KRAUJO PLAZMOJE ESC METODU Β ETA LAKTAMINIŲ ANTIBIOTIKŲ NUSTATYMAS ŽMOGAUS

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA

FARMACIJOS FAKULTETAS

ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA ELENAS MATILIONIS

ΒETA LAKTAMINIŲ ANTIBIOTIKŲ NUSTATYMAS ŽMOGAUS

KRAUJO PLAZMOJE ESC METODU

Darbo vadovas:

Prof. dr. Liudas Ivanauskas KAUNAS, 2018

2 LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

MEDICINOS AKADEMIJA FARMACIJOS FAKULTETAS

ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanė prof. R. Morkūnienė Data

ΒETA LAKTAMINIŲ ANTIBIOTIKŲ NUSTATYMAS ŽMOGAUS

KRAUJO PLAZMOJE ESC METODU

Konsultantas Darbo vadovas

Vardas, pavardė, parašas Prof. dr. Liudas Ivanauskas Data (metai, mėnuo, diena) Data

Recezentas Darbą atliko

Magistrantas: Elenas Matilionis Data Data KAUNAS, 2018

3

TURINYS

1.3 Beta laktaminiai antibiotikai ... 16

1.4 Tiriamasis objektas... 17

1.4.1 Meropenemas ... 17

1.4.2 Ceftazidimas ... 19

1.4.3 Piperacilinas ... 20

1.5 Rezistentiškumas antibiotikams ... 22

1.5.1 Pagrindinės rezistentiškumo antibiotikams plitimo priežastys ... 23

1.6 Analizės metodų apžvalga ... 24

1.6.1 Chromatografija ... 24

1.7 Efektyviosios skysčių chromatografijos analizės metodikos ... 24

1.7.1 ESC analizės metodikos betalaktaminiams antibiotikams ... 25

2. Eksperimentinė dalis ... 25

2.1 Tyrimo objektas ... 25

2.2 Naudoti reagentai ir aparatūra ... 25

2.3 Tyrimo metodai... 26

2.3.1. Standartinių tirpalų, tiriamųjų mėginių ir eliuento paruošimas ... 26

2.3.2 Chromatografijos sąlygos ... 27

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 27

3.1 ESC metodo pritaikymas ... 27

3.2 Efektyviosios skysčių chromatografijos validacija ceftazidimo, meropenemo bei piperacilino tyrimui ... 28

3.2.1 Metodo specifiškumas ... 28

4

3.2.2.1. Pakartojamumas ... 32

3.2.2.2. Tarpinis preciziškumas ... 32

3.2.3 Tiesiškumas ... 33

3.2.4 Aptikimo ir nustatymo ribos ... 35

3.3 ESC taikymas beta laktaminių antibiotikų identifikavimui ... 36

3.4 ESC taikymas antibiotikų kiekybiniam nustatymui ... 38

3.4.1 Antibiotikų tirpalų paruošimas kalibracinėms kreivėms sudaryti ... 38

3.4.2 Antibiotikų kiekio nustatymas žmogaus kraujo plazmoje ... 39

3.5 Rezultatų apibendrinimas ... 40

IŠVADOS ... 41

PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 42

LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 43

5

SANTRAUKA

Eleno Matilionio magistro baigiamasis darbas „ Beta laktaminių antibiotikų nustatymas žmogaus kraujo plazmoje esc metodu.“/ mokslinis vadovas prof. dr. Liudas Ivanauskas. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Farmacijos fakulteto Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra – Klinikinės farmakologijos katedra.

Raktiniai žodžiai: Ceftazidimas, meropenemas, piperacilinas, efektyvioji skysčių chromatografija, rezistentiškumas.

Darbo tikslas: Atlikti kiekybinį ir kokybinį pasirinktų beta laktaminių antibiotikų tyrimą žmogaus kraujo plazmoje validuotu efektyviosios skysčių chromatografijos metodu.

Darbo uždaviniai:

1. Pritaikyti efektyviosios skysčių chromatografijos metodą kokybiniam ir kiekybiniam beta laktaminių antibiotikų nustatymui žmogaus kraujo plazmoje.

2. Ivertinti beta laktaminių antibiotikų kiekį ir ypatumus žmogaus kraujo plazmoje. 3. Validuoti efektyviosios skysčių chromatografijos tyrimo metodą.

Tyrimo objektas ir metodai: Standartiniai ceftazidimo, meropenemo ir piperacilino tirpalai bei pacientų, vartojusių meropenemą ir piperaciliną, kraujo plazmos mėginiai. Tyrimas buvo atliktas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu.

Rezultatai ir išvados: Tarptautines harmonizacijos konferencijos gairėmis, buvo validuota ESC metodika antibiotikų identifikavimui. Tiesiškumas įrodytas kreivių koreliacijos koeficientais (>0,99). Rezultatų glaudumas pagrįstas tuo, kad pakartojamumo santykinis standartinis nuokrypis buvo <5 proc., atkuriamumo ir preciziškumo <10 proc. Atlikus kokybinius antibakterinių preparatų tyrimus žmogaus kraujo plazmoje, veiklieji junginiai identifikuoti vertinant standartinių tirpalų ir plazmos mėginiuose esančių antibiotikų sulaikymo trukmes bei spektrų atitikimus.

Atlikus kiekybinį meropenemo ir piperacilino nustatymą tirtuose mėginiuose buvo nustatyti esantys antibiotikų kiekiai:

6

• kraujo mėginiuose, paimtuose iškart po injekcijos meropenemo koncentracija įvairavo tarp 71,891µg/ml ir 74,767µg/ml, o po 15min. tarp 45,758µg/ml ir 44,212µg/ml.

• kraujo mėginiuose, paimtuose 5 minutės po infuzijos pradžios piperacilino koncentracija svyravo tarp 7,444µg/ml ir 59,963.µg/ml, o po 15 minučių tarp 301,252µg/ml ir 400,143µg/ml.

7

SUMMARY

The Master Thesis The determination of beta-lactam antibiotic in the human blood plasma by high-performance liquid chromatography by Elenas Matilionis / scientific tutor prof. dr. Liudas Ivanauskas, consulting tutor prof. Romaldas Mačiulaitis. Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy, Department of Analytical and Toxicological chemistry – Department of Clinical Pharmacology. Kaunas, 2018.

Key words: Ceftazidime, Meropenem, Piperacilin, high-performance liquid chromatography, antibiotic resistance.

The aim: To carry out the qualitative and quantitative beta-lactam antibiotics research in human blood plasma using validated high-performance liquid chromatography method.

The tasks:

1. To apply high-performance liquid chromatography method in order to evaluate beta-lactam antibiotics qualitatively and quantitatively in the human blood plasma.

2. To estimate beta-lactam antibiotics quantity and perculiarities in the human blood plasma. 3. To validate high-performance liquid chromatography method.

The objects: The standart solutions of the Ceftazidime, Meropenem, Piperacilin and patient’s, who used these antibiotics, blood plasma samples.

The method: High-performance liquid chromatography.

Results and conclusions: The analysis of ICH (The International Council for Harmonisation)

guidelines were used to validate high-performance liquid chromatography. Beta-lactam antibiotics were qualitatively and quantitatively evaluated using this HPLC method. The linearity of the curves showed correlation coefficients (>0,99). The closeness of results was based by the fact that the repeatability relative standard deviation is <5 per cent, reproducibility and precision <10 per cent. After qualitative analysis of chosen antibiotics in human blood plasma, active compounds were identified according to spectrums and retention times in standart and human blood plasma solutions. After the quantitative analysis of meropenem and piperacilin we found that there were:

8 • in blood plasma samples which were taken after the injection, concentration of meropenem varied between 71,891µg/ml and 74,767µg/ml. Also, there was found that meropenem concentration varied between 45,758µg/ml and 44,212µg/ml insamples, which were taken 15 minutes after the injection.

• in blood plasma samples which were taken 5 minutes after the beginning of infusion,

concentration of piperacillin varied between 7,444µg/ml and 59,963.µg/ml and after 15 minutes this concentration varied between 301,252µg/ml and 400,143µg/ml.

9

PADĖKA

Už suteiktas kokybiškas darbo sąlygas, dėkoju Lietuvos Sveikatos Mokslų Universiteto, Farmacijos fakulteto, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedros darbuotojams.

Norėčiau padėkoti savo darbo vadovui, Prof. dr. Liudui Ivanauskui, už konsultacijas ir palaikymą rengiant farmacijos magistro darbą. Už pagalbą ir patarimus dėkoju lektoriui Mindaugui Marksai. Už suteiktas darbo medžiagas ir tyrimo objektus dėkoju Prof. dr. Romaldui Mačiulaičiui.

10

SANTRUMPOS

ATC – anatominė cheminė terapinė klasifikacija ESC – efektyvioji skysčių chromatografija

ICH – Tarptautinė konferencija dėl žmonėms skirtų vaistinių preparatų registracijai taikomų techninių reikalavimų suderinimo.

MSK – mažiausia slopinamoji koncentracija NAPD – nuolatinė ambulatorinė peritoninė dializė PPB – proteinus prijungiantis baltymas

PSBL – plataus spektro betalaktamazėms PSO – Pasaulinė sveikatos organizacija SSN – santykinis standartinis nuokrypis tR – Sulaikymo laikas

11

SĄVOKOS

Betalaktamazės – tai fermentai, kurie inaktyvuoja beta laktaminio antibiotiko beta laktamo žiedą.

Cistine fibrozė - tai paveldima liga, kuriai būdingas daugelio organų sistemų pažeidimas dėl sutrikusios egzokrininių (išorinės sekrecijos) liaukų funkcijos.

Otitas - ai išorinės klausomosios landos audinių uždegimas, sukeltas bet kokių dirginančių veiksnių (mikrobų, alergijos, traumos).

Peritonitas - ai pilvo ertmę dengiančios plėvės uždegimas, kuris dažniausiai išsivysto dėl infekcinio uždegimo pilvaplėvės ertmėje.

Pielonefritas - tai inksto taurelių, geldelių ir intersticinio audinio uždegimas.

Rezistentiškumas – tai mikroorganizmo savybė tapti atspariu antibiotikų poveikiui. Skiriamos dvi rezistentiškumo rūšys:

• Natūralus rezistentiškumas. Kai visi vienos rūšies sukėlėjai yra nejautrūs vienam antibiotikui. • Įgytas rezistentiškumas. Jis atsiranda gydymo metu antibiotikais, kuriems iki tol dar buvo jautrūs

12

ĮVADAS

Antibiotikai – vienas iš svarbiausių praėjusio šimtmečio atradimų medicinos istorijoje, padėjęs išgelbėti daugybę gyvybių bei sustabdęs nevaldomą bakterinių infekcinių ligų plitimą. Pagal anatominę terapinę cheminę (ATC) klasifikaciją antibiotikai priskiriami antiinfekcinių preparatų J grupei. Ši vaistų grupė - tai natūraliu ar sintetiniu būdu gaminamos mikrobų, gyvulinės ar augalinės kilmės medžiagos, kurios veikdamos bakteriocidiškai arba bakteriostatiškai sustabdo, arba prislopina tam tikrų mikrobų augimą ir dauginimąsi.[1,2]

Atradus antibiotikus buvo manoma, kad kova su mikroorganizmais baigta, tačiau nepaisant pažangių medicinos technologijų, šiuo metu ypatingai didelį susirūpinimą kelia sparčiai besivystantis antimikrobinis rezistentiškumas ir pacientų neracionalus antibiotikų vartojimas. PSO duomenimis, pagal mirties priežasčių statistiką kasmet net 25% žmonių pasaulyje vis dar miršta nuo infekcinių ligų. Neracionalų antibiotikų vartojimą lemia daugybė priežasčių. Tai glaudžiai susiję su prastomis visuomenės žiniomis apie šią vaistinių preparatų grupę. Taip pat savigyda antibiotikais yra plačiai paplitęs reiškinys, galintis nulemti neracionalų šių vaistų vartojimą. Nuolatos didėjantis atsparumas antibiotikams padidina sveikatos priežiūros kaštus, prailgina gydymo ligoninėje laiką bei didina mirtingumą. Apskaičiuota, kad vien tik Europos Sąjungoje antimikrobiniams vaistams atsparios bakterijos yra maždaug 25.000 mirties atvejų priežastis ir kainuoja daugiau nei 1,5 mlrd. JAV dolerių kasmet, vertinant sveikatos priežiūros išlaidas.[1,3,4]

Antibiotikai ne tik išgelbėjo jau sunkiai sergančių pacientų gyvybes, bet ir leido apsaugoti ne bakterinės kilmės ligomis sergančius žmones nuo infekcijų rizikos. Šie vaistai, naudojami kaip profilaktikos priemonė chemoterapiniame gydyme, diabeto gydyme, reumatoidinio artrito ar organų transplantacijos metu, gali apsaugoti pacientus nuo netikėto užsikrėtimo bakterine infekcija.

Racionalus antibiotikų vartojimas leidžia prailginti žmonių gyvenimo trukmę. Maždaug prieš šimtą metų buvo numatoma, jog Jungtinėse Valstijose žmonių gyvenimo trukmė sieks vos 56.4 metus, tačiau dabar prognozės visiškai pasikeitė – numatoma gyvenimo trukmė pailgėjo iki 80–ies metų. Taigi, racionaliai vartojami antibiotikai pagerina žmonių gyvenimo kokybę.[5]

Darbo tikslas:

Atlikti kiekybinį ir kokybinį pasirinktų beta laktaminių antibiotikų tyrimą žmogaus kraujo plazmoje validuotu efektyviosios skysčių chromatografijos metodu.

13 Darbo uždaviniai:

1. Pritaikyti efektyviosios skysčių chromatografijos metodą kokybiniam ir kiekybiniam beta laktaminių antibiotikų nustatymui žmogaus kraujo plazmoje.

2. Ivertinti beta laktaminių antibiotikų kiekį ir ypatumus žmogaus kraujo plazmoje. 3. Validuoti efektyviosios skysčių chromatografijos tyrimo metodą.

14

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1 Antibiotikai

Antibiotikai (gr. Anti – prieš, bios – gyvybė) – tai mikrobinės, gyvulinės ar augalinės kilmės medžiagos, selektyviai slopinančios mikroorganizmų gyvybingumą. Nors pirmasis antibiotikas buvo sukurtas tik 1928m., šių medžiagų vartojimas turi ilgą priešistorę. Jau 1000 m. p. m. e. senovės Kinijoje buvo naudojama supelijusi sojos pupelių košė opų gydymui, o Europoje žaizdų gydymui naudodavo supelijusią duoną. 16 a. p. m. e. rastame papiruse minima efektyvi žaizdų gydymo priemonė - ant numirėlio kaukolės augantys pelėsiai. Tikrųjų Antibiotikų paieška prasidėjo XVII a. antrojoje pusėje, kai plačiai pasklido mikrobinės prigimties ligų teorija. 1871 m. chirurgas J. Listeris pastebėjo, kad pelėsiais užterštame šlapime nesidaugina bakterijos. [7,8,9] 1928 m. A. Flemingas nustatė, kad pelėsis Penicillium notatum tirpdo Staphylococcus aureus kultūrą ant agaro. Šį atradimą jis padarė atsitiktinai – grįžęs po atostogų pastebėjo, kad Petri lėkštelėse esanti stafilokoko kultūra užteršta pelėsiu, suardžiusiu bakterijų kolonijas aplink save. Tačiau A. Flemingui nepavyko iškirti iš pelėsio veikliosios medžiagos, pasižymėjusios antimikrobiniu poveikiu. Tai padarė Oksfordo mokslininkai Hovardas Floris ir Ernestas Čeinas, kurie 1945 metais, įskaitant ir patį A. Flemingą, gavo Nobelio premiją. Tuomet ir prasidėjo antimikrobinių vaistų era, padėjusi išsaugoti daugybę žmonių gyvybių. Vaistų gamyba išsiplėtė tik po II-ojo pasaulinio karo. Pirmaisiais pokario metais penicilinas buvo griežtai reglamentuotas bei skiriamas tik sergantiems venerinėmis ligomis. Penicilinas buvo vadinamas stebuklingu vaistu ir tapo populiarus „juodojoje“ rinkoje. Tik penktąjamą dešimtmetyje penicilino gydymo įstaigose atsirado pakankamai. [9,10,11]

1.2 Antibiotikų klasifikacija

Antibiotikus galima klasifikuoti įvairiausiais būdais, atsižvelgiant į jų poveikį bakterijoms, veikimo mechanizmą, veikimo spektrą, chemine struktūrą ir t.t. Labai svarbus yra skirstymas pagal tai, kaip jie veikia – baktericidiškai ( visiškai sunaikina bakterijas ) ar bakteriostatiškai ( tik sustabdo bakterijų dauginimąsi). Toks antibiotikų skirstymas svarbus, kai pacientui reikia paskirti kelis antibakterinius preparatus, tačiau nėra visiškai tikslus. Kai kurie antibiotikai vienas bakterijų rūšis veikia bakteriostatiškai, o kitas baktericidiškai. Pavyzdžiui chloramfenikolis, pasižymintis bakteriostatiniu

15 poveikiu, baktericidiškai veikia Streptococcus pneumoniae ir Haemophilus influenzae. Taip pat makrolidai iš esmės būdami bakteriostatikais, Corynebacterium diphteriae ir kai kurias streptokokų padermes veikia baktericidiškai. Be to, ar antibiotikai veiks labiau baktericidiškai, ar bakteriostatiškai, priklauso ir nuo vaisto dozės – labai didelės kai kurių bakteriostatinių antibiotikų dozės gali veikti ir baktericidiškai.[8,13]

Atsižvelgiant į veikimo mechanizmą, antibakteriniai preparatai skirstomi į šešias grupes:

1) Antibiotikai stabdantys bakterijos sienelę sudarančių medžiagų sintezę (penicilinai, cefalosporinai, karbapenemai). Šie preparatai suardo bakterijų sienelės gliukopeptidini komponenta, kurio neturi žmogaus kūno ląstelės, todėls jie yra mažai toksiški.

2) Bakterijų baltymų sintezės inhibitoriai (makrolidai, tetraciklinai, linkozamidai, fucidinas). 3) Nukleorūgščių inhibitoriai (rifamicinai, fucidinas).

4) Bakterijų citoplazmos ardytojai (aminoglikozidai).

5) Folio rūgšties antagonistai (sulfanilamidai, trimetoprimas).

6) Βeta laktamazių inhibitoriai (klavulano rūgštis, tazobaktamas). [8]

Viena iš patikimiausių ir dažniausiai vartojamų antibiotikų klasifikacijų yra jų grupavimas pagal cheminę struktūrą:

a) aciklinės struktūros antibiotikai (polienai) b) penicilinai (ampicilinas);

c) tetraciklinai (doksiciklinas);

d) deguonies turintys heterocikliniai (grizeofulvinas, novobiocinas); e) makrolidai (eritromicinas);

f) aminoglikozidai (kanamicinas); g) antraciklinai (rubomicinas);

h) polipeptidiniai (gramicidinai, polimiksinai); i) aktinomicinai [7]

16

1.3 Beta laktaminiai antibiotikai

Betalaktaminiai antibiotikai yra viena iš seniausių ir populiariausių antibakterinių preparatų rūšių. Pirmąjį šios grupės preparatą, kaip ir pirmąjį antibiotiką 1929 metais atrado mokslininkas Aleksandras Flemingas. Nuo to laiko buvo pagaminta per šimtas tukstančių šių antibiotikų, gaminamų sintetiniu ar pusiau sintetiniu būdu. [12,14]

Betalaktaminiai antibiotikai yra plataus veikimo spektro antimikrobinės medžiagos. Visi šios grupės preparatai yra selektyūs bakterijų sienelės medžiagų sintezės slopintojai. Jie baktericidiškai veikia bakterijas jų augimo stadijoje ir labai retai sukelia nepageidaujamas reakcijas žmogui. Betalaktaminiai antibiotikai selektyviai ir negrįžtamai slopina fermentus, dalyvaujančius peptidoglikano sintezėje. Skiriamasis šių antibiotikų bruožas yra betalaktamo (keturnaris ciklinis amidas) žiedas. (1 pav.) [8]

1 pav. Betalaktaminių antibiotikų žiedo struktūra [15]

Betalaktaminiams antibiotikas priskiriamos šios antibiotikų rūšys:

• penicilinai (penicilinas G, benzilpenicilinas, penicilinas N);

• cefalosporinai (cefazolinas, cefuroksimas,ceftazidimas, cefepimas); • monobaktamai (aztreonamas);

• karbapenemai (imipenemas, meropenemas,ertapenemas);

17

1.4 Tiriamasis objektas

1.4.1 Meropenemas

Meropenemas, tai karbapenemų grupės antibiotikas, kuris praktikoje vartojamas trihidrato pavidalu. [19]

2 pav. Meropenemas [20]

Šis vaistas naikina bakterijas, galinčias sukelti:

• Plaučių uždegimą (pneumoniją).

• Pacientų, sergančių cistine fibroze, plaučių ir bronchų infekcines ligas. • Komplikuotas šlapimo takų infekcines ligas.

• Komplikuotas pilvo ertmės infekcines ligas.

• Gimdymo metu ar po gimdymo pasireiškusias infekcines ligas. • Komplikuotas odos ir poodinių audinių infekcines ligas.

18 Fizikinės savybės: balti ar šviesiai gelsvi kristaliniai milteliai, šiek tiek tirpūs vandenyje, praktiškai netirpūs etanolyje (96%) ir metileno chloride. [21]

Veikimo mechanizmas: meropenemas veikia bakteriocidiškai trikdydamas gramneigiamų ir gramteigiamų bakterijų ląstelių sienelės sintezę, prisijungdamas prie penicilinus prisijungiančių baltymų (PBP). [16]

Lietuvoje registruoti preparatai: “AGENOREM” ir “Meropenem Accord” [19]

Vaisto forma: Baltos ar gelsvos formos kristaliniai milteliai skirti injekciniam ar infūziniam tirpalui. [13]

Terapinės indikacijos: meropenemo vaistiniai preparatai skirti gydyti suaugusiems bei vyresniems nei 3 mėnesių vaikams, kurie serga.

• Sunkiai pneumonijai (įskaitant hospitalinę ir susijusią su dirbtine plaučių ventiliacija). • Cistine fibroze sergančių pacientų infekcinėms bronchų ir plaučių ligoms.

• Komplikuotoms šlapimo takų infekcinėms ligoms. • Komplikuotoms pilvo ertmės infekcinėms ligoms.

• Gimdymo metu ar po gimdymo pasireiškusioms infekcinėms ligoms. • Komplikuotoms odos ir minkštųjų audinių infekcinėms ligoms. • Ūminiam bakteriniam meningitui. [19]

Santykis tarp farmakokinetikos ir farmakodinamikos: meropenemo, kaip ir kitų betalaktaminių antibiotikų laikas, per kurį koncentracija viršija mažiausią slopinamąją koncentraciją (MSK), geriausiai korealiuoja su veiksmingumu. Ikiklinikinių tyrimų metu nustatyta, kad šio antibiotiko poveikis pasireiškia, kai infekuoto organizmo kraujo plazmoje vaistinio preparato MSK viršijamas 40%. [19] Atsparumo mechanizmas bakterijų atsparumą meropenemui gali lemti: (1) gramneigiamų bakterijų išorinės membranos laidumo sumažėjimas; (2) taikinio PPB afiniteto sumažėjimas; (3) išstūmimo iš ląstelės siurblio komponentų raiškos padidėjimas; (4) betalaktamazių, galinčių hidrolizuoti

19 1.4.2 Ceftazidimas

Ceftazidimas, tai sintetinis III kartos plataus veikimo spektro cefalosporinas. Šis antibiotikas baktericidiškai veikia gramteigiamus mikroorganizmus ir ypač gramneigiamus, o svarbiausia, kad jis yra efektyvus prieš daugumai antibiotikų atsparią P.aeruginosa bakterijų padermę. Taip pat ceftazidimas yra veiksmingas prieš hospitalinių infekcijų sukėlėjus, kurie yra atsparūs daugelio betalaktamazių hidrolizei. Praktikoje šis antibiotikas vartojamas pentahidrato pavidalu. [22]

3 pav. Ceftazidimas [22]

Fizikinės savybės: balti ar šviesiai gelsvi kristaliniai milteliai, lengvai tirpūs vandenyje ir metanolyje, praktiškai netirpūs acetone. [21]

Veikimo mechanizmas: ceftazidimas prisijungia prie PPB ir slopina bakterijų sienelės sintezę. Todėl nutrūksta ląstelės sienelės (peptidoglikano) biosintezė, pasireiškia bakterijų ląstelės lizė ir ląstelės žūsta. [22]

Lietuvoje registruoti preparatai: „Biotum“, „Ceftazidime Kabi“, „Ceftazidime MIP“, „Fortum“. [23]

Terapinės indikacijos: šis antibiotikas skirtas suaugusiųjų ir vaikų, įskaitant naujagimius (nuo gimimo) infekcinėms ligoms gydyti.

• Ligoninėje įgyta pneumonija.

• Bronchų ir plaučių infekcijos, sergant cistine fibroze. • Bakterinis meningitas.

20 • Lėtinis pūlingas vidurinis otitas.

• Piktybinis išorinis otitas.

• Šlapimo takų infekcinės ligos su komplikacijomis.

• Odos ir poodinio audinio infekcinės ligos su komplikacijomis. • Pilvo ertmės infekcinės ligos su komplikacijomis.

• Kaulų ir sąnarių infekcinės ligos.

• Peritonitas, susijęs su dialize pacientams, kuriems taikoma nuolatinė ambulatorinė peritoninė dializė (NAPD). [23]

Santykis tarp farmakokinetikos ir farmakodinamikos: nustatyta, kad svarbiausias cefalosporinų veiksmingumą in vivo nurodantis farmakokinetikos / farmakodinamikos rodmuo yra dozavimo intervalo procentinė dalis, kurios metu neprisijungusios veikliosios medžiagos koncentracijos būna didesnės už mažiausią slopinamąją ceftazidimo koncentraciją atskirai numatytai mikroorganizmų rūšiai (t. y. % T > MSK).

Mikroorganizmų atsparumo atsiradimo mechanizmai: bakterijų atsparumas ceftazidimui gali pasireikšti dėl vieno ar daugiau išvardytų mechanizmų.

• Hidrolizė dėl betalaktamazių poveikio. Ceftazidimas gali būti veiksmingai hidrolizuojamas veikiant plataus spektro betalaktamazėms (PSBL).

• Ceftazidimo afiniteto peniciliną prisijungiantiems baltymams sumažėjimas.

• Išorinės membranos nepraeinamumas, dėl kurio mažesnis ceftazidimo kiekis PPB gramneigiamuose mikroorganizmuose.

• Bakterijų šalinimo iš ląstelės siurbliai. [23]

1.4.3 Piperacilinas

Piperacilinas, tai labai plataus veikimo spektro penicilinų grupės antibiotikas. Pagal savo cheminę struktūra jis priskiriamas aminopenicilinams, kurie veikia daug stipriau už senosios kartos penicilinus. [21] Šie antibiotikai yra neatsparūs penicilinazėms bei nesirezorbuoja iš virškinamojo trakto, todėl yra leidžiami į vena. Praktikoje penicilinas vartojamas su betalaktamazės inhibitorium tazobaktamu. [8]

21 4 pav. Piperacilinas (A) [24]

Toks dviejų antibiotikų mišinys veikia baktericidiškai gramteigiamas ir gramneigiamas bakterijas, ypač P.aeruginosa bei yra atsparus betalaktamazėms. [8]

Fizikinės savybės: balti ar beveik balti milteliai, tirpūs vandenyje, lengvai metanolyje bei etilo acetate. [21]

Veikimo mechanizmas: piperacilinas veikia baktericidiškai, slopindamas bakterijų sienelės ir pertvaros sintezę. [24] Tazobaktamas papildo piperacilino poveikį slopindamas daugelį beta laktamazių, kurios paprastai sukelia atsparumą penicilinams ir cefalosporinams, bet neslopina AmpC fermentų arba metalo beta laktamazių. [8]

Lietuvoje registruoti preparatai: Piperacillin/Tazobactam Teva, Piperacillin/Tazobactam Snadoz. [25]

Terapinės indikacijos: Piperacilinas/Tazobaktamas yra skirtas suaugusiųjų ir vyresnių kaip 2 metų vaikų infekcijoms gydyti.

• Sunki pneumonija, įskaitant hospitalinę ir su dirbtine plaučių ventiliacija susijusią pneumoniją. • Šlapimo takų infekcijos su komplikacijomis (įskaitant pielonefritą).

• Intraabdominalinės infekcijos su komplikacijomis.

• Odos ir minkštųjų audinių infekcijos su komplikacijomis (įskaitant diabetinės pėdos infekcijas). Pacientų, kuriems įtariama arba nustatyta bakteremija, susijusi su anksčiau išvardintomis infekcijomis, gydymas. Piperacilino/tazobaktamo mišiniu taip pat galima gydyti karščiuojančius

22 pacientus, kuriems pasireiškia neutropenija, kurie karščiuoja, kaip įtariama, dėl bakterijų sukeltos infekcijos. Vaikams nuo 2 iki 12 metų šis antibiotikas skiriamas intraabdominalinės infekcijos su komplikacijomis gydymui. [25]

Santykis tarp farmakokinetikos ir farmakodinamikos: Laikas, kurį koncentracija būna didesnė už mažiausią slopinamąją koncentraciją (T > MSK), laikomas svarbiausiu piperacilino veiksmingumą lemiančiu farmakodinaminiu veiksniu. [25]

Atsparumo atsiradimo mechanizmas:

• tos beta laktamazės, kurių tazobaktamas neslopina, mažina piperacilino aktyvumą: B, C ir D molekulinės klasės beta laktamazės. Taip pat tazobaktamas neapsaugo nuo A ir D molekulinės klasės fermentų grupių plataus veikimo beta laktamazių.

• pakinta peniciliną prijungiantys baltymai (PPB), dėl to sumažėja piperacilino giminingumas molekuliniam taikiniui bakterijose. [25]

1.5 Rezistentiškumas antibiotikams

Nuo pat antibiotikų eros pradžios, buvo pastebėta viena, su jų vartojimu susijusi, problema. Tai buvo bakterijų įgijama apsauga šiems preparatams. 1937 metais pradėjus vartoti sulfonamidus terapiniais tiukslais, vos per du metus buvo pastebėta besivystantis bakterijų atsparumo mechanizmas jiems. 1940 metais, likus keleriems metams iki plataus penicilino vartojimo terapiniais tikslais, bakterijose buvo aptiktas fermentas penicilinaze. Vos tik pradėjus vartoti šiuos antibiotikus, iškarto išplito bakterijos, galinčios penicilinazės pagalba juos inaktyvuoti. [26,27]

Antibiotikų eros pradžioje, tiek visuomenėje, tiek moksle, nebuvo pakankamai žinių dėl saugaus ir racionalaus antibiotikų vartojimo, taip pat tinkamo gydymo laiko ar vaisto dozės. Visa tai sakatino atsparių mikroorganizmų plitimą. Žmonės nesuprato savo klaidos ir rezistentiškumo problemą bandė spręsti sintetindami naujas antibiotikų rūšis. Nuo 1960 iki 1980 farmacijos industrija sukūrė daugybę naujų antibiotikų rūšių, kas leido efektyviai kovoti su bakterijomis bei jų atsparumu, tačiau veliau iki pat šių dienų naujai atrastų antibiotikų kiekis smarkiai sumažėjo. Dėl šios priežasties bakterinės infekcijos vėl tampa didžiule grėsme. Dauguma infekcines ligas sukeliančių antibiotikų jau šiuo metu turi įgytą atsparumą rinkoje esantiems preparatams, pasaulyje nuo infekcinių ligų kismet miršta apie 11 milijonų žmonių. Šie skaičiai šokiruoja, tačiau įrodo, jog nesiimant tinkamų priemonių žmonės ir toliau neracionaliai besigydydami bakterines infekcijas nepasieks laukiamo terapinio efekto. [5,28,29]

23 1.5.1 Pagrindinės rezistentiškumo antibiotikams plitimo priežastys

• Per didelis vartojimas. Jau 1945 metais A.Flemingas stengėsi ispėti visuomenę dėl per didelio antimikrobinių preparatų vartojimo. Epidemiologiniais tyrimais buvo įrodyta tiesioginis ryšys tarp antibiotikų vartojimo ir bakterijų atsparumo jiems besivystymo. Bakterijos genus gali ne tik paveldėti, bet ir įgauti per plazmides iš kitų bakterijų. Dėl to atsparumą antibiotikams suteikiantys genai gali būti pernešami tarp įvairių bakterijų rūšių. Neracionaliai vartojami antibiotikai sunaikina jiems neatsparius mikroorganizmus, tačiau palieka rezistentiškas, kurios toliau perduoda atsparumo gena kitoms bakterijoms. [5,30,31]

• Netinkamas gydymas antibiotikais. Neracionalus šių vaistų paskyrimas didina rizika išsivystyt atspariems mikroorganizmams tiek pat, kiek ir per didelis jų vartojimas. Šiuo atveju veikia analogiškas mechanizmas, neatsparios bakterijos būna sunaikinamos, o atsparios toliau platina rezistentiškumą suteikiantį gena. Pagal JAV atliktą tyrimą, tik 7,6% iš 17435 pacientų sirgusių visuomenėje įgyta pneumonija, buvo tinkamai nustatytas ligos sukėlėjas. [5,30,31]

• Per didelis vartojimas agrikultūroje. Tiek išsivysčiusiusiose tiek besivystančiose šalyse antibiotikai labai plačiai vartojami kaip augimo papildai gyvuliams. Toks antibiotikų vartojimas ne tik skatina rezistentiškų jiems bakterijų atsiradimą, bet ir platinimą. Prieš daugiau nei 35 metus buvo atliktas tyrimas, kurio metu nustatyta padidėjęs rezistentiškų bakterijų kiekis tiek fermų gyvulių, tiek tų pačių fermerių organizmuose. [5,30,31]

Taigi, mikrobų atsparumas antibiotikams yra pasaulinio mąsto problema, kurią pripažįsta įvairios pasaulinės organizacijos. Kolkas Lietuvoje nėra sukurtos valstybinės antibiotikų vartojimo politikos, kartais pacientams antibiotikai būna prieinami net ir be recepto. Sugriežtinus gydymo šiais vaistais taisykles, būtų galima tikėtis pasiekti didesnio antibiotikų veiksmingumo. [27]

24

1.6 Analizės metodų apžvalga

1.6.1 Chromatografija

Chromatografija, tai fizikinės-cheminės analizės metodas, leidžiantis tyrimų objektą išskirstyti į atskirus komponentus. Analizės metu, tiriamojo objekto komponentai pasiskirsto tarp judrios ir nejudrios fazių. Po atskyrimo galima nustatyti komponentų kokybines bei kiekybines charakteristikas. Chromatografijos metu skirstymas vyksta moliakuliniame lygmenyje. Šio metodo metu gali buti atskiriami jonai, makromolekulės ir mažamoliakuliniai junginiai. Dažniausiai chromatografija klasifikuojama pagal judrios fazės agregatinį buvį į dujų, skysčių ir superkritinių skysčių chromatografijas. Pagal chromatografinio sluoksnio formą, galima išskirti kolonėlinę bei plokštuminę chromatografijos rūšis. Taip pat pagal skirstymo mechanizmą chromatografija klasifikuojama į adsorbcinę, paskirstomąją, jonų mainų, dydžio išskirstymo (gelchromatografiją), afininę, eliucijos bei frontalinę chromatografijas. [32,33]

1970 metais buvo pirmą kartą paminėta ir pristatyta efektyvioji skysčių chromatografija – HPLC (angl. high- performance liquid chromatography).[32,33] Ši chromatografijos rūšis yra daug efektyvesnė, greitesnė bei jautresnė už klasikinę skysčių chromatografiją. Skysčių chromatografijoje naudojamos kolonėlės yra 1-1,5 cm skersmens, įkrovos granulių dydis 30-150µm, o judrios fazės greitis gan mažas. Efektyviosios skysčių chromatografijos kolonėlių skersmuo yra daug mažesnis – 2-4,6mm bei jos yra pakrautos granulių, kurių dydis dažniausiai yra 3-5µm. Klasikinėje skysčių chromatografijoje eliuento tekmei generuoti naudojamas hidrostatinis slėgis, arba naudojant sriublį, kuriuo sukuriamas iki 0.2Mpa slėgis, o ESC slėgis siekia 40-50Mpa. Analizė ESC dažniausiai trunka 10-30min, o efektyvumas yra maždaug 100 kartų didesnis nei klasikinės kolonėlinės chromatografijos.[32,33,34]

1.7 Efektyviosios skysčių chromatografijos analizės metodikos

Moksliniuose literatūros šaltiniuose pateikiami ESC analizės metodai, kurie taikomi vertinant šių atsikrų cheminių medžiagų identifikavimą bei kiekybę biologiniuose skysčiuose.

25 1.7.1 ESC analizės metodikos betalaktaminiams antibiotikams

• Kolonėlė: Atlantis T3 ( 150,0 X 4,6mm, 5µm);

• Mobili fazė: 10mM fosforo r. tirpalas parūgštintas iki 2pH su druskos rūgštimi ir acetonitrilas; • Analizės temperatūra: 25o_C;

• Tekėjimo greitis: 1ml/min;

• Detektorius: UV6000LP UV mikrospindulių spektrofotometrinis detektorius; • Meropenemo sulaikymo trukmė: 4,8min., standartinė kreivė: nuo 2 iki 250µg/ml • Ceftazidimo sulaikymo trukmė: 4,2min., standartinė kreivė nuo 2 iki 250µg/ml

• Piperacilino sulaikymo trukmė: 12,8min., standartinė kreivė nuo 5 iki 250µg/ml [34,35]

2. Eksperimentinė dalis

2.1 Tyrimo objektas

Standartiniai ceftazidimo, meropenemo ir piperacilino tirpalai bei pacientų, vartojusių minėtuosius antibiotikus, kraujo plazmos mėginiai.

2.2 Naudoti reagentai ir aparatūra

Standartiniams tirpalams paruošti buvo naudojama:

• Ceftazidime Kabi 500mg milteliai injekciniam tirpalui. • Meropenem Kabi 500mg milteliai injekciniam tirpalui.

• Piperacilino natris 1g. – „Sigma-Aldrich Chemie GmbH“ (Vokietija).

• Išgrynintas dejonizuotas vanduo ruošiamas „Millipore“ (JAV) vandens valymo sistema.

Standartinių tirpalų bei tyrimo objektų analizei atlikti buvo naudojama:

• Fosforo rūgštis (99,99%) – „Sigma-Aldrich Chemie GmbH“ (Vokietija). • Druskos rūgštis (37,0%) – „Sigma-Aldrich Chemie GmbH“ (Vokietija). • Acetonitrilas( >99,9%) – „Sigma-Aldrich Chemie GmbH“ (Vokietija).

26 Reagentams atsverti buvo naudojamos elektroninės svarstyklės „Shimadzu AUW120D“ („SHIMADZU EUROPA GmbH“, Vokietija). Kraujo mėginių centrifugavimas atliktas „Centurion Scientific C2006“ („Centurion Scientific Ltd“, Jungtinė Karalystė) centrifuga. Vanduo tyrimams išvalytas „Millipore“ (JAV) vandens valymo sistema. Antibiotikų analizei atlikti buvo naudojamas chromatografo „Waters 2695“ atskyrimo modelis su UV-matomos šviesos tipo detektorium „Waters UV/VIS 2487“ („Waters“, JAV). Naudota chromatografinė ACE C18 (250 x 4,6 mm) kolonėlė, kurios sorbento dalelių dydis 5μm. Chromatogramos užrašytos ir duomenys apdoroti „Empower 2 Chromatography Data Software“ programa („Waters“, JAV).

2.3 Tyrimo metodai

2.3.1. Standartinių tirpalų, tiriamųjų mėginių ir eliuento paruošimas

Standartiniai ceftazidimo, meropenemo ir piperacilino tirpalai buvo paruošti iš atitinkamų antibiotikų. Analitinėmis svarstyklėmis buvo atsverta 10mg (tikslus svoris) ceftazidimo ir tirpinama 10ml išgryninto vandens. Analogiškai ruošiamas ir meropenemo bei piperacilino 1mg/ml tirpalai. Kalibracijos kreivėms nubraižyti buvo pagaminta skirtingų koncentracijų (nuo 0,01mg/ml iki 0,3mg/ml) antibiotikų tirpalai. [34]

Tiriamiesiems tirpalams paruošti buvo panaudotas žmogaus kraujas, paimtas iš Kauno Klinikų, Nefrologijos skyriaus pacientų. Kraujo mėginiai buvo pergabenti “BD Vacutainer™” mėgintuvėliais ir iškarto centrifūguojami 10 minučių 3000 apsisukimų per minutę greičiu. Po to atskirta plazma buvo ekstrahuojama. Ekstrakcijai atlikti buvo paimta 200µl distiliuoto vandens bei 700µl acetonitrilo įpilta į 100µl tiriamos kraujo plazmos. Kalibracijos kreivems buvo paimta po 100µl kiekvienos paruoštos koncentracijos tirpalo ir sumaišyta su 100µl distiliuoto vandens, 700µl acetonitrilo bei 100µl tuščios plazmos. Tada kiekvienas mėginys buvo vėl nucentrifūguotas dešimt minučiu, 3000 apsisukimų per minutę greičiu. Nucentrifūgavus, buvo paimta po 100µl kiekvieno mėginio ir atskiesta 900µl distiliuoto vandens. Iš gauto tirpalo buvo paimtas 20µl mėginys ir nufiltravus 22µm pločio filtru, panaudotas chromatografijai. [34]

27 Eliuento paruošimas: Į 1l distiliuoto vandens buvo įpilta 9,8ml fosforo rūgšties ir išmaišyta. Tada buvo lašinama koncentruota druskos rūgštis iki tol, kol tirpalo pH pasiekė 2. [34]

2.3.2 Chromatografijos sąlygos

• Injekcijos tūris – 10,00µl. • Temperatūra - 25o_C;

• Tekėjimo greitis – 1ml/min;

• Kolonėlė - ACE C18 (250 x 4,6 mm), kurios sorbento dalelių dydis 5μm.

• Detektorius - „Waters UV/VIS 2487“. UV bangos igiai: 210nm (piperacilinui), 257nm (ceftazidimui), 310nm (meropenemui).

• Eliuentas - 10mM fosforo r. tirpalas parūgštintas iki 2pH su druskos rūgštimi.

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1 ESC metodo pritaikymas

Beta laktaminių antibiotikų kokybiniams ir kiekybiniams parametrams įvertinti buvo pasirinktas tyrimo metodas – efektyvioji skysčių chromatografija (ESC), kurį 2011 metais aprašė M.C Verdier, O. Tribut, P. Tattevin, Y. Le Tulzo, C. Michlet ir D. B. Ferrer savo publikacijoje

“Simultaneous Determination of 12 β-Lactam Antibiotics in Human Plasma by High-Perofrmance Liquid Chromatography with UV Detection: Application to Therapeutic Drug Monitoring”.[34] Jis buvo pritaikytas beta laktaminių antibiotikų kokybinių ir kiekybinių parametrų nustatymui bei atlikimui su turima labaratorine įranga.

Metodui atlikti buvo parinkta chromatografinė kolonėlė - ACE C18 (250 x 4,6 mm), kurios sorbento dalelių dydis 5μm. ir atitinkamai pagal slėgį parinktas tinkamas judriosios fazės tekmės greitis, kad tiriamieji junginiai atsiskirtų geriausiai, bei prailgintas chromatografijos laikas iki 36 minučių. Taip pat, metodo atlikimui atsisakyta kietafazės ekstrakcijos.

Pasirinktos metodikos tinkamumo pagrindimui buvo įvertinti šie validacijos parametrai: specifiškumas, glaudumas ir tiesiškumas bei aptikimo ir nustatymo ribos . [35,38]

28

3.2 Efektyviosios skysčių chromatografijos validacija ceftazidimo, meropenemo bei

piperacilino tyrimui

Tiriant antibiotikų standartinius tirpalus, mėginius pagamintus iš kraujo, būtina įrodyti pasirinkto analizės metodo tinkamumą, todėl yra atliekama ESC validacija. Remiantis Tarptautinė harmonizcijos konferencijos analitinių procedūrų validacijos gairėmis buvo pasirinkti ir įvertinti šie paramentrai: specifiškumas, rezultatų glaudumas (pakartojamumas ir tarpinis preciziškumas), tiesiškumas ir aptikimo bei nustatymo ribos. [37,38]

3.2.1 Metodo specifiškumas

Specifiškumas yra metodo geba nustatyti ieškomą analitę mėginyje esant ir kitiems junginiams - įvairioms priemaišoms, degradacijos produktams. Tai gebėjimas atskirti analites nuo kitų į analitę panašių ar analizei trukdančių junginių. Šis validacijos parametras yra svarbiausias, nes jei metodas yra nespecifiškas, tuomet kiti validacijos parametrai netenka prasmės. [39] Siekiant įvertinti specifiškumą, buvo lyginamos standartinio tirpalo ir tiriamųjų tirpalų chromatogramos, sulaikymo laikai. Ceftazidimo, meropenemo ir piperacilino standartinio tirpalo sulaikymo laikai yra 6,450 min., 7,788 min. ir 20,740 min. atitinkamai, tiriamuose kraujo mėginiuose buvo identifikuotas meropenemas ir piperacilinas.

29 6 pav. Meropenemo standartinio vandeninio tirpalo chromatograma, tR = 7,788 min

Tyrimo metu keturiuose žmogaus kraujo plazmos mėginiuose esančio meropenemo sulaikymo laikų (Rt) vidurkis – 7,712 min. buvo artimas standartinio tirpalo sulaikymo laikui ( Rt = 7,788min).

7 pav. Piperacilino standartinio vandeninio tirpalo chromatograma, tR = 20,740 min

Tyrimo metu aštuoniuose žmogaus kraujo plazmos mėginiuose esančio piperacilino sulaikymo laikų (Rt) vidurkis – 20,783 min. buvo artimas standartinio tirpalo sulaikymo laikui ( Rt = 20,740min).

30 Iš pateiktų chromatogramų (8-10 pav.) matyri, kad tiek “tuščia” kraujo plazma, tiek distiliuotas vanduo tiriamuosiuose spektruose nesukelia atsako, todėl jie neturi įtakos analizuojamųjų antibiotikų nustatymui. Visa tai patvirtina pasirinkto metodo specifiškumą.

8 pav. A) kraujo plazmos chromatograma, B) distiliuoto vandens chromatograma, C) ceftazidimo chromatograma (tR = 6,450min)

9 pav. A) kraujo plazmos chromatograma, B) distiliuoto vandens chromatograma, C) meropenemo chromatograma (tR = 7,788 min)

31 10 pav. A) kraujo plazmos chromatograma, B) Piperacilino chromatograma (tR = 20,740 min),

C) distiliuoto vandens chromatograma

3.2.2 Rezultatų glaudumas

Metodikos rezultatų glaudumas nustatomas atlikus matavimų seriją naudojant tą patį

tiriamą mėginį. Vertinant glaudumą analitinės procedūros paprastai išreiškiamos standartiniu nuokrypiu arba variacijos koeficientu iš eilės matavimų. Metodikos glaudumas įvertinamas pakartojamumu ir tarpiniu preciziškumu.

Pagal dominančių smailių sulaikymo laikų vidurkius ir standartinį nuokrypį skaičiuojamas santykinis standartinis nuokrypis SSN proc. (standartinio nuokrypio ir vidurkio reikšmės santykis), kitaip variacijos koeficientas. Tinkamumo kriterijus yra variacijos koeficientas, kuris nėra tiksliai apibrėžtas, tačiau kiekybiniam metodui negali viršyti 5 proc.

32 3.2.2.1. Pakartojamumas

Pakartojamumas parodo metodo tikslumą tomis pačiomis veikimo sąlygomis per trumpą laiko tarpą. Jis skaičiuojamas iš tą pačią dieną viena po kitos atliktų chromatogramų rezultatų. Tyrimo metu pakartojamumas sulaikymo laikui ir buvo apskaičiuotas iš šešių analizės pakartojimų tą pačią dieną naudojant 100 proc. tiriamąjį tirpalą. Tinkamumo kriterijus yra variacijos koeficientas, kuris nėra tiksliai apibrėžtas, tačiau kiekybiniam metodui neturėtų viršyti 5 proc. Gauti rezultatai pateikiami 1 lentelėje.

3.2.2.2. Tarpinis preciziškumas

Tarpinis preciziškumas parodo rezultatų tikslumą, atliekant tyrimą skirtingomis dienomis (nebūtinai iš eilės), tomis pačiomis sąlygomis. . Tinkamumo kriterijus yra variacijos koeficientas, kuris nėra tiksliai apibrėžtas, tačiau kiekybiniam metodui neturėtų viršyti 10 proc. Tarpiniam preciziškumui sulaikymo laikui įvertinti buvo atlikta 12 vieno ir to paties mėginio injekcijų: per 2 skirtingas dienas atlikta po 6 pakartotines injekcijas. Gauti rezultatai pateikiami 1 lentelėje.

1 lentelė. Rezultatų glaudumo įvertinimas

Tiriamas preparatas Pakartojamumas Tarpinis

preciziškumas SSN sulaikymo laikui

Ceftazidimas 0,25% 0,31%

Meropenemas 0,09% 0,1%

Piperacilinas 0,04% 0.05%

Antibiotikų pakartojamumo SSN proc. sulaikymo laikui buvo mažiau nei 0,1 proc., išskyrus ceftazidimo – 0,25 proc. Ceftazidimo, meropenemo ir piperacilino tarpinio preciziskumo SSN proc. sulaikymo laikui buvo atitinkamai 0,31, 0,1 ir 0,05 proc.

Apibendrinat rezultatus reikia pažymėti, kad visų tiriamųjų antibiotikų pakartojamumo bei tarpinio preciziškumo SSN proc. sulaikymo laikui neviršija rekomenduojamų 5 ir 10proc., taigi rezultatų pakartojamumas atitinka keliamus reikalavimus ir remiantis šiuo kriteriju, metodas yra tinkamas kiekybiniam tirpalų tyrimui.

33 3.2.3 Tiesiškumas

Tiesiškumas – tai gebėjimas gauti detektoriaus atsako įverčius chromatogramose, kurie tiesiogiai proporcingi analitės kiekinei koncentracijai mėginyje. Beta laktaminių antibiotikų tiesiškumas buvo vertintas nustatinėjant koncentracijas standartinių tirpalų intervale nuo 0,01mg/ml iki 0,3mg/ml. Įvertinama kalibravimo kreivės metodu. Kartu buvo nustatomas ir koreliacijos koeficientas (R2 _{), kuris}

turi būti ne mažesnis kaip 0,990.

Tiesiškumui ir riboms įvertinti buvo analizuoti standartiniai tirpalai, kuriuose ištirpintų antibiotikų kiekis sudarė: 1 proc., 2 proc., 2,5 proc., 5 proc. 10 proc., 20 proc., 25 proc. ir 30 proc. Pagal juos buvo sudaryti kalibraciniai grafikai ceftazidimui, meropenemui ir piperacilinui. Gauti rezultatai pateikiami 11 – 13 pav [37,38]

11 pav. Ceftazidimo kalibracinė kreivė, y=1,62*104_{x – 7,78*10}3_{, R}2 _{= 0.999}

Iš gauto ceftazidimo kalibracinio grafiko matyti, kad smailės ploto priklausomybė nuo koncentracijos yra tiesiška analizuotame koncentracijų intervale. Koreliacijos koeficiento R2 _{vertė yra}

34 12 pav. Meropenemo kalibracinė kreivė, y=7,6*103_{x – 3,55*10}2_{, R}2 _{= 0,998}

Iš gauto meropenemo kalibracinio grafiko matyti, kad smailės ploto priklausomybė nuo koncentracijos yra tiesiška analizuotame koncentracijų intervale. Koreliacijos koeficiento R2 _{vertė yra}

didesne nei 0,990, kas rodo stiprią tiesinę priklausomybę.

13 pav. Piperacilino kalibracinė kreivė, y=9,61*103_{x + 9,28*10}3_{, R}2 _=0,996

Iš gauto piperacilino kalibracinio grafiko matyti, kad smailės ploto priklausomybė nuo koncentracijos yra tiesiška analizuotame koncentracijų intervale. Koreliacijos koeficiento R2 _{vertė yra}

35 2 lentelė. Kalibracinių kreivių charakteristikos

Tiriamoji medžiaga Sulaikymo trukmė

tR, min. Koreliacijos koeficientas R2 Regresijos lygtis Ceftazidimas 6,450 0.999 y=1,62*104x – 7,78*103 Piperacilinas 20,740 0,996 y=9,61*103_{x + 9,28*10}3 Meropenemas 7,788 0,998 y=7,6*103x – 3,55*102

Meropenemo, ceftazidimo ir piperacilino kalibraciniai grafikai nubrėžti nuo 0,01 iki 0,3mg/ml koncentracijos. Nustatyti grafikų išbarstymo koeficientai, atitinkamai 0,998, 0996 ir 0,998 (2 lentelė), kurie atitinka keliamus reikalavimus >0,99.[37] Tai įrodo analitinio metodo tiesiškumą tiriant pasirinktus mėginius.

3.2.4 Aptikimo ir nustatymo ribos

Aptikimo riba (angl. LoD – limit of detection) – tai mažiausias analitės kiekis mėginyje, kuris gali būti aptinkamas, tačiau nebūtinai nustatomas kiekybiškai. Nustatymo riba (angl. LoQ – limit of quantification) – tai mažiausias analitės kiekis, kuris gali būti kiekybiškai nustatomas tinkamo tikslumo ribose. Vienas iš bū dų apskaičiuoti aptikimo ir nustatymo ribas yra šių ribų nustatymas naudojant signalo ir bazinės linijos triukšmo santykį S/N (angl. signal to noise ratio). Rementis Tarptautinė harmonizcijos konferencijos reikalavimais aptikimo riba nustatoma, kai smailės aukščio ir bazinės linijos triukšmo santykis yra 3:1, o nustatymo riba vertinama, kai smailės aukščio ir bazinės linijos triukšmo santykis yra 10:1. Šis metodas yra taikomas analitinėms procedūroms, kurių metu pasireiškia bazinės linijos triukšmas. Šio tyimo metu buvo nustatytos beta laktaminių antibiotikų aptikimo ir nustatymo ribos, kurios pateiktos 3 lentelėje.

36 3 lentelė. Aptikimo ir nustatymo ribos

Aptikimo riba(µg/ml) Nustatymo riba(µg/ml)

Meropenemas 0,048 0,16

Piperacilinas 2,2 7,0

Ceftazidimas 0,024 0,079

Remiantis visai aptartais validacijos kriterijais ir jų įvertinimo rezultatais, daroma išvada, kad optimizuotas ESC metodas yra tinkamas gatavos produkcijos kiekybiniam tyrimui. Remiantis šiuo metodu galima atlikti eksperimentinių kapsulių stabilumo tyrimus.

3.3 ESC taikymas beta laktaminių antibiotikų identifikavimui

Atlikus ESC metodikos validaciją, tiriant pasirinktų medžiagų standartinius tirpalus, galima identifikuoti beta laktaminius antibiotikus žmogaus kraujo plazmoje. Atlikus tiriamųjų mėginių analizę, buvo vertinamos ir lyginamos sulaikymo trukmės. Pateikiama meropenemą vartojusio paciento kraujo plazmos meginio chromatograma (14 pav.) ir keturių tirtųjų pacientu kraujo plazmos mėginių sulaikymo laikai (4 lentelė).

37 4 lentelė. Tiriamuose mėginiuose esančio meropenemo sulaikymo laikai.

Sulaikymo laikas min. Mėginio nr. 1 7,783 2 7,771 3 7,636 4 7,658 Vidurkis 7,712

Ištyrus aštuonių piperaciliną vartojusių pacientų kraujo plazmos mėginius, visuose buvo identifikuotas atitinkamas antibiotikas, atsižvelgiant į standartinio piperacilino tirpalo sulaikymo laiką. Pateikiama preparatą vartojusio paciento kraujo plazmos meginio chromatograma (15 pav.) ir aštuonių tirtųjų kraujo plazmos mėginių sulaikymo laikai (5 lentelė).

38 5 lentelė. Tiriamuose mėginiuose esančio piperacilino sulaikymo laikai.

Sulaikymo laikas min. Mėginio nr.

1

20,782

2

20,744

3

20,862

4

20,789

5

20,746

6

20,776

7

20,782

8

20.788

Vidurkis

20,783

3.4 ESC taikymas antibiotikų kiekybiniam nustatymui

3.4.1 Antibiotikų tirpalų paruošimas kalibracinėms kreivėms sudaryti

Kraujo plazmoje esančių antibiotikų kiekiui nustatyti pasirinktas gradavimo grafiko metodas. Atsverta 10 mg meropenemo (tikslus svėrinys) ir ištirpinta 10 ml išgryninto vandens (pradinis tirpalas). Analogiškai buvo pagaminta ir kitų tirtųjų antibiotikų (ceftazidimo bei piperacilino) pradiniai tirpalai. Kalibracinei kreivei sudaryti atlikti šių tirpalų skiedimai (6 lentelė).

6 lentelė. Kalibracinės kreivės tirpalų koncentracijos

Meropenemas Ceftazidimas Piperacilinas

Tirpalas A (mg/ml) 0,01 0,01 0,01 Tirpalas B (mg/ml) 0,02 0,02 0,02 Tirpalas C (mg/ml) 0,05 0,05 0,05 Tirpalas D (mg/ml) 0,1 0,1 0,1 Tirpalas E (mg/ml) 0,2 0,2 0,2 Tirpalas F (mg/ml) 0,25 0,25 0,25 Tirpalas G (mg/ml) 0,3 0,3 0,3

39 3.4.2 Antibiotikų kiekio nustatymas žmogaus kraujo plazmoje

Atlikus kiekybinę meropenemo analizę, buvo aptikta 74,767 µg/ml (tR = 7,636) ir 71,891 µg/ml (tR = 7,658) preparato žmogaus kraujo plazmoje, kuri buvo paimta 5min. po antibiotiko suleidimo. Kraujo plazmos mėginyje, paimtame 15 minučių po meropenemo injekcijos buvo rasta

45,758 µg/ml (tR = 7,783) ir 44,212 µg/ml (tR = 7,771) antibiotiko (5 lentelė).

7 lentelė. Meropenemo koncentracija kraujo plazmos mėginiuose.

Meropenemas (µg/ml) Mėginio Nr. Po 5min. 1 74,767 2 71,891 Po 15min. 3 45,758 4 44,212

Analogiškai atlikus piperacilino kiekybinę analizę, keturiuose mėginiuose, kurie buvo paimti pradėjus antibiotiko infuziją, atitinkamai rasta 7,444µg/ml (tR = 20,782) ir 15,157µg/ml (tR = 20,744), 36,589µg/ml (Rt = 20,862) ir 59,963µg/ml (Rt = 20,789) minėto preparato. Po 15min. nuo infuzijos pradžios paimtuose mėginiuose buvo rasta 323,242µg/ml (tR = 20,746), 301,252µg/ml (tR = 20,776), 270,878µg/ml (Rt = 270,782) ir 400,143µg/ml (Rt = 20,788) (8 lentelė).

8 lentelė. Piperacilino koncentracija kraujo plazmos mėginiuose.

Piperacilinas (µg/ml)

Mėginio Nr.

Pradėjus infuziją

1 7,444

40 3 36,589 4 59,963 Po 15min. 5 301,252 6 323,242 7 270,878 8 400,143

3.5 Rezultatų apibendrinimas

Atlikus literatūros apžvalgą buvo pasirinkta ir pakoreguota efektyviosios skysčių

chromatografijos metodika kokybiniam ir kiekybiniam beta laktaminių antibiotikų nustatymui žmogaus kraujo plazmoje.

Metodui atlikti buvo parinkta chromatografinė kolonėlė - ACE C18 (250 x 4,6 mm), kurios sorbento dalelių dydis 5μm. ir atitinkamai pagal slėgį parinktas tinkamas judriosios fazės tekmės greitis, kad tiriamieji junginiai atsiskirtų geriausiai, bei prailgintas chromatografijos laikas iki 36 minučių. Taip pat, metodo atlikimui atsisakyta kietafazės ekstrakcijos.

Pasirinktos metodikos tinkamumo pagrindimui buvo įvertinti šie validacijos parametrai: specifiškumas, glaudumas ir tiesiškumas bei aptikimo ir nustatymo ribos. Remiantis gautais duomenimis galima teigti, kad ši metodika tinkama atliekant kiekybinį beta laktaminių antibiotikų nustatymą žmogaus kraujo plazmos mėginiuose.

Atlikus kiekybinį meropenemo ir piperacilino nustatymą tirtuose mėginiuose buvo nustatyti esantys antibiotikų kiekiai:

• kraujo mėginiuose, paimtuose iškart po injekcijos meropenemo koncentracija įvairavo tarp 71,891µg/ml ir 74,767µg/ml, o po 15min. tarp 45,758µg/ml ir 44,212µg/ml.

• kraujo mėginiuose, paimtuose 5 minutės po infuzijos pradžios piperacilino koncentracija svyravo tarp 7,444µg/ml ir 59,963.µg/ml, o po 15 minučių tarp 301,252µg/ml ir 400,143µg/ml.

41

IŠVADOS

1) Naudota metodika yra nesudėtinga ir paprastai pritaikoma beta laktaminių antibiotikų kiekybinei ir kokybinei analizei žmogaus kraujo plazmos mėginiuose.

2) Ištyrus pacientų, vartojusių beta laktaminius antibiotikus kraujo plazmą, atitinkami junginiai buvo idefikuoti pagal jų standartinių tirpalų sulaikymo laikus. Įvertinus kiekybinius parametrus ir atsižvelgus į kraujo mėginio paėmimo laiką, buvo nustatyta, kad meropenemo koncentracija pastebimai sumažėjo lyginant su kraujo mėginiais, paimtais iš karto po injekcijos bei po 15 minučių. Kraujo mėginiuose, paimtuose iškart po injekcijos, meropenemo koncentracija įvairavo tarp 71,891µg/ml ir 74,767µg/ml, o po 15min., tarp 45,758µg/ml ir 44,212µg/ml. Analogiškai buvo įvertinti kraujo plazmos mėginiai su piperacilinu ir nustatytas antibiotiko koncentracijos padidėjimas lyginant paimtus 5 minutės po infuzijos pradžios mėginius su paimtais po 15 minučių. Kraujo mėginiuose, paimtuose 5 minutės po infuzijos pradžios antibiotiko koncentracija svyravo tarp

7,444µg/ml ir 59,963.µg/ml, o po 15 minučių tarp 301,252µg/ml ir 400,143µg/ml.

3) Validacijos eksperimentų metu pagrįstas metodikos specifiškumas, glaudumas ir tiesiškumas bei aptikimo ir nustatymo ribos. Glaudumas įvertintas pakartojamumu ir tarpiniu preciziškumu. Pakartojamumo SSN proc. tiriamųjų komponentų sulaikymo laikui įvairavo nuo 0,04 proc. iki 0,25 proc. Tarpinio preciziškumo SSN proc. tiriamųjų komponentų sulaikymo laikas buvo nuo 0,05 proc iki 0,31 proc. Tiesiškumas ir ribos įvertintas remiantis koreliacijos koeficientu (R2_{). Tiriamiesiems}

antibiotikams nustatytas koreliacijos koeficientas, kuris įvairavo nuo 0,996 iki 0,999, aptikimo ribos nuo 0,024µg/ml iki 2,2µg/ml bei nustatymo ribos nuo 0,079µg/ml iki 7,0µg/ml.

42

PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS

Remiantis Tarptautinės harmonizacijos konferencijos reikalavimų gairėmis buvo validuotas bei pritaikytas ESC metodas. Šiuo metodu buvo ištirti šie antibiotikai: meropenemas, ceftazidimas ir piperacilinas bei pacientų vartojusių meropenemą ir piperaciliną kraujo plazmos mėginiai.

Kokybinės bei kiekybinės antibiotikų analizės metodas gali būti pritaikomas ir kitų beta laktaminių antibiotikų analizei žmogaus kraujo plazmos mėginiuose.

43

LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. K. Dubickaitė, I. Merkytė, E. Pavydė, A. Sveikata. Antibiotikų vartojimo viršutinių kvėpavimo takų infekcijų gydymui ypatumai visuomenės žinių ir savigydos įvertinimas. Visuomenės sveikata. 2016, 26 tomas, Nr. 2, p. 15-19.

2. P.Sambon, E.Amandine, V.Sharat, X.Stephenne, F.Smets, I.Scheers, M.Komuta, P.Cani, E.Sokal. THU-219 - Sustained biochemical response to oral antibiotics in pediatric PSC and ASC are correlated to changes in gut microbiota during therapy. Journal of Hepatology. Volume 68, Supplement 1, April 2018, Pages S226-S227

3. A. Abasaeed, J. Vlcek, M. Abuelkhair, A. Kubena. Self-medication with antibiotics by the community of Abu Dhabi Emirate, United Arab Emirates. J Infect Dev Ctries 2009; 3(7): 491-497.

4. S. Bin Zaman, Muhammed Awlad Hussain, Rachel Nye, Varshil Mehta, Kazi Taib Mamun, Naznin Hossain. A Review on Antibiotic Resistance: Alarm Bells are Ringing. Cureus. 201; 9(6): e1403

5. C. Lee Ventola. The Antibiotic Resistance Crisis. Pharmacy and Therapeutics. 2015 Apr; 40(4): 277–283

6. Kok-Fai Kong, Lisa Schneper, .Kalai Mathee. Beta-lactam Antibiotics: From Antibiosis to Resistance and Bacteriology. APMIS. 2010 Jan; 118(1): 1–36.

7. Thomas J. Dougherty, Michael J. Pucci. Antibiotic Discovery and Development. 2012; 79-119 8. A. Raugalė. Klinikinės pediatrijos farmakologija ir farmakoterapija. 2008; 460 – 531

9. Mohr KI. History of Antibiotics Research. Curr Top Microbiol Immunol