Carbonica CO₂ 1.0x10⁴ 1.2x10^-2 8.3x10⁷ Acetilcolina esterasi Aceticolina 1.4x10⁴ 9.0x10^-5 1.6x10⁸

Fumarasi Fumarato 8.0x10² 5.0x10^-6 1.6x10⁸

In condizioni fisiologiche gli enzimi raramente sono saturati da S 0,1 K_M < [S]< 1 K_M

Per esprimere l’efficienza catalitica in condizioni non saturanti:

V₀ = k_cat / K_M [E]_T[S]

La costante di velocità K_cat/K_M è una misura dell’efficienza catalitica dell’enzima, cioè di quanto efficacemente un enzima è in grado di legare il suo substrato (K_M) e di catalizzare la sua trasformazione in prodotto (V di catalisi (K_cat)

Dai valori k

/K

si può comparare la preferenza di un enzima per diversi substrati

Amminoacido presente a monte del sito di taglio

Catena laterale k_cat/ K_M (M^-1) (sec^-1)

Glicina ^{-H 0,13}

Valina ^{-CH 2}

Norvalina ^-CH2CH₂CH₃ 3,6 x 10²

Fenilalanina ^-CH2-phenile 1 x 10⁵

Il rapporto k_cat/K_M consente di valutare direttamente l’efficienza dell’enzima rispetto a diversi substrati

Grado di preferenza della chimotripsina per diversi substrati

CH₃ CH₃

Gli enzimi allosterici non obbediscono alla cinetica secondo Michaelis-Menten

Un importante gruppo di enzimi regolatori non obbedisce alle modello cinetico di M & M : gli enzimi allosterici.

Possiedono più subunità (e quindi piu siti attivi).

Andamento sigmoidale delle cinetiche enzimatiche.

Il legame del substrato ad un sito attivo altera le proprietà degli altri siti attivi nella stessa molecola enzimatica:

effetto cooperativo. (vedi emoglobina).

L’attività degli enzimi allosterici sono regolate da effettori allosterici.

Gli enzimi posso essere soggetti ad inibizione

Inibitori enzimatici: utili per comprendere il meccanismo d’azione degli enzimi. Molti farmaci sono importanti inibitori di enzimi:

Il tipo di legame può essere di due tipi:

Inibitori reversibili

Inibitori irreversibili

Azione può essere rimossa

allontanando l’inibitore. Legami non covalenti con l’enzima. La loro azione può essere descritta dall’equazione M&M. Inibizione competitiva e non competitiva.

Alterano fisicamente gli enzimi bersaglio legandosi saldamente (covalentemente). Le conseguenze sono permanenti sull’enzima. Equivalgono

ad una diminuzione della

concentrazione dell’enzima.

Inibizione competitiva e non competitiva

Come stabilire se un inibitore è competitivo o non competitivo ?

Inibizione competitiva

K_M aumenta v_max non varia Inibizione competitiva: l’inibitore (I) si lega solo all’enzima E, allo stesso sito di legame del substrato. Diminuisce la frazione di molecola enzimatiche legate al substrato

( 1 +

) _{+ [S]}

m

•max

o

K

[S]

= V

K

v

Importanti farmaci sono inibitori competitivi di enzimi

L’antitumorale metotrexato si lega alla diidrofolato reduttasi, enzima che partecipa alla sintesi dei nucleotidi con affinità 1000 volte maggiore al substrato naturale.

In rosso le differenze strutturali

Il metotrexato è un inibitore competitivo della diidrofolato reduttasi

Inibitori competitivi: substrati metabolizzabili ( metotrexato, ibuprofene, etanolo) oppure non metabolizzabili (malonato)

L’etanolo è usato come antidoto

nell’avvelenamento da metanolo

Inibizione non competitiva: l’inibitore (I) si lega sia all’enzima E, che a ES presso un sito diverso dal sito attivo. Abbassa la concentrazione dell’enzima funzionale

K_m resta uguale (raro)

o aumenta (comune, inibizione mista)

v_max decresce

Inibizione non competitiva

[S]

+ K

V [S]

= V

m max o

•

Ki +[I]

1

Esercizio

Durante lo studio di una cinetica enzimatica sono stati ottenuti i seguenti dati in assenza ed in presenza di un inibitore (I).

