LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
Mant
ė Almanaitytė
MAGNIU-REGULIUOJAMI TRPM7
KANALAI ŽMOGAUS PRIEŠIRDŽIO
MIOCITUOSE
Daktaro disertacijaGamtos mokslai, biofizika (N 011)
Disertacija rengta 2013–2020 metais Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos akademijos Kardiologijos instituto Membranų biofizikos labora-torijoje.
Mokslinė vadovė
dr. Regina Mačianskienė (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, gamtos mokslai, biofizika – N 011).
Disertacija ginama Lietuvos sveikatos mokslų universiteto biofizikos mokslo krypties taryboje:
Pirmininkė
prof. dr. Vilmantė Borutaitė (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, gamtos mokslai, biologija – N 010).
Nariai:
prof. dr. Aidas Alaburda (Vilniaus universitetas, gamtos mokslai, biofizi-ka – N 011);
dr. Gytis Baranauskas (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, gamtos mokslai, biofizika – N 011);
doc. dr. Giedrius Kanaporis (Rush’o universiteto medicinos centras, JAV, gamtos mokslai, biofizika – N 011);
prof. dr. Saulius Šatkauskas (Vytauto Didžiojo universitetas, gamtos mokslai, biofizika – N 011).
Disertacija ginama viešame biofizikos mokslo krypties tarybos posėdyje 2020 m. spalio 29 d. 14 val. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Kardio-logijos instituto posėdžių salėje.
LITHUANIAN UNIVERSITY OF HEALTH SCIENCES MEDICAL ACADEMY
Mant
ė Almanaitytė
MAGNESIUM-REGULATED TRPM7
CHANNELS IN HUMAN ATRIAL
MYOCYTES
Doctoral DissertationNatural Sciences, Biophysics (N 011)
Dissertation has been prepared at the Institute of Cardiology of Medical Academy of Lithuanian University of Health Sciences during period 2013 to 2020.
Scientific Supervisor
Dr. Regina Mačianskienė (Lithuanian University of Health Sciences, Natural Sciences, Biophysics – N 011).
Dissertation is defended at the Biophysics Research Council of the Lithuanian University of Health Sciences:
Chairperson
Prof. Dr. Vilmantė Borutaitė (Lithuanian University of Health Sciences, Natural Sciences, Biology – N 010).
Members:
Prof. Dr. Aidas Alaburda (Vilnius University, Natural Sciences, Bio-physics – N 011);
Dr. Gytis Baranauskas (Lithuanian University of Health Sciences, Natural Sciences, Biophysics – N 011);
Assoc. Prof. Dr. Giedrius Kanaporis (Rush University Medical Centre, US, Natural Sciences, Biophysics – N 011);
Prof. Dr. Saulius Šatkauskas (Vytautas Magnus University, Natural Sciences, Biophysics – N 011).
Dissertation will be defended at the open session of the Biophysics Research Council of Lithuanian University of Health Sciences on 29th of October, 2020, at 2 pm in the Auditorium of Institute of Cardiology, Lithuanian University of Health Sciences.
5
TURINYS
SANTRUMPOS IR SUTARTINIAI ŽYMĖJIMAI ... 7
ĮVADAS ... 10
DARBO TIKSLAS, MOKSLINIS NAUJUMAS ... 12
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 14
1.1. Širdies ir kraujagyslių ligos ... 14
1.2. Jonų kanalai širdyje ... 15
1.2.1. Elektrinis impulso sklidimas ir veikimo potencialas ... 15
1.2.2. Jonų kanalai širdies ląstelėse ... 17
1.3. TRP kanalai ... 20
1.3.1. TRP kanalų atsiradimo istorija ... 20
1.3.2. TRP kanalų šeima ... 21
1.3.3. TRP kanalų savybės ... 22
1.3.4. TRP kanalų pasiskirstymas ... 25
1.4. TRPM kanalų pošeimis ... 29
1.5. TRPM7 kanalai ... 33
1.5.1. TRPM7 kanalų atradimo istorija ... 33
1.5.2. TRPM7 kanalų struktūra ... 33
1.5.3. TRPM7 kanalo savybės ... 34
1.5.4. Receptorinės tirozino kinazės savybės ir reguliacija ... 35
1.5.5. TRPM7 vaidmuo receptorinės tirozino kinazės signaliniame kelyje ... 36
1.5.6 Fiziologinė/patofiziologinė TRPM7 kanalų reikšmė ... 39
2. MEDŽIAGOS IR METODAI ... 42
2.1. Etinis patvirtinimas ... 42
2.2. Tyrimo objektai ... 42
2.3. Žmogaus prieširdžio ląstelių izoliavimas ... 43
2.4. Elektrofioziologiniai TRPM7-tipo srovių matavimai ... 45
2.5. Širdies izoliavimo procedūros ... 51
2.6. Elektrinių signalų registravimas mikroelektrodais ... 52
2.7. Elektrinių signalų registravimas optiniu būdu ... 52
2.8. Susitraukimo jėgos registravimas ... 53
2.9. Genų raiška ... 54
2.10. Imunoblotas (Western blot) ... 54
2.11. Imunofermentinė analizė (ELISA) ... 56
2.12. Imunofluorescencija ... 57
2.13. Tirtos/naudotos medžiagos ... 57
2.14. Statistinė analizė... 58
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 59
3.1. Biofizikinis TRPM7-tipo srovių charakterizavimas žmogaus prieširdžio miocituose ... 59
3.1.1. TRPM7-tipo srovių nustatymas žmogaus prieširdžio miocituose ... 59
3.1.2. Ekstraląstelinių dvivalenčių katijonų įtaka TRPM7-tipo srovėms ... 61
3.1.3. Viduląstelinių komponentų įtaka TRPM7-tipo srovėms ... 63
3.1.4. TRPM7-tipo srovių nustatymas žmogaus prieširdžio miocituose fiziologinėmis sąlygomis ... 66
6
3.1.5. TRPM7-tipo srovių potenciavimas dializuojant miocitus su fiziologine
Mg2+ koncentracija ... 67
3.1.6. TRPM7-tipo srovių išskyrimas iš kitų joninių srovių žmogaus kardiomiocituose ... 71
3.1.7. TRPM7-tipo srovių jautrumo viduląsteliniam Mg2+ nustatymas ... 72
3.1.8. Magnio pralaidumo nustatymas per TRPM7-tipo kanalus ... 74
3.1.9. TRPM7-tipo srovių aktyvinimosi nustatymas bazinėmis sąlygomis ... 76
3.2. Farmakologinis TRPM7 patvirtinimas, naudojant TRPM7 kanalų inhibitorius... 80
3.2.1. TRPM7 inhibitorių poveikis TRPM7-tipo srovėms žmogaus prieširdžio miocituose ... 80
3.2.2. TRPM7 inhibitorių poveikis susitraukimo jėgai žmogaus širdies trabekulose ... 83
3.2.3. Karvakrolio poveikis optinių veikimo potencialų erdvinės ir laikinės dinamikos pokyčiams Langendorff-sistemoje perfuzuotame žmogaus širdies skilvelyje ... 85
3.3. Molekulinis endogeninių TRPM7 kanalų patvirtinimas žmogaus dešiniajame prieširdyje ... 90
3.3.1. TRPM7 geno raiškos nustatymas ... 90
3.3.2. TRPM7 baltymo nustatymas WB ir ELISA metodais ... 91
3.3.3. TRPM7 baltymo nustatymas kardiomiocituose imunofluorescencijos metodu ... 92
3.3.4. TRPM7 kanalų blokatorių įtaka imunofluorescencijai ... 94
3.4. TRPM7-tipo srovių moduliavimas ekstraląsteliniu pH ... 96
3.4.1. TRPM7-tipo srovių moduliavimas pHo esant ekstraląsteliniams DV katijonams ... 96
3.4.2. TRPM7-tipo srovių moduliavimas ekstraląsteliniu pH be DV katijonų ... 99
3.4.3. TRPM7-tipo srovių moduliavimas ekstraląsteliniu pH fiziologinėmis sąlygomis ... 102
3.5. TRPM7 kanalų vaidmuo žmogaus širdyje ... 103
3.5.1. TRPM-tipo srovių variabiliškumas žmogaus prieširdžio miocituose, esant PV... 103
3.5.2. Kliniškai nustatytos patologijos įtaka TRPM7-tipo srovių variabiliškumui ... 105
3.5.3. Išeminės širdies ligos įtaka ekstraląstelinio pH poveikiui TRPM7-tipo srovėms... 106
IŠVADOS ... 109
TYRIMO TRŪKUMAI ... 111
AUTORIAUS ASMENINIS INDĖLIS ... 112
SUMMARY ... 113
BIBLIOGRAFIJOS SĄRAŠAS ... 162
MOKSLINĖS PUBLIKACIJOS ... 182
CURRICULUM VITAE ... 216
7
SANTRUMPOS IR SUTARTINIAI ŽYMĖJIMAI
2-APB – 2-aminoetildifenilboratas
[Ca2+]i – Ca2+koncentracija ląstelės viduje [Mg2+]i – Mg2+ koncentracija ląstelės viduje ACTB – β-aktinas
ADF – adenozin-5’-difosfatas AMF – adenozin-5’-monofosfatas AoV – aortos vožtuvas
ATF – adenozin-5’-trifosfatas AV – atrioventrikulinis
AVN – atrioventrikulinis mazgas CABG – vainikinių arterijų šuntavimas
CAR – karvakrolis (natūralus monociklinis monoterpenoidas; 5-Isopropyl-2-methylphenol; angl. carvacrol)
DNR – deoksiribonukleorūgštis DP – dešinysis prieširdis DS – dešinysis skilvelis DV – dvivalenčiai katijonai
EGF – epidermio augimo faktorius (angl. epidermal growth factor) EGFR – epidermio augimo faktoriaus receptorius (angl. epidermal growth
factor receptor)
ELISA – imunofermentinė analizė (angl. Enzyme-Linked Immuno Sorbent
Assay)
ERK – ekstraląsteliniu būdu reguliuojama kinazė (angl. extracellular-
regulated kinase) Erev – reversinis potencialas
FGF – fibroblastų augimo faktorius (angl. fibroblast growth factor)
ICaL – lėta L-tipo Ca2+srovė
ICaT – greita T-tipo Ca2+srovė IHC – imunohistochemija
IK1 – bazinė vidinio-išlyginimo K+ srovė
IK2P – nuotėkio (angl. leak) srovės
IKACh – muskarininių receptorių reguliuojama vidinio-išlyginimo K+ srovė
IKATF – ATF-reguliuojama vidinio-išlyginimo K+ srovė IKr – greita uždelsto-išlyginimo K+srovė
IKs – lėta uždelsto-išlyginimo K+srovė
IKur – labai greita uždelsto-išlyginimo K+ srovė INa – greita Na+srovė
8
INCX – Na+-Ca2+mainų sistemos srovė IsH – in situ hibridizacija
IŠL – išeminė širdies liga
IŠN – išeminės kilmės širdies nepakankamumas
Ito1 – trumpalaikė K+srovė
Ito2 – Ca2+-aktyvuota chloro srovė
I-V – srovės-įtampos priklausomybė
KP – kairysis prieširdis
LAD – kairioji vainikinė nusileidžiančioji koronarinė arterija (angl. left
anterior descending coronory artery)
LSMU – Lietuvos sveikatos mokslų universitetas KS – kairysis skilvelis
LED – šviesos diodas (angl. light emitting diode)
NGF – nervų augimo faktorius (angl. nerve growth factor) NS – neselektyvūs kanalai
MAP – mitogenų aktyvinamos proteinkinazės
MAPK – mitogenų aktyvinama baltymų kinazė (angl. mitogen activated
protein kinase)
MC – vienvalenčių jonų srovės (angl. monovalent currents) Mg·ATF – magnio ATF druska
MI – miokardo infarktas
MIC – magniu blokuojami kanalai (angl. magnesium inhibited channels) MS – masių spektrometrija
MV – mitralinis vožtuvas
PDGF – trombocitų kilmės augimo faktorius (angl. platelet-derived
growth factor)
PFA – paraformaldehidas
PGR – polimerazinė grandininė reakcija PIP2 – fosfatidilinozitolio 4,5 bifosfatas PKA – baltymų kinazė A
PKC – baltymų kinazė C PKG – baltymų kinazė G PLC – fosfolipazė C
PSO – pasaulinė sveikatos organizacija PV – prieširdžių virpėjimas
RNR – ribonukleino rūgštis RP – ramybės potencialas RTK – receptorinė tirozino kinazė SpM4+ – sperminas (keturvalentis) SR – sinusinis ritmas
9 ŠLS – širdies laidžioji sistema ŠN – širdies nepakankamumas TEA – tetraetilamonio chloridas TKR – treonino kinazės receptorius
TRP – receptorių trumpalaikio atsako į potencialą kanalai (angl. Transient Receptor Potential channels)
TRPA – ankirino TRP kanalai (angl. TRP channels of Ankyrin) TRPC – kanoniniai TRP kanalai (angl. TRP channels of Canonical) TRPM – melastatino TRP kanalai (angl. TRP channels of Melastatin) TRPM7 – receptorių trumpalaikio atsako į potencialą, melastatino-7
pošeimio kanalai (angl. Transient Receptor Potential channels
of Melastatin-7 family)
TRPML – mukolipino TRP kanalai (angl. TRP channels of Mukolipin) TRPN – kanalai be mechanoreceptorinio potencialo
TRPP – policistino TRP kanalai (angl. TRP channels of Polycystin) TRPV – vaniloidiniai TRP kanalai (angl. TRP channels of Vanilloid) TRPY – mielių TRP kanalai (angl. TRP channels of Yeast)
VEGFR – kraujagyslių endotelio augimo faktoriaus receptorius (angl. vascular endothelial growth factor)
VP – veikimo potencialas VPT – veikimo potencialo trukmė VV – vienvalenčiai katijonai
WA – natūralus terpenoidas išskirtas iš koralų (angl. Waixenicin A) WB – imunoblotas (angl. Western Blot)
10
ĮVADAS
Receptorių trumpalaikio atsako į potencialą, melastatino-7 šeimos, kanalai (TRPM7; angl. Transient Receptor Potential channels of Melastatin-7 family) yra aptinkami visų tipų ląstelėse (1). Heterologiškai ekspresuoti ir gamtinės kilmės TRPM7 kanalai yra pastoviai aktyvūs ramybės būsenoje (2, 3) ir, skirtingai nei kiti TRP kanalai, į ląstelės vidų praleidžia Mg2+, Ca2+ (2, 4) ir kitus dvivalenčius katijonus (5, 6). Svarbu tai, kad šie kanalai praleidžia Mg2+ jonus į ląstelės vidų, tačiau vos patekę į ją, Mg2+ blokuoja srovę per TRPM7 kanalus (toliau TRPM7-tipo srovė).
Taigi, pagrindinė šių kanalų savybė yra ta, kad patys kanalai mažina sroves per juos (angl. down-regulation), esant fiziologinei (4–6 mM) laisvo ir su ATF surišto viduląstelinio Mg2+ koncentracijai (2, 5, 7). Kaip pasekmė, fiziologinėmis sąlygomis TRPM7-tipo srovės yra mažos ir sunkiai identifikuojamos fiksuotos įtampos patch-clamp metodu TRPM7-ekspre-suojančiose žinduolių ląstelėse, tokiose kaip gamtinės kilmės RBL ląstelėse, žmogaus Jurkat T ląstelėse (2, 4, 6–8), širdies fibroblastuose (8) ir sveikų gyvūnų kardiomiocituose (9, 10).
Iš ląstelės išeinančioms TRPM7-tipo srovėms yra charakteringa stipri išeinančių srovių rektifikacija (angl. outward rectification) (2, 4), kuri greitai išsivysto sumažėjus viduląsteliniam Mg2+ ([Mg2+]i) ir/ar Mg∙ATF ([Mg∙ATF]i). TRPM7 kanalų aktyvavimui paprastai naudojami Cs+-pagrindu paruošti vidiniai dializės tirpalai be Mg2+jonų, kurių sudėtyje yra chelatorių, tokių kaip BAPTA, EGTA, EDTA ir kitų. Tačiau TRPM7-tipo srovių tankis užregistruotas tokiomis eksperimentinėmis sąlygomis tarp skirtingų tipų ląstelių labai skiriasi.
Nors šie kanalai yra plačiai ekspresuoti širdyje, tačiau iki šiol tik dvi mokslininkų grupės, tame tarpe ir mūsų, pademonstravo Mg2+-jautrią srovę per TRPM7 kanalus žmogaus prieširdžio miocituose (11–13). Taip yra todėl, kad TRPM7-tipo srovės per gamtinius TRPM7 kanalus žmogaus kardio-miocituose fiziologinėmis sąlygomis yra labai mažos, kas apsunkina jų identifikavimą elektrofiziologiniais tyrimo metodais. Be to, iki šiol dar nėra atrasta specifinių farmakologinių medžiagų, kurios selektyviai blokuotų TRPM7 kanalus ir tokiu būdu leistų lengvai atskirti TRPM7-tipo sroves nuo kitų srovių. Taip pat, stoka selektyvių blokatorių, galinčių pašalinti kitus įtampa- ir ligandais-valdomus jonų laidumus (angl. conductances) per įvai-rius kardiomiocituose ekspresuotus jonų kanalus, padaro šiuos tyrimus prob-lemiškais. Dėl paciento amžiaus, gretutinių ligų, bei taikyto medikamentinio gydymo atsiradę papildomi jonų sroves moduliuojantys pokyčiai neabejotinai apsunkina gautų tyrimų rezultatų interpretaciją.
11
Epidemiologinių tyrimų duomenimis, viduląstelinio magnio jonų sumažė-jimas gali būti sietinas su daugeliu širdies patologijų. TRPM7 dalyvauja širdies ligų, tokių kaip prieširdžių virpėjimo (14, 15) ir išemijos/reperfuzijos sukeltų miokardo pažeidimų (17) patofiziologijoje. Taip pat, TRPM7 yra svarbūs ankstyviosiose kardiogenezės stadijose (16).
Šio tyrimo metu, naudojant elektrofiziologines, farmakologines ir mole-kulines metodikas siekėme nustatyti ar žmogaus širdyje endogeniškai eks-presuoti TRPM7 kanalai prieširdžio ląstelėse pasižymi tokiomis pačiomis savybėmis, kaip ir TRPM7-ekspresuojančiose žinduolių ląstelėse. Taip pat siekėme įvertinti, ar jau esanti širdies patologija, kilusi dėl remodeliavimosi procesų vystantis širdies nepakankamumui žmogaus širdyje, gali moduliuoti TRPM7 kanalų aktyvumą. Problema aktuali, o naujų mechanizmų išaiški-nimas bei naujų biomarkerių paieška išlieka labai svarbūs.
12
DARBO TIKSLAS, MOKSLINIS NAUJUMAS
Hipotezės1. TRPM7-tipo srovės žmogaus širdyje pasižymi panašiomis elektrofizio-loginėmis, biofizikinėmis, farmakologinėmis ir molekulinėmis savybėmis, kaip ir heterologiškai ekspresuotų TRPM7 kanalų srovės. TRPM7 baltymo ekspresija žmogaus kardiomiocituose koreliuoja su TRPM7-tipo srovių, registruojamų patch-clamp būdu, tankiu.
2. Žmogaus širdyje, TRPM7 kanalai funkcionuoja fiziologinėmis sąlygomis ir dalyvauja širdies remodeliavimosi procesuose sietinuose su prieširdžių virpėjimu ir išemine širdies liga.
Darbo tikslas
Charakterizuoti Mg2+-jautrių TRPM7 kanalų vaidmenį žmogaus širdyje, siekiant nustatyti jų molekulinį identitetą ir ištirti jų funkcijas žmogaus širdies kardiomiocituose fiziologinėmis ir patofiziologinėmis sąlygomis.
Uždaviniai:
1. Nustatyti ir charakterizuoti TRPM7-tipo srovių biofizikines savybes žmo-gaus prieširdžio miocituose.
2. Ištirti/nustatyti farmakologinį TRPM7 kanalų moduliavimą širdyje. 3. Patvirtinti TRPM7 kanalų molekulinį identitetą ir jų pasiskirstymą
žmogaus prieširdžio miocituose.
4. Nustatyti TRPM7-tipo srovių reguliavimą protonais žmogaus širdies mio-cituose.
5. Nustatyti TRPM7 funkcijos moduliavimą žmogaus širdyse su širdies ne-pakankamumu.
Mokslinis naujumas
Domėjimasis TRPM7 kanalais ženkliai išaugo tik atradus, kad šie kanalai dalyvauja daugelyje fiziologinių/patofiziologinių procesų. Mūsų ir dar viena mokslinė grupė anksčiau parodė, kad TRPM7-tipo srovės gali būti išma-tuotos žmogaus prieširdžio miocituose naudojant vidinius dializės tirpalus be Mg2+jonų.
Šio tyrimo metu pirmiausia parodome, kad TRPM7-tipo srovės gali būti išmatuotos fiziologinėmis sąlygomis, kai šios srovės būna iš anksto preaktyvintos jau bazinėmis sąlygomi, esant tokioms širdies patologijoms kaip prieširdžių virpėjimas ir išeminė širdies liga. Be to, mes nustatėme, kad TRPM7-tipo srovės yra bazinės srovės sudedamoji dalis ir taip pat demons-truojame jos amplitudės variabiliškumą. Šie tyrimų duomenys atskleidžia,
13
kad TRPM7 kanalai žmogaus širdyje gali būti pastoviai aktyvūs per se, o taip pat ir sąryšyje su atitinkama širdies patologija. Tai nauji duomenys ir jie labai skiriasi nuo tyrimų duomenų gautų įvairių gyvūnų rūšių sveikose skilvelio ląstelėse.
Mes taip pat demonstruojame mažesnį TRPM7 jautrumą žmogaus prie-širdžio miocituose viduląsteliniam Mg2+ ir teigiame, kad TRPM7 kanalai yra aktyvūs fiziologinėmis sąlygomis sergančio/pagyvenusio žmogaus širdyje. Naujai nustatėme, kad žmogaus prieširdyje, nepriklausomai ar žmogaus širdis dirbo sinusiniu ritmu, ar buvo prieširdžių virpėjimo patologija, yra stebimas padidėjęs TRPM7 vaidmuo ir kad šie kanalai yra svarbūs vykstant remodeliavimuisi susijusiam su išemine širdies liga.
14
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Širdies ir kraujagyslių ligosPasaulinės sveikatos organizacijos (PSO) duomenimis Lietuvoje širdies ir kraujagyslių ligomis (ŠKL) serga ~1,3 mln. žmonių, iš jų 130 tūkst. nustatytas širdies nepakankamumas (ŠN). Ši patologija dažnai lemia ir aukštus Lietuvos gyventojų mirtingumo rodiklius. Pagal mirčių nuo ŠKL skaičių Lietuva yra viena pirmųjų Europoje.
Širdies nepakankamumas, tai daugelio ŠKL (miokardo infarkto, širdies ydų, arterinės hipertenzijos, išeminės širdies ligos) komplikacija. Ši pato-logija gali išsivystyti susirgus ir kitomis sunkiomis, t. y. plaučių ar skydliau-kės ligomis. ŠN atsiranda, kai nusilpsta širdies raumuo ir širdis nesugeba užtikrinti efektyvios kraujotakos. Viena retesnių priežasčių – įgimtos širdies ligos. Vis dėlto, išeminės kilmės širdies nepakankamumas (IŠN) yra vy-raujantis ir šios ligos formavimąsi ir progresavimą lemiančių molekulinių-patologinių mechanizmų nustatymas yra viena svarbiausių medicinos problemų.
Nors širdies nepakankamumo mechanizmai gana plačiai ištyrinėti, ta-čiau tobulėjant genetinei, molekulinei, elektrofiziologinei ir kitai biologinių audinių/ląstelių tyrimuose naudojamai technikai vis dažniau identifikuojami nauji genai/baltymai, išaiškinami nauji mechanizmai, kurie vienaip ar kitaip gali prisidėti prie ŠN ir kitų širdies ir kraujagyslių ligų valdymo.
Įvykus struktūriniam miokardo persitvarkymui (hipertrofuoja kardiomio-citai, pakinta tarpląstelinis matriksas, didėja fibroblastų skaičius, formuojasi fibrozė) pakinta ir elektrinio signalo tarp ląstelių perdavimas. Tarp kardio-miocitų ir fibroblastų yra nustatyti elektriniai ryšiai (15), todėl šie struk-tūriniai pokyčiai gali daryti įtaką širdies kardiomiocitų aktyvumui, kurį sąlygoja kanalų, reguliuojančių jonų apykaitą, funkcionavimas. Naujausi ty-rimai parodė, kad fibrozės formavime dalyvaujantys Ca2+ jonai į fibroblastus patenka ne per L-tipo Ca2+-kanalus, o tik per TRPM7 kanalus ir fibroziniame audinyje ši srovė yra ženkliai padidėjusi esant prieširdžių virpėjimui (14). Nustatyta, kad TRPM7 kanalai žmogaus (11, 13) ir gyvūnų širdies kardio-miocituose (10) dalyvauja ne tik Ca2+ bet ir Mg2+bei kitų dvivalenčių jonų apykaitoje (2). TRPM7 kanalai yra pastoviai aktyvūs diastolės metu ir atsako už Mg2+ jonų homeostazę širdyje (18, 19).
Ne visų naujai identifikuotų genų/baltymų svarba yra žinoma, o taip pat vis dar yra neišaiškinta jų signalinių kelių ir veikimo mechanizmų reikšmė ligų patogenezėje. Problema aktuali, o naujų mechanizmų išaiškinimas bei naujų biomarkerių paieška išlieka labai svarbūs.
15
1.2. Jonų kanalai širdyje
Jonų kanalai yra multimeriniai membraniniai baltymų kompleksai, pa-lengvinantys jonų difuziją per ląstelės membraną. Pagrindinė jonų kanalų funkcija yra svarbi daugeliui ląstelių procesų, tokių kaip membranos po-tencialo palaikymas ir veikimo potencialų sklidimas. Nepaisant to, jonų kanalai yra daugiau nei ląstelių paviršiaus porų baltymai; įvairios jonų kanalų grupės veikia kaip ląstelės paviršiaus receptoriai ir vaidina svarbų fiziologinį vaidmenį perduodant ląstelių signalus.
1.2.1. Elektrinis impulso sklidimas ir veikimo potencialas
Širdies laidžioji sistema (ŠLS) – tai specializuotas širdies audinys, nuo kurio priklauso širdies susitraukimo ciklas. Elektrinis impulsas sklindantis ŠLS sužadina atskiras širdies raumens sritis generuojamas dešiniojo prie-širdžio (DP) sinusinio mazgo peismeikerinėse (angl. pacemaker) ląstelėse. Toliau iš sinusinio mazgo impulsas sklinda iki atrioventrikulinio mazgo, esančio tarp prieširdžių ir skilvelių. Lėtai sklisdamas pasiekia Hiso pluoštą ir išplinta skilveliuose.
Spontaninį elektrinį aktyvumą sinusinio mazgo ląstelėse sukelia Na+ jonų srautas diastolės metu (4 fazė). Širdies veikimo potencialą (1.2.1.1 pav.) iš viso sudaro 5 fazės (0, 1, 2, 3, 4,). Pirmosios keturios fazės registruojamos sistolės metu. 0 fazė − atitinka greitą depoliarizaciją, kurios metu atsidaro Na+ kanalai ir generuoja greitą įeinančią Na+ jonų srovę (INa); 1 fazė − rodo greitą ankstyvą repoliarizaciją, kurios metu aktyvuojasi ankstyvosios repoliarizuo-jančios srovės: išeinančios trumpalaikės (angl. transient outward)K+ srovės (Ito1) ir Ca2+-aktyvuotos Cl– srovės (Ito2); 2 fazė – atitinka lėtą repoliarizaciją, dar vadinama plato faze, kuri priklauso nuo į ląstelę įeinančių Ca2+ (ICa) ir iš jos išeinančių K+ (IK) srovių balanso; 3 − baigiamąją greitą repoliarizaciją, kuri priklauso nuo skirtingų uždelsto-išlyginimo (angl. delayed-rectifier) K+ srovių (IKur, IKr, IKs); 4 fazė – vadinama transmembraniniu ramybės potencialu ir registruojama diastolės metu, kuri priklauso nuo bazinės vidinio-išlyginimo (angl. inward-rectifier) K+ srovės (IK1) ir kai kurių neselektyvių TRP srovių (20–22).
16
1.2.1.1 pav. Miokardo veikimo potencialas ir jo metu registruojamos
jonų srovės
Srovių, tekančių per ląstelės membranoje esančius jonų kanalus, kryptis pažymėta rodyk-lėmis, įeinančios: INa – greita Na+srovė, I
CaT – greita T-tipo Ca2+-srovė, ICaL – lėta L-tipo Ca2+ – srovė, INCX – Na+-Ca2+mainų sistemos srovė, INa K – Na+-K+mainų sistemos srovė ir išeinančios: Ito1 – trumpalaikė išorinio-išlyginimo K+ srovė, Ito2 – Ca2+-aktyvuota chloro srovė, IKur – labai greita uždelsto-išlyginimo K+ srovė, IKr – greita uždelsto-išlyginimo K+srovė, I
Ks – lėta uždelsto-išlyginimo K+ srovė, IK1 – vidinio-išlyginimo K+srovė, IKATF – ATF-reguliuojama vidinio-išlyginimo K+ srovė, IKACh – muskarininių receprorių-reguliuo-jama vidinio-išlyginimo K+ srovė, I
17
1.2.2. Jonų kanalai širdies ląstelėse
Katijoniniai kanalai paparastai skirstomi į grupes, atsižvelgiant į jų se-lektyvumą jonams arba pagal aktyvavimo ir reguliavimo savybes. Jonų kanalus sudarantys baltymai suformuoja ląstelės membranoje specifinę jonų pralaidumo porą, kuri selektyviai arba neselektyviai praleidžia tam tikrus jonus. Jeigu praleidžiami tik tam kanalui specifiniai jonai, kanalai laikomi selektyviais. Tačiau, jeigu kanalo pora pralaidi keliems skirtingiems jonams, šie kanalai vadinami neselektyviais. Specifinio pralaidumo pora gali atsi-daryti ir užsiatsi-daryti spontaniškai, kontroliuojama įtampos pakitimu arba ligandais. Įtampa-valdomi kanalai turi transmembraninį segmentą − įtampos sensorių, nuo kurio priklauso kanalo būsenos (atidarytas, uždarytas, inak-tyvuotas). Tačiau ligandų-valdomi kanalai šio sensoriaus neturi ir jų būsenos priklauso nuo pH pokyčių, viduląstelinės Ca2+, Mg2+, ATF koncentracijos ir/ar kitų (žr. apžvalgą (23)).
Įtampa-valdomi širdies Na+ kanalai labai greitai aktyvuojasi, kai membra-nos potencialas pasiekia –60 mV, sukeldami trumpalaikį Na+ jonų tekėjimą į ląstelę, ir labai greitai inaktyvuojasi. Nors inaktyvuoti Na+ kanalai veikimo potencialo (VP) plato fazės metu lieka neaktyvūs, kol vyksta repoliarizacija, tačiau šioje fazėje taip pat įvyksta ir vėlyvi Na+ kanalų atsidarymai, kurie formuoja taip vadinamą „lango srovę“ (angl. window current). Širdies Na+ (Nav1.5) kanalai, lyginant su neuronų kanalais, yra mažiau jautrūs terto-dotoksino blokavimui.
Įtampa-valdomi Ca2+ kanalai skirstomi į dvi pagrindines klases, t.y. sužadinamus, esant žemam ir aukštam membraniniam potencialui. Aukšto potencialo sužadinamų kanalų klasei priskiriami L-tipo Ca2+ kanalai (
α
1C ), kurie aktyvuojasi prie –30 mV ir kuriems būdingas didelis laidumas bei lėtas nuo įtampos ir laiko priklausomas inaktyvavimasis. Ši srovė taip pat prisideda prie „lango srovės“ formavimo VP plato fazės metu. T-tipo Ca2+ kanalai (α
1G) priskiriami prie žemo potencialo sužadinimų kanalų klasės, kurie atsidarę prie–60 mV greitai inaktyvuojasi, esant nedidelei membranos depoliarizacijai.
Tačiau šių kanalų ekspresija širdies ląstelėse yra labai variabili.
Įtampa-valdomiems K+ kanalams priskiriami labai greito aktyvavimo ir inaktyvavimo trumpalaikiai Kv1.4 ir Kv4.1-Kv4.3 kanalai, pernešantys Ito1 srovę, kurie labai trumpam aktyvuojasi/inaktyvuojasi prie –20 mV ir daly-vauja formuojant VP ankstyvąją repoliarizacijos fazę. Taip pat, trys uždelsto išlyginimo Kv1.5 (HK2), HERG (Kv11.1) ir KvLQT1 (Kv7.1) kanalai, kurie dalyvauja formuojant VP vėlyvąją repoliarizacijos fazę. Per šiuos kanalus pernešanamos išeinančios K+ srovės: IKur (labai greitai aktyvuojasi prie –
18
40 mV ir nesiinaktyvuoja), IKr (greitai aktyvuojasi bet dar greičiau inak-tyvuojasi prie –40 mV, todėl srovės tankis nėra didelis) ir IKs (lėtai akty-vuojasi prie –20 mV ir nesiinaktyvuoja). Bazinės srovės (IK1) K+ jonų kanalai
Kir2.1 (IRK1), reguliuoja ir palaiko ląstelių ramybės potencialą trečios VP fazės metu. Šie K+jonų kanalai neturi įtampos sensoriaus. Nepaisant to, IK1 moduliavimas, susijęs su Mg2+ ir poliaminų judėjimu, kurie sukelia ne-tiesioginį jautrumą įtampai. IK1 srovės kanalai būna užsidarę depoliarizacijos metu ir atsidaro membranos potencialui tampant vis labiau neigiamu.
Prie ligandais-valdomų kanalų yra priskiriami K+ kanalai, kurie yra re-guliuojami G baltymu. Stimuliuojat acetilcholinu IK.ACh arba adenozinu IK.Ado aktyvuojamos srovės per muskarino (M2) (24) arba adenozino (A1) (25) receptorius. Fiziologininėmis sąlygomis, Kir6.2 (BIR) kanalai yra uždaryti, o patologijų metu aktyvinasi IK.ATF srovė, kuri yra jautri adenozintrifosfatui (ATF), taip pat gali aktyvintis IK.Na, IK.Ca ar nuotėkio IKp srovės, atitinkamai per Slo2.1, SK1-SK3 ir K2P kanalus.
Širdies VP generuojamas dėl subtilaus joninių srovių balanso. Kai šią pusiausvyrą sutrikdo jonų kanalų disfunkcija, gali prasidėti širdies aritmijos. Širdies kanalų patologijos gali sukelti maždaug pusę staigios mirties sindromo, esant ritmo sutrikimams, atvejų ir bent vieną iš penkių staigios kūdikių mirties sindromo atvejų. Šiuo metu, yra nustatyta daugybė kana-lopatijų, paveldimų ligų, kurias sukelia genų, koduojančių įvairių kanalų baltymus, mutacijos (1.2.2.1 lentelė (26)).
1.2.2.1 lentelė. Širdies kanalų kanalopatijos (modifikuota pagal (26))
Patologija Kanalo baltymas Genas
1 2 3
Prieširdžių sustojimas Nav1.5: natrio kanalas, įtampa-valdomas, V tipas,
α-subvienetas SCN5A Brugada sindromas 1 tipas Nav1.5: natrio kanalas, įtampa-valdomas, V tipas,
α-subvienetas SCN5A Brugada sindromas 3 tipas
(trumpas QT sindromas 4 tipas)
Cav1.2: kalcio kanalas, įtampa-valdomas, L-tipas,
α1C subvienetas CACNA1C
Brugada sindromas 4 tipas
(trumpas QT sindromas tipas 5) Caβ2-subvienetas vβ2: kalcio kanalas, įtampa-valdomas, CACNB2 Brugada sindromas 5 tipas Navβ1: natrio kanalas, įtampa-valdomas, I tipas,
β-subvienetas SCN1B Brugada sindromas 6 tipas Kalio kanalas, įtampa-valdomas, Isk pošeimis,
3 narys KCNE3
Brugada sindromas 7 tipas Navβ3: natrio kanalas, įtampa-valdomas, III tipas,
β-subvienetas SCN3B
Brugada sindromas 8 tipas Hiperpoliarizacijos-aktyvuotas cikliniais
19
1.2.2.1 lentelės tęsinys
1 2 3
Katecholaminerginė polimor-finė skilvelinė tachikardija 1 tipas
RyR2: rianodino receptorius 2 RYR2
Dilatacinė kardiomiopatija 1E tipas
Nav1.5: natrio kanalas, įtampa-valdomas, V tipo,
α-subvienetas SCN5A Dilatacinė kardiomiopatija 1O
tipas
ATF-susietas, C pošeimis, 9 narys, sulfonilurea
receptorius 2 ABCC9 Aritmogeninė dešiniojo
skilve-lio displazija 2 tipas RyR2: rianodino receptorius 2 RYR2 Prieširdžių virpėjimas 3 tipas Kv7.1: kalio kanalas, įtampa-valdomas, KQT
pošeimis, 1 narys KCNQ1 Prieširdžių virpėjimas 4 tipas Kalio kanalas, įtampa-valdomas, Isk pošeimis, 2 narys KCNE2
Prieširdžių virpėjimas 7 tipas Kv1.5: kalio kanalas, įtampa-valdomas, 5 narys KCNA5
Prieširdžių virpėjimas 9 tipas Kir2.1: kalio kanalas, vidinio-išlyginimo, J pošeimis, 2 narys KCNJ2
Prieširdžių virpėjimas 10 tipas Nav1.5: natrio kanalas, įtampa-valdomas, V tipas,
α-subvienetas SCN5A Prieširdžių virpėjimas 12 tipas ATF-susietas, C pošeimis, 9 narys ABCC9
Jervell ir Lange-Nielseno sindromas 1 tipas
Kv7.1: kalio kanalas, įtampa-valdomas, KQT
pošeimis, 1 narys KCNQ1 Jervell ir Lange-Nielseno
sindromas 2 tipas
Kalio kanalas, įtampa-valdomas, Isk pošeimis,
1 narys KCNE1
Ilgo QT sindromas 1 tipas Kv7.1: kalio kanalas, įtampa-valdomas, KQT-tipo
pošeimis, 1 narys KCNQ1 Ilgo QT sindromas 2 tipas Kv11.1: kalio kanalas, įtampa-valdomas, H
pošeimis, 2 narys KCNH2 Ilgo QT sindromas 3 tipas Naα-subvienetas v1.5: natrio kanalas, įtampa-valdomas, V tipas, SCN5A
Ilgo QT sindromas 5 tipas Kalio kanalas, įtampa-valdomi, Isk pošeimis, 1 narys KCNE1
Ilgo QT sindromas 6 tipas Kalio kanalas, įtampa-valdomi, Isk pošeimis, 2 narys KCNE2
Ilgo QT sindromas 7 tipas (Andersen-Tawil sindromas)
Kir2.1: kalio kanalas, vidinio-išlyginimo,
J pošeimis, 2 narys KCNJ2 Ilgo QT sindromas 8 tipas
(Timothy sindromas) Caα1Cv-subvienetas 1.2: kalcio kanalas, įtampa-valdomas, L-tipo, CACNA1C
20
1.2.2.1 lentelės tęsinys
1 2 3
Ilgo QT sindromas 13 tipas Kir3.4: kalio kanalas, vidinio-išlyginimo, J pošeimis, 5 narys KCNJ5
Makrotrombocitopenija Receptoriaus trumpalaikio atsako į potencialą
kanalas, M pošeimis, 7 narys TRPM7 Neprogresuojanti širdies
blokada
Nav1.5: natrio kanalas, įtampa-valdomas, V tipas,
α-subvienetas SCN5A Paroksizminis skilvelių
virpė-jimas, 1 tipas
Nav1.5: natrio kanalas, įtampa-valdomas, V tipas,
α-subvienetas SCN5A Progresuojanti širdies blokada
(Lenegre-Lev sindromas) IA
Nav1.5: natrio kanalas, įtampa-valdomas, V tipas,
α-subvienetas SCN5A Progresuojanti širdies blokada
IB Receptoriaus trumpalaikio atsako į potencialą kanalas, M pošeimis, 4 narys TRPM4 Trumpo QT sindromas 1 tipas Kv11.1: kalio kanalas, įtampa-valdomas, H pošeimis,
2 narys KCNH2
Trumpo QT sindromas 2 tipas Kv7.1: kalio kanalas, įtampa-valdomas, KQT-tipo
pošeimis, 1 narys KCNQ1 Trumpo QT sindromas 3tipas Kir2.1: kalio kanalas, vidinio išlyginimo, J pošeimis, KCNJ2
Trumpo QT sindromas 4tipas
(Brugada sindromas 3 tipas) Caα1Cv subvienetas 1.2: kalcio kanalas, įtampa-valdomas, L-tipo, CACNA1C
Trumpo QT sindromas 5tipas
(Brugada sindromas 4 tipas Caβ2-subvienetas vβ2: kalcio kanalas, įtampa-valdomas, CACNB2 Trumpo QT sindromas 6 tipas Cavα2δ1: kalcio kanalas, įtampa-valdomas, α2/δ1
subvienetas CACNA2D1 Sinusinio mazgo sindromas 1
tipas autosominis-recesyvinis
Nav1.5: natrio kanalas, įtampa-valdomas, V tipas,
α-subvienetas SCN5A Sinusinio mazgo sindromas 2
tipas autosominis-recesyvinis
Hiperpoliarizacijos-aktyvuotas ciklinis
nukleotidais-valdomas kalio kanalas, 4 narys HCN4
1.3. TRP kanalai 1.3.1. TRP kanalų atsiradimo istorija
TRP (receptorių trumpalaikio atsako į potencialą; angl. Transient Receptor
Potential) joniniai kanalai, pirmą kartą identifikuoti įvykus spontaninei genų
mutacijai į ištisinės šviesos sukeliamą signalą drozofilos (Drosophila) mu-selėje (27, 28). Muselė galėjo matyti šviesą tik trumpą laiko tarpą (29). Šis šviesos signalo perdavimo sutrikimas siejamas su fosfatidilinositol (PIP2)
21
kaskada ir fosfolipazės-C (PLC) receptorių aktyvavimusi, kurie sukėlė nepertraukiamą membranos depoliarizaciją, esant padidėjusiam įeinančių Ca2+ jonų srautui į ląstelę. Dėl įvykusios mutacijos, drozofilos muselės ma-tomas Ca2+ jonų elektrinio signalo spontaninis atsakas pavadintas recepto-riaus trumpalaikiu atsaku į potencialą (30). 1989 m. klonavus TRP geną ir nustačius tikslią šių kanalų baltymo struktūrą (29), leido transfekuoti kanalus į įvairių tipų ląsteles ir plėtoti įvairius eksperimentinius tyrimus (31).
1.3.2. TRP kanalų šeima
TRP kanalai priskiriami neselektyvių joninių kanalų grupei, kurie daž-niausiai lokalizuoti įvairių tipų ląstelių (tiek žmogaus, tiek gyvūnų) plaz-minėje membranoje. Šiuo metu identifikuoti ~28 TRP kanalai, kurie tarpusavyje pasižymi tam tikru struktūriniu panašumu. Struktūriškai TRP kanalai skirstomi į homo- arba heterotetramerus, kurių centre lokalizuota pora. Kiekvienas subvienetas, kaip parodyta 1.3.2.1 pav. B dalyje, susideda iš viduląstelinio N- (NH2) ir C- (COOH) galo, šešių transmembraninių spi-ralių (segmentų; TM1-TM6), sujungtų trumpomis kilpomis, porą formuo-jančios kilpos (P), esančios tarp TM5 ir TM6 spiralės ir įtampos sensoriaus (TM4) (22, 32, 33).
Pagal sekos homologiją, topologiją ir funkcijas, žmogaus TRP kanalai skirstomi į šešis pošeimius (1.3.2.1 pav. A): TRPC („C“ – canonical), TRPV („V“ − vanilloid), TRPM („M“ − melastatin), TRPA („A“ − ankyrin), TRPP („P“ − polycystin) ir TRPML („ML“ − mukolipin), bei papildomi t.y. TRPN (nėra mechanoreceptorinio potencialo) ir TRPY (angl. yeast; mielės vakuolėse), kurie nustatyti vaisinėse muselėse ir mielėse, atitinkamai (34).
22
1.3.2.1 pav. Schematinis vaizdas žmogaus TRP šeimos kanalų ir
srovių per TRP kanalus
A rodo žmogaus TRP kanalų šeimos filogenetinį pasiskirstymą. Struktūriškai nustatyti kanalai pažymėti . B rodo TRP kanalų topologiją, apačioje – TRP kanalų skirtingų pošeimių viduląstelinė N- ir C-galo struktūra. C rodo srovių per skirtingus TRP kanalus srovės-įtampos priklausomybės kreives; žymėjimo atitikmuo apačioje. D rodo bendrą TRP kanalų šeimos kristalografinę struktūrą (kairėje – vaizdas iš šono; dešinėje – vaizdas iš viršaus). Modifikuota pagal (22).
1.3.3. TRP kanalų savybės
Temperatūros (1.3.3.1 pav.), pH, cheminių medžiagų koncentracijų ar membranos potencialo pokyčiai keičia TRP kanalų aktyvumą ir tuo pačiu išryškina pagrindines fiziologines funkcijas: skonio (saldumo, kartumo, sū-rumo, rūgštumo) receptorių reguliavimas, temperatūros receptorių regulia-vimas, sensorinė signalizacija, osmosinio slėgio reguliaregulia-vimas, reakcija į skausmą, Alzhaimerio ligos mechanizmo reguliavimas, Zn2+, Mn2+ ir kitų metalų reguliavimas, hipokalcemijos ir hipomagnezijos reguliavimas ląste-lėse, Ca2+ ir Mg2+ homeostazės reguliavimas (35). TRP kanalų funkcijų su-trikimas reikšmingai prisideda prie daugelio patologinių būklių, įskaitant cukrinį diabetą, vėžinius susirgimus, ŠN, aritmogenezę, bipolinį sutrikimą, raumenų distrofiją bei vystymąsi ir kitus (22, 36).
23
1.3.3.1 pav. Schematinis vaizdavimas TRP kanalų jautrumo temperatūrai Modifikuota pagal (35)
TRPC („klasikiniai“ arba „kanoniniai“) kanalai yra panašiausi į pirmąjį drosofilos muselėje atrastą TRP kanalą (27, 28). Žmogaus organizme iden-tifikuoti 6 TRPC kanalai: TRPC1, TRPC3, TRPC4, TRPC5, TRPC6 ir TRPC7 (37) ir visi jie yra gausiai ekspresuoti žmogaus širdies ląstelėse (38, 39). Sinusiniame mazge ekspresuoti net penki TRPC kanalai, išskyrus TRPC5 (40). Padidėjusi TRPC1-6 ekspresija buvo nustatyta pacientams su ŠN, lyginant su tais, kuriems nebuvo ŠN patologijos (41, 42) ir šie duomenys dera su rezultatais, gautais pelių ŠN modeliuose (42). Kaip ir kitų tipų ląs-telėse, širdies miocituose TRPC kanalai dalyvauja signalo perdavimo proce-suose (38, 39, 43,), o jų aktyvavimas tiesioginis/netiesioginis įvyksta daly-vaujant fosfolipazei-C (PLC) (44, 45). Literatūros duomenimis, TRPC7 kanalų aktyvavimas inicijuoja angiotenzino-II aktyvavimą, kuris skatina mio-kardo apoptozę (46).
TRPV pošeimiui (vaniloido kapsicino receptorius) taip pat priskiriami 6 kanalai (TRPV1-6). TRPV1, dėl aiškaus farmakologinio reguliavimo ir aiš-kaus fenotipo, bene geriausiai ištirtas TRP pošeimis (47). Nustatyta, kad TRPV1 yra gausiai ekspresuotas sensoriniuose neuronuose (48), tačiau kai kurie TRPV aptikti ir žinduolių širdies audiniuose TRPV kanalai, kaip ir TRPC kanalai, taip pat vaidina svarbų vaidmenį širdies fibroblastams dife-rencijuojant į miofibroblastus. Nustatyta, kad TRPV1 kanalų eliminavimas padidina miokardo infarkto sukeltą fibrozę (49), TRPV2 kanalų pašalinimas sumažina fibrozės, sietinos su senėjimu, vystymąsi. Tuo tarpu TRPV2 kanalų
24
aktyvavimas sietinas su dilatacine kardiomiopatija, kai pakinta širdies geo-metrija, padidėja fibrozė ir susiformuoja struktūriniai defektai (50). TRPV yra pastoviai aktyvūs ir Ca2+ pralaidūs kanalai, tačiau jie yra termojautrūs ir įvairūs cheminiai ir fiziniai stimulai gali keisti šių kanalų aktyvumą.
TRPM pošeimis (8 nariai) yra įvairiapusiškiausias iš visų TRP kanalų. Pirmasis nustatytas šio pošeimio narys buvo TRPM1 („TRP melastatinas 1“), pavadintas, dėl savo svarbaus melanomos supresoriaus vaidmens (51). Šiame pošeimyje yra unikali fermentinių kanalų (angl. „chanzymes“) klasė, kurioje evoliuciškai fermentinis domenas sujungtas su TRP kanalu, šiems kanalams taip pat priskiriami TRPM6 ir TRPM7, kurių kiekvienas turi funkcinę bal-tymų kinazę (4). TRPM8 yra bene geriausiai ištirtas TRPM narys, nustatyta, kad jį gali aktyvuoti stiprus šaltis bei cheminiai junginiai (mentolis, eukaliptas ir kiti) (52), tačiau šių kanalų ekspresija širdyje dar neaptikta. Literatūros šaltinių duomenimi, geriausiai ištirti širdies TRPM4 kanalai (53) ir tik vos keliuose darbuose pademonstruota pakitusi TRPM6 ir TRPM7 ekspresija, susijusi su fibrozės vystymusi širdyje (54, 55). TRPM7 ekspresija gali padi-dėti paveikus žmogaus ar gyvūnų širdies fibroblastus hormonais (angioten-zinu-II) ar pro-fibrotiniais agonistais. Struktūrinis remodeliavimasis dėl ženk-lių fibrozės pokyčių gali sukelti prieširdžių virpėjimą (56). Pastaruoju metu, stebima pažanga tiriant TRPM4 ir TRPM7 kanalų vaidmenį širdies laidumo sutrikimuose. Pacientų su prieširdžių virpėjimu (PV) TRPM7 kanalų ekspre-sija yra ženkliai padidėjusi (13, 14). Detaliau apie TRPM šeimos kanalus pateikta žemiau (žr. 1.4 skyrių).
TRPA kanalų pavadinimas kilęs dėl 14 kartų pasikartojančio ankirino domeno prie N-galo. TRPA1 koduojantis genas identifikuotas labai plačiai, nuo vabzdžių iki žinduolių. Žmogaus organizme šio kanalo baltymas eks-presuotas daugiausiai sensoriniuose neuronuose ir yra aktyvuojamas labai plataus spektro aplinkinių dirgiklių, nuo elektrofilinių cheminių medžiagų iki mechaninių stimulų (37, 57). Todėl, nors ankirin-tipo kanalų pošeimiui pri-skiriamas tik vienas baltymas, bet jie yra vieni iš labiausiai tyrinėtų TRP šeimos kanalų dėl funkcijų, susijusių su temperatūriniais, mechaniniais, už-degiminiais skausmo, chemorecepcijos ir kitais reguliavimo procesais (57). Širdyje, ankirin-tipo kanalo mutacijos siejamos su fibroblastuose susiforma-vusiais piktybiniais (angl. malignant) dariniais (58). Vis dėlto, kaip ir kitų TRP šeimos kanalų, TRPA1 kanalų valdymo (angl. gating) mechanizmas nepakankamai išaiškintas (59).
TRPML pošeimį sudaro 3 nariai (TRPML1–3). Šis kanalas pavadintas
MCOLN1 geno vardu, koduojančio šio kanalo baltymą, kurio mutacijos
suke-lia neurodegeneracinę IV tipo mukolipidozę (60). TRPML − labiausiai nu-tolęs TRP kanalų pošeimis. TRPML daugiausia lokalizuojasi endo- ir
25
egzocitozės ląstelių membranose (61). Žinoma, kad šių kanalų aktyvumą reguliuoja fosfoinozitidai (62).
TRPP (arba policistinai) kanalo baltymą koduojančio geno mutacijos sukelia autosominę dominuojančią policistinę inkstų ligą (63). Nors TRPP yra vieni iš plačiausiai paplitusių TRP kanalų, tačiau mažai panašūs į likusią TRP šeimos kanalų dalį (64).
1.3.4. TRP kanalų pasiskirstymas
TRP kanalai yra viena didžiausių joninių kanalų šeimų, kuri plačiai paplitusi įvairiuose žmogaus organuose. TRP kanalai lyg ląstelių sensoriai reaguoja į įvairius fizinius ar cheminius dirgiklius bei pasižymi didele funkcijų įvairove (1.3.4.1 pav.). Dauguma šių kanalų, naudojant įvairius molekulinius ir genetinius metodus, detektuoti ir įvairių rūšių gyvūnų bei žmogaus širdies ląstelėse/organuose (1.3.4.1 lentelė).
1.3.4.1 pav. Schematinis vaizdavimas TRP baltymų ekspresijos
žmogaus organuose
Kvadratėlių spalvos atitinka organų sistemas (kairėje pusėje). RNR identifikacija (langelis su baltu rėmeliu), baltymų identifikacija (langelis juodu rėmeliu). Modifikuota pagal (37).
26
1.3.4.1 lentelė. TRP šeimos kanalai identifikuoti žmogaus ir gyvūnų širdyje
(modifikuota pagal (39)
TRP
pošeimis TRP Metodas/audinys Ekspresija Lietera-tūra
1 2 3 4 TRPC žmTRPC1 NB/širdis (65) žTRPC1 IsH/embriono širdis (65) žmTRPC1 NB/širdis (66) jTRPC4 NB/širdis (67) žTRPC1,3–6 RT-PCR/širdis (68) pTRPC1 NB/širdis (69) jTRPC4 NB/skilvelis, prieširdis (70) tTRPC4 NB/širdis (70) pTRPC1-4,6 RT-PCR/širdis (71) pTRPC7 NB/širdis (72) žmTRPC1,3–6 RT-PCR/širdis (73) p-žTRPC3 WB/KS (41) žmTRPC5 WB/KS (41) pTRPC1-3,6,7 RT-PCR/širdis (74) pTRPC1,3,4,6 RT-PCR/širdis (75) žmTRPC6 RT-PCR/širdis (75) pTRPC3 WB/širdis (76) pTRPC1-3,6 RT-PCR, WB, IHC/širdis (77) žTRPC7 NB/širdis (46) pTRPC1-4,6,7 RT-PCR/sinusinis mazgas (40) pTRPC3 RT-PCR, WB/KS, sinusinis mazgas, atrioventrikulinis mazgas (40) pTRPC1,3,4,6 WB/prieširdis (40) žTRPC1,3,5,6 RT-PCR, WB/širdis (78) pTRPC1,3 WB/širdis (79) žTRPC1 RT-PCR, IHC/DS, KS, KP, DP (80) žTRPC4,5 WB/širdis (81)
pTRPC5 IHC, WB, MS/embriono širdis (82)
pTRPC1*,3,6 WB/širdis (83)
pTRPC3,4,6 WB/širdis (84)
pTRPC1,3,5–7 WB/širdis (85)
žTRPC1,3,6 RT-PCR/prieširdis, sinusinis mazgas (86) žTRPC1,3–6 WB/vaisiaus, naujagimio ir suaugusiojo širdis (87)
žTRPC1 IHC/prieširdis (88)
pTRPC1–7 RT-PCR/skilveliai (89)
27 1.3.4.1 lentelės tęsinys 1 2 3 4 TRPM pTRPM7 NB/širdis (4) žmTRPM4b RT-PCR/prieširdis (91) žmTRPM1–7 RT-PCR/ širdis (92) žTRPM4 RT-PCR/KS ir prieširdis (93) pTRPM1–8 RT-PCR/širdis (74) pTRPM4 RT-PCR, WB/sinusinis mazgas (94)
žmTRPM4 RT-PCR/Purkinje skaidulos, sinusinis mazgas DP, KS, DS (95) pTRPM4* WB/skilvelis, prieširdis (96) žmTRPM4,7 RT-PCR, WB/DP (13) pTRPM2 RT-PCR/širdis (97) žmTRPM3 RT-PCR/tarpskilvelinė pertvara (98) pTRPM2 RT-PCR/širdis (99) žTRPM7 RT-PCR/širdis (100) žTRPM4 RT-PCR/širdis (101) žTRPM2,4,6,7 RT-PCR/širdis (17)
pTRPM6,7 RT-PCR, IsH/kūdikio, suaugusio širdis (102)
pTRPM4 RT-PCR/KS (103)
pTRPM4* WB/KS-suaugusio, kūdikio širdis (104)
žmTRPM7 MA, WB, IHC/KS (105) žmTRPM6 RT-PCR, WB/DP (55) pTRPM7 WB/širdis (106) žTRPV2 WB/širdis (107) TRPV pTRPV2-4,6 RT-PCR/širdis (74) žTRPV4 IHC/širdis (108)
žmTRPV1 IHC/prieširdis (nervinės skaidulos) (109)
aTRPV5–6 RT-PCR, WB, IHC/širdis (110) žTRPV1 WB/širdis (111) pTRPV1 WB/širdis (112) pTRPV2 WB/širdis (113) žm, žrTRPV2 WB, IHC/širdis, skilvelis (50) pTRPV2 MA/KS (114) žTRPV2 MA, RT-PCR, WB, IHC/KS (114) pTRPV2* WB/širdis (115) žTRPV4 IHC/prieširdis (88) pTRPV1* WB/širdis (116) pTRPV1 WB/KS (117)
28
1.3.4.1 lentelės tęsinys
1 2 3 4
TRPML žmTRPML1 NB/ širdis (118)
pTRPML1 NB/vaisiaus ir suaugusio širdis (119)
pTRPML3 RT-PCR/širdis (120)
pTRPML2,3 RT-PCR/širdis (69)
pTRPML1 RT-PCR/širdis (121)
žmTRPML1,3 RT-PCR/širdis (121)
TRPP žmTRPP3 NB, vaisiaus ir suaugusio širdis (122)
žmTRPP3 NB/širdis (84)
pTRPP2 WB/širdis (123)
žmTRPP2 NB, IsH/embriono ir suaugusio širdis (124)
žmTRPP5 RT-PCR/vaisiaus širdis (125) pTRPP5 NB/širdis (125) pTRPP3 IHC/širdis (126) žmTRPP2 WB/širdis (127) žmTRPP3 WB/širdis (127) žTRPP2,3,5 RT-PCR/širdis (128) žTRPP2 WB/širdis (129) žmTRPP3 WB/širdis (130) p, dTRPP2 WB/širdis (131) pTRPP2a WB/KS (132)
TRPA pTRPA1 RT-PCR/širdis (74)
pTRPA1 RT-PCR/širdis (133)
pTRPA1 IsH/širdis (134)
Santrumpos: j – jautis; žm – žmogus; žr – žiurkėnas; a – arklys; t – triušis; p – pelė; ž – žiurkė;
IHC – imunohistochemija; IsH – in situ hibridizacija;
MA – mikrogardelės; MS – masės spektrometrija; NB – Northern blot;
RT-PCR – atvirkštinės transkripcijos polimerazės grandininė reakcija; WB – Western blot; KP – kairysis prieširdis, KS – kairysis skilvelis, DP – dešinysis prieširdis; DS – dešinysis skilvelis.
Įdomu tai, kad neseniai atliktas tyrimas parodė pakitusią skirtingų TRP kanalų raišką leukocituose pacientų, kuriems buvo ne vožtuvinės kilmės PV (135). Jie detektavo padidėjusią genų ekspresiją TRPC1-C7, TRPV1-V6, TRPM1-M8, TRPML1-ML3, TRPA1 ir TRPP2 kanalams.
29
1.4. TRPM kanalų pošeimis
Receptorių trumpalaikio atsako į potencialą, melastatino šeimos (TRPM) kanalų pošeimis yra viena didžiausių ir įvairiapusiškiausių TRP šeimai priskiriamų kanalų (136). 1998 metais identifikuotas ir klonuotas pirmasis šio pošeimio narys – TRPM1 (51, 136). Žinoma, kad TRPM susideda iš aštuonių narių (TRPM1-8). Pagal sekos homologiją (1.4.1 pav. B), šis pošeimis gali būti dar skirstomas į 6 grupes: TRPM1-TRPM3, TRPM2-TRPM8, TRPM4-TRPM5 ir TRPM6-TRPM7 (137, 138).
1.4.1 pav. TRPM pošeimio kanalo struktūra ir šeimos medis A rodo TRPM kanalo monomerą. CTD (žalias) žymi vietą, kuri skiriasi tarp TRPM pošeimio narių. B rodo TRPM pošeimio narių giminingumą. Modifikuota pagal (136).
Visų TRPM pošeimio narių NH2-galo dalyje yra keturi TRPM pošeimiui būdingi homologiniai domenai (MHR), kurie turi giminingas amino rūgštis. COOH-galo dalyje yra: TRP domenas (angl. TRP box), spiralinis domenas (angl. coiled-coil) ir individualus, tik kiekvienam TRPM pošeimio nariui
30
būdingas, domenas. TRPM2, TRPM6 ir TRPM7 kanalai COOH-galo dalyje turi specifinį fermentinį (angl. chanzymes) domeną, t. y. TRPM2 – „Nudix“ hidrolazės homologinį domeną (NUDT9), kuris hidrolizuoja adenozino difos-fato ribozę (139), o TRPM6 ir TRPM7 – netipišką alfa baltymų kinazės do-meną (140).
Srovių, tekančių per skirtingus TRPM pošeimio kanalus, biofizikinės charakteristikos taip pat skiriasi (1.4.2 pav.). Akivaizdi išeinančių srovių rektifikacija matoma TRPM4, TRPM5 ir TRPM8 kanalų yra sukeliama dėl padidėjusio kanalų atsidarymo neigiamų potencialų srityje, o TRPM6 ir TRPM7 kanalų išeinančių srovių rektifikacija yra sukeliama dėl dvivalenčių katijonų blokavimo prie neigiamų (fiziologiškai reikšmingų) membraninių potencialų (141).
1.4.2 pav. Srovių per skirtingus TRPM pošeimio kanalus srovės-įtampos
priklausomybės kreivės
Modifikuota pagal (84).
Dauguma TRPM kanalų pasižymi pralaidumu Ca2+, Mg2+ jonams (142). Ca2+ ir Mg2+ koncentracijų pokyčiai ląstelėje gali stipriai paveikti ląstelės biologinius procesus, pvz.: jautrumą oksidaciniam stresui, endotelio pralai-dumo reguliavimą, ląstelės mirtį, homeostazę, miogeninį atsaką, kraujagyslių tonuso reguliavimą ir kitus. TRPM kanalai yra potencialūs taikiniai gydant daugelį ligų, įskaitant uždegiminės kilmės skausmą (TRPM8), neurodege-neraciją (TRPM2), širdies ir kraujagyslių ligas (TRPM4) ir diabetą (TRPM2 ir TRPM5). Norint geriau suprasti šių svarbių kanalų funkcionavimą/savy-bes/remodeliavimąsi reikia nustatyti daugybę ligandų rišimosi vietų.
Pagrindiniai TRPM kanalų šeimos biofizikinių savybių parametrai: eks-presija, reguliavimas, selektyvumas jonams ir funkcijos miokardo bei kitų audinių ląstelėse yra pateikti 1.4.1 lentelėje.
1.4.1 lenelė. TRPM kanalų biofizikiniai parametrai (modifikuota pagal (30))
Kanalas Ekspresija Funkcijos Ligos Selektyvu-mas Laidumas (γ) Ligandai
1 2 3 4 5 6 7 TRPM1 Tinklainės bipolinės ląstelės; odos melanocitai. Bipolinių ląstelių depoliarizavimas; melanomos metastazių slopinimas Įgimtas vištakumas.
NS – Aktyvuoja: La2+, pregnenolono sulfatas; Blokuoja: Zn2+. TRPM2 Centrinė ner-vų sistema; imuninės ląstelės; kasos β ląstelės. Temperatūros pojūtis; oksidacinis pojūtis; insulino sekrecija; imuninis atsakas. Bipolinis sutrikimas; išemijos-reperfuzijos pažeidimai; Alzheimerio liga. Ca2+ ir Na+, prie +37 °C, NS prie +20 °C.
60–80 pS Aktyvuoja: ADPR, cADPR, 2′-deoksi-ADPR, 2′-P-2′-deoksi-ADPR, 3′-P-2′-deoksi-ADPR, 2-F-ADPR, AMPCPR, Ca2+; Blokuoja: ekonazolas, klotrimazolas, flufenamo rūgštis,
N-(p-amilcinnamoilas)
antraranilo rūgštis, 2-APB, skaliarinis, 3-MFA, 8-Br-cADPR, 8-Br-ADPR, 8-Ph-ADPR, 8-Ph-2′-deoksi-ADPR, 8-(3-acetilfenil)-ADPR, 8-tiofenil-ADPR ir kt.; Kita: PIP2. TRPM3 Pirminiai nocicepciniai neuronai; kasos beta ląstelės; inkstai. Gliukozės homeostazė; šilumos pojūtis ir uždegiminis skausmas Epilepsija; tinklainės distrofija NS: Na+, K+, Ca2+ ~73–133 pS Aktyvuoja:pregnenolono sulfatas, CIM0216; Blokuoja: primidonas Kita: DVT.
1.4.1 lenelės tęsinys 1 2 3 4 5 6 7 TRPM4 Širdis; kepenys. Kalcio reguliavimas po T ląstelių aktyvavimo; širdies laidumo sutri-kimų prevencija; sklandaus raumenų susitraukimo regulia-vimas. Brugada sindromas; širdies laidumo defektas. VV: Na+, K+, Cs+ 25 pS Aktyvuoja: Ca2+;
Blokuoja: ATF, ADF, AMF, 9-fenantrolis
TRPM5 Kasos beta ląstelės; chemosensori nės žarnyno epitelinės ląstelės
Insulino sekrecijos mo-duliavimas ir sensorinė transdukcija skonio ląstelėse. „Beckwith-Wiedemann“ sindromas VV: Na+, K+, Cs+
23–25 pS Aktyvuoja: Ca2+, PIP2, steviolio glikozidai, rutamatinas; Blokuoja: TPPO. TRPM6 Inkstai; žarnynas; širdis. Magnio pasisavinimas ir homeostazė inkstuose ir žarnyne. Hipomagnezemij a su antrine hipokalcemija DV: Ca2+, Mg2+, Zn2+ ir kt.) ~84 pS Aktyvuoja: Mg2+; Blokuoja: [Mg2+] i, rutenio raudonasis. TRPM7 Visose
ląstelėse. Magnio ir kalcio homeostazė; ląstelių gyvybingumas. Neuronų degeneracinės ligos, aritmogenezė DV: Ca2+, Mg2+, Zn2+ ir kt.
40–105 pS Aktyvuoja: Mg2+-ATF, PIP2 skilimas, cAMP koncentracijos padidėjimas; Blokuoja : La3+,Gd3+,[Mg2+]
i, sperminas, CAR, 2-APB, MnTBAP.
TRPM8 Sensoriniai neuronai; prostata. Šalčio jutimas; skausmas. Uždegiminis neuropatinis skausmas; prostatos vėžys. NS: Na+, K+, Cs+, Ca2+ 60 pS prie +10 °C 75 pS prie +30 °C
Aktyvuoja: šaltis (max 10 °C), mentolis, icilinas, WS-12, CPS-369;
Blokuoja: kapsazepinas, PF-05105679, AMG-333, GWP-42006.
Santrumpos: NS – neselektyvūs; VV – vienvalenčiai; DV – dvivalenčiai; MnTBAP chloridas – ląstelėms pralaidi superoksido dismutazė (SOD); 8-Br-cADPR – 8-bromciklinė adenozino difosfato ribozė, natrio druska; ir 8-Br-ADPR – 8-bromadenozino difosforibozė; AMPCPR – alfa-beta metileno ADP-ribozė; 3-MFA – mefenamo rūgšties analogas; CIM-0216 – chinolinacetamido darinys; DVT – dekavanadatas; TPPO – trifenilfosforo oksidas; WS-12, CPS-369 – karboksamidai; PF-05105679, AMG-333 – chinolono ir piridino karboksamido dariniai; GWP-42006 – kanabinoidas kanabidivarinas; Kitus trumpinius žr. skyriuje – Santrumpos.
33
1.5. TRPM7 kanalai 1.5.1. TRPM7 kanalų atradimo istorija
Receptorių trumpalaikio atsako į potencialą, melastatino-7 šeimos, kanalai pirmą kartą buvo paminėti 2001 metais, kai beveik vienu metu trys nepri-klausomos tyrėjų grupės (Clapham, Penner ir Ryazanov) klonavo šio kanalo baltymą, tačiau jam buvo suteikti skirtingi pavadinimai: PLIK, LTRPC7 ir ChaK1 (2, 4, 143). Nustačius, kad šie kanalai blokuojami Mg∙ATF, pasiūlyta kanalus vadinti MagNuM – magnio-nukleotidais reguliuojamu metalo jonų kanalu (angl. magnesium nucleotide regulated metal ion channel; (2)). Vėliau nustatyta, kad laisvas (nesurištas su ATF) viduląstelinis Mg2+ taip pat gali efektyviai juos blokuoti, todėl pasiūlyta juos pervadinti į MIC – magniu blo-kuojami kanalai (angl. magnesium inhibited channels; (144)). Šiuo metu yra žinoma, kad šie kanalai blokuojami tiek su viduląsteliniu laisvu-Mg2+, tiek ir esančio komplekse su ATF. Pastaruoju metu, literatūros šaltiniuose šie kanalai yra įvardijami, kaip TRPM7, t. y. pagal šio kanalo geno pavadinimą, arba minint visus pavadinimus kartu TRPM7/MagNuM/MIC.
1.5.2. TRPM7 kanalų struktūra
TRPM7 kanalas, kaip ir kiti TRP šeimos kanalai, sudarytas iš 4 pasikar-tojančių homologinių baltymų monomerų, kurių kiekvienas turi 6 trans-membraninius (TM) domenus (S1-S6), orientuotus skersai ląstelės memb-ranos. Domenai susieti skirtingo ilgio citoplazminėmis ir necitoplazminėmis kilpomis. Kanalo porą formuojanti viduląstelinė kilpa lokalizuota tarp penkto (S5) ir šešto (S6) segmentų (1.5.2.1 pav.). TRPM7 kanalo pora, pralaidi Mg2+, Ca2+ir Zn2+bei kitiems divalenčiams katijonams, valdoma įtampos pakitimu, o ketvirtas transmembraninis segmentas (S4) yra įtampos jutiklis, t. y. įkrau-tas teigiamu krūviu, nuo kurio priklauso kanalo būsenos. Prie pirmo segmento (S1) esantis NH2-galas turi vieną hidrofobinę sritį (H1) ir keturias TRPM pošeimio homologinių domenų dalis (MHR). COOH-galas turi TRP domeną (angl. box), kuris sudarytas iš 25 konservatyvių amino rūgščių liekanų, sąveikaujančių su PIP2, spiralinės ritės domeną ir unikalų α-kinazės domeną, kuris labai svarbus kanalo aktyvumui, kitaip dar vadinamas „kanalas-fer-mentas“ (angl. chanzymes). Spiralinis domenas (angl. coiled-coil) esantis šalia karboksilinio galo, galimai tarpininkauja keturių homologinių domenų kanalo tetramerinės struktūros susiformavimui. Spiralinio domeno (CC) sritis yra bendra visai TRP kanalų šeimai.
34
1.5.2.1 pav. TRPM7 kanalo ir kinazės schema
TRPM7 kanalo skirtingas dalis sudaro nevienodo ilgio amino rūgščių (a. r.) sekos: 6TM segmentas (756–1095 a.r.), kanalo pora tarp S5-S6 segmentų (1039–1056 a. r.), TRP sritis (1109–1128 a. r.), CC sritis (1198–1250 a. r.), Thr (serino ir treonino) sritis (1380–1596 a. r.) ir α–kinazės domeno sritis (1597–1821 a. r.). Modifikuota pagal (145).
1.5.3. TRPM7 kanalo savybės
Tarp daugiau nei 300 žinduolių joninių kanalų tik TRPM7 ir TRPM6 turi C-gale kinazinę dalį, kuri priklauso specifiniam netipinių baltymų kinazių pošeimiui, žinomam kaip α-kinazės, kurios pasižymi mažu aminorūgščių se-kos panašumu įprastoms baltymų kinazėms (44, 146, 147). Nepaisant in-tensyvių tyrimų, vis dar nesutariama dėl funkcinės svarbos tarp α-kinazės ir TRPM7 kanalo domeno. Tyrimais parodyta, kad mutacijos sutrikdžiusios kinazės aktyvumą, neturėjo jokios įtakos TRPM7 kanalo aktyvumui ir jaut-rumui blokuojant dvivalenčiais katijonais (148). Tačiau daugelis tyrimų patvirtina ryšį tarp TRPM7 kanalo ir jo C-galo kinazės. Nustatyta, kad ki-nazės domeno aktyvumas bei kanalo domeno funkcijos kinta, esant vidu-ląstelinio Mg2+ pokyčiams HEK293 ląstelėse (18).
TRPM7 kanalų reikšmė ląstelių Mg2+ homeostazei buvo tiriama įvairių tipų ląstelėse (leukocituose, trombocituose, kraujagyslių lygiųjų raumenų ląstelėse, širdies fibroblastuose, osteoblastuose, navikinėse ląstelėse ir kt.) tiek fiziologinėmis, tiek patofiziologinėmis sąlygomis (18, 45). Reguliuo-damas Mg2+ transportą per ląstelių membranas, TRPM7 kartu su kitais Ca2+ kanalais, taip pat reguliuoja Ca2+jonų srautą įvairių tipų ląstelėse (149, 150).
35
TRPM7 kanalų dalyvavimas siejamas su daugeliu signalinių kelių. Manoma, kad TRPM7 kanalai atlieka svarbų vaidmenį augimo faktoriaus signaliniame kelyje per tirozino kinazių receptorius (RTK). TRPM7 COOH-gale esantis α-kinazės domenas sužadina aneksino A1, kalpaino II, miozino II, PLCγ2, Src ir SMAD2 (dalyvaujančių RTK signaliniame kelyje) fosforilinimą (151) ir reguliuoja epigenetines modifikacijas (152). TRPM7 kinazės domenas taip pat gali turėti įtakos TRPM7 kanalo funkcijai, tačiau tikslūs mechanizmai dar nėra išaiškinti (19, 106, 153, 149).
1.5.4. Receptorinės tirozino kinazės savybės ir reguliacija
Receptorinė tirozino kinazė (RTK) − ląstelės membranos receptoriai, ku-riuose hormono arba augimo faktoriaus prijungimą bei efektorines funkcijas atlieka tas pats baltymas. Visos receptorinės tirozino kinazės turi panašią mo-lekulinę sudėtį, sudarytą iš trijų pagrindinių domenų: glikozilinto ekstra-ląstelinio hormoną prijungiančio domeno; transmembraninės α spiralės, kuri jungia du domenus; viduląstelinio domeno, turinčio tirozino kinazinį akty-vumą (154). Ląstelės procesų reguliavime svarbų vaidmenį atlieka augimo faktoriai (angl. growth factors), kurie jungiasi prie ląstelių paviršiuje esančių RTK. Aktyvuotos RTK gali sukelti platų spektrą skirtingų signalinių kelių: RAS/RAF/MEK/MAPK, PLC/PKC, PI3K/AKT/mTOR ir JAK/STAT (155). Prisijungus prie receptoriaus hormonui arba augimo faktoriui, aktyvinamas baltymo tirozino kinazinis aktyvumas ir fosforilinamos tirozino liekanos. Šiems nuo ATF ir fosfatų priklausomiems procesams taip pat svarbūs ir Mg2+ jonai. Magnis reikalingas tiek receptorinių (VEGFR, EGFR, FGFR, PDGFR), tiek ne receptorinių (Src, Abl, Jak, FAK, SOCS) tirozino kinazių aktyvumui (156). Nustatyta, kad didelė Mg2+ koncentracija padidina tirozino kinazės aktyvumą. Kristalografiniai tyrimų duomenys atskleidė, kad fermento ak-tyvumui ir fosforilgrupės pernešimui būtinos dvi Mg2+molekulės: viena jun-giasi prie ATF (Mg∙ATF) kinazės domene, antra prie α- ir β-fosfatų ir aspa-ragino amido azoto katalizinėje kilpoje (117). Taigi, Mg2+ svarba reguliuojant kinazės aktyvumą susideda iš keturių etapų: Mg˖ATF jungiasi su fermentu; kinazė jungiasi su baltymo substratu ir katalizuoja fosforilgrupės pernešimą; atpalaiduojamas fosforilintas baltymas ir Mg2+; atpalaiduojamas Mg∙ADF ir katalizinis ciklas baigiamas (1.5.4.1 pav. (157)).
36
1.5.4.1 pav. Schematinis Mg2+ir kinazės katalizinio aktyvumo reguliavimo vaizdavimas
Modifikuota pagal (145)
1.5.5. TRPM7 vaidmuo receptorinės tirozino kinazės signaliniame kelyje
TRPM7 yra unikalus fermentinis kanalas, kuris funkcionuoja kaip joninis kanalas, atsakingas už dvivalenčių katijonų patekimą ir kaip citoplazminė kinazė, kuri fosforilina aneksiną-1, miozino IIA sunkiąją grandinę, eEF2, SMAD2, ir PLCγ2 ir dalyvauja RTK signaliniame kelyje.
Eksperimentiniais tyrmais parodyta, kad padidėjęs RTK aktyvavimas ir pakitęs augimo faktoriaus sukeltas kinazės signalinis kelias susijęs su ne-kontroliuojama vėžinių ląstelių proliferacija (158). Atitinkamai, VEGFR (kraujagyslių endotelio augimo faktoriaus receptorius; angl. vascular
endo-thelial growth factor) ir EGFR (epidermio augimo faktoriaus receptorius;
angl. epidermal growth factor receptor) tirozino kinazių inhibitoriai buvo taikomi gydant tam tikras vėžio formas. Tačiau ištirta, kad šie vaistai sukelia nepageidaujamus šalutinius reiškinius, kaip hipertenziją, širdies ir krauja-gyslių bei inkstų intoksikaciją ir elektrolitų balanso sutrikimus (158–161).
Nustatyta, kad augimo faktorius taip pat gali reguliuoti TRPM7 kanalus per EGF bei VEGF receptorius (8, 162, 163). Tyrimuose su transfekuotomis kininių žiurkėnų kiaušidžių (CHO) ląstelėmis pademonstruotas TRPM7 kanalo aktyvumo inhibavimas EGF, dalyvaujant PLC ir PIP2 (8). Tačiau Gao
37
su bendraautoriais (2011) nustatė (138), kad EGF, padidina ląstelės membranos baltymų ekspresiją ir TRPM7-tipo sroves plaučių vėžinių ląstelių linijose (138). Manoma, kad duomenys išsiskyrė, dėl tyrimuose taikytų skirtingų modelių ir nevienodo tipo ląstelių linijų. Hipokampo neuronuose NGF (nervų augimo faktorius; angl. nerve growth factor) signalo perdavimas per tirozino kinazės TrkA receptorius, efektyviai veikiant TrkA ir PLC inhibitoriams parodė sumažėjusią išeinančios TRPM7-tipo srovės rektifika-ciją (angl. outward rectification) (164). Be to, nustatyta, kad PDGF (trombocitų kilmės augimo faktorius; angl. platelet-derived growth factor) stimuliavimas padidino TRPM7 ekspresiją HSC-T6 žiurkių kepenų ląstelėse. Tačiau, nespecifinis TRPM7 inhibitorius 2-aminoetildifenilboratas (2-APB) susilpnino PDGF sąlygotą p-AKT ir p-ERK aktyvavimą. Šie duomenys patvrtino, kad AKT (dar žinoma kaip baltymų kinazė B) ir ERK (ekstra-ląsteliniu būdu reguliuojama kinazė; angl. extracellular-regulated kinase) reguliuoja TRPM7 kanalus (165).
Kaip pateikta 1.5.5.1 pav. ligandų sukeltas RTK (EGFR) aktyvavimas reguliuoja TRPM7 aktyvumą. Bradikininas, Ang II ir IL-18 taip pat turi įtakos TRPM7 kanalų aktyvumui. Eksperimentiniais tyrimais nustatyta, kad Ang II, kuris transaktyvuoja (angl. transactivate) TKR (treonino kinazės receptorius; angl. threonine kinase receptor), padidino TRPM7 ekspresiją per AT1 receptorius ir ERK (13). Nustatyta, kad bradikininas (kitas vazoaktyvus peptidas) reguliuoja TPRM7 bei aneksiną-1 per PLC ir c-Src priklausomus kelius, kurie vaidina svarbų vaidmenį kraujagyslių lygiųjų raumenų ląstelių Mg2+ homeostazėje ir ląstelių migracijoje (166). Parodyta, kad interleukinas-18 (IL-18) aktyvavo TRPM7-tipo sroves ir padidino TRPM7 ekspresiją nuo ERK1/2 priklausomuose procesuose, kurie daro įtaką kraujagyslių lygiųjų raumenų ląstelių osteogeninei diferenciacijai (167). Tyrimuose su HEK293 ląstelėmis pademonstruota, kad interleukinas-6 (IL-6) slopino TRPM7 sroves per JAK2-STAT3 signalinius kelius, nepriklausomai nuo TPRM7 α-kinazės domeno.
Tyrimuose atliktuose naudojant įvairias ląstelių linijas parodyta, kad ki-nazės reguliuoja TRPM7 kanalus, tačiau, žinoma ir tai, kad ir pačios kiki-nazės gali tapti TRPM7 taikiniais. Nustatyta, kad TRPM7 reguliuoja MAP (mito-genų aktyvinamos proteinkinazės (angl. mitogen-activated protein kinase) kinazes. Tyrimuose pademonstruota, kad pelių smegenų žievės astrocituose ir žiurkių kraujagyslių lygiųjų raumenų ląstelėse, TRPM7 siRNR buvo susijusi su sumažėjusia ERK1/2 fosforilinimo funkcija (168). Be to, TRPM7 siRNR sumažino Src, p38 MAPK, ERK1/2 ir JNK aktyvavimą krūties vėžinių ląstelių linijoje (169, 170). Taikant farmakologines medžiagas vėžiniuose audiniuose ir linijinėse ląstelėse, taip pat buvo pastebėta TRPM7 įtaka MAPK
38
signaliniame kelyje. Karvakrolis − TRPM7 inhibitorius, slopino ERK1/2 fosforilinimą ir AKT, mažindamas ląstelių proliferaciją (171–173).
\
1.5.5.1 pav. Schema vaizduojanti TRPM7 aktyvavimo reguliavimą
ligandais RTK (EGFR)
Modifikuota pagal (145).
Dar vienas svarbus momentas, kuris neaptartas, bet į kurį verta atkreipti dėmesį, kaip parodyta 1.5.5.1 pav., tai TRPM6 kanalai (1). Kaip jau minėta, TRPM6 ir TRPM7 yra labiausiai panašūs kanalai tiek savo struktūra, tiek funkcijomis (magnio hemostazės palaikymas ląstelėse), bet jų farmakologinis reguliavimas ir viduląsteliniai signalizacijos keliai yra skirtingi ir jie daly-vauja skirtingų fiziologinių ir patofiziologinių procesų iniciavime/ vystymesi (174). Literatūros duomenimis, TRPM6 kanalai palaiko magnio homeostazę inkstų kanalėlių lygiųjų raumenų ląstelėse, o TRPM7 – širdies ir kitose dirgliose ląstelėse (1, 18, 19). Iki šiol, TRPM6 baltymo ekspresija, taikant molekulinius ar genetinius tyrimų metodus, širdyje nebuvo aptikta. Todėl buvo manoma, kad šių kanalų širdyje nėra. Tik visai neseniai, viena moks-lininkų grupė (55) pademonstravo TRPM6 ekspresiją (nors ir labai mažą) žmogaus prieširdžio ląstelėse pacientų, kuriems buvo diagnozuota PV pa-tologija. Tačiau kontrolinėmis sąlygomis (be PV patologijos) TRPM6 nebuvo aptikti. Srovių per šiuos kanalus tankis, nustatytas eksperimentinėmis sąlygomis su heterologiškai ekspresuotais kanalais įvairių tipų linijinėse