[S]

µ

v

-I mmoli/min

v

+I mmoli/min

3 10.4 4.1

5 14.5 6.4

10 22.7 11.4

30 34.5 22.7

100 40 34.5

a. Determinare graficamente il valore di K_M e Vmax in presenza e assenza di inibitore.

b. Spiegate di che tipo di inibizione si tratta.

1/[S]

µ

+I 1/v mmoli/min

0.33 0.096 0.244

0.20 0.069 0.156

0.10 0.044 0.088

0.03 0.029 0.044

0.01 0.025 0.029

-I

-Inibitore

-1/K_M = -0.1 K_M = 10 µM

1/v_max = 0.022 v_max = 45.5 mmoli/min +Inibitore

-1/K_M = -0.03 K_M = 33.3 µM

1/v_max = 0.022 v_max = 45.5 mmoli/min

b. Si tratta di una inibizione competitiva poiché la v_max è la stessa mentre la K_M in presenza di inibitore è più grande.

Risultati

+I

Gli inibitori irreversibili possono

permettere di individuare il sito attivo

Il DIPF (gas nervino) (diisopropilfluorofosfato) Si lega a OH delle serine: indica che sono Ser attive. Es:

inattiva le acetilcolinesterasi,

La iodoacetammide può inattivare un enzima reagendo con un residuo si cisteina essenziale per la catalisi

I categoria: reagenti gruppo specifici

Gli inibitori irreversibili possono essere divisi in: (1) reagenti gruppo-specifici, (2) analoghi del substrato, (3) inibitori suicidi.

Inibitori irreversibili: analoghi del substrato

Sono molecole che mimano i substrati naturali, si legano covalentemente al sito catalitico dell’enzima. Sono più specifici per il sito attivo, rispetto ai reagenti gruppo sp.

TPCK = tosil-L-fenilalanina cloro metil chetone – analogo del substrato regisce irreversibilmente con un residuo di His inibendo l’enzima chimotripsina

Gli analoghi dello stato di transizione sono potenti inibitori

Composti simili allo stato di transizione (analoghi dello stato di transizione) sono potenti inibitori enzimatici.

La racemizzazione della prolina da L a D procede attraverso uno stato di transizione in cui il C α tetraedrico diventa trigonale.

Il pirrolo 2 carbossilato (con C α trigonale) si lega alla racemasi 160 volte più saldamente della prolina

Inibitori irreversibili: La penicillina, un inibitore suicida.

La struttura della penicillina

Schema della struttura della parete batterica di Staphylococcus aureus

La penicillina inattiva irreversibilmente un’enzima chiave della sintesi della parete batterica.

Ponte di pentaglicina Tetrapeptide L-ala-D-glu-L-Lys-D-ala

Blocca la formazione dei ponti trasversali di pentaglicina

polisaccaride

L’azione della transpeptidasi e formazione dei legami trasversali

Nella parete della cellula il gruppo -NH₂della pentaglicina attacca il legame peptidico tra le due D-ala per formare un legame trasversale. Reazione catalizzata dalla glicopeptide transpeptidasi

Nella reazione transpeptidasica si forma un intermedio acil-enzima

La penicillina mima il dipeptide D- ala-D-ala e si lega alla peptidasi

La penicillina si lega al sito attivo dell’enzima (presente una Ser) formando un complesso inattivo. Il complesso non procede oltre, la transpeptidasi è inibita arrestando la sintesi della parete

Il residuo di Ser attacca il carbonio carbonilico dell’anello lattamico molto reattivo per formare il derivato penicillil-enzima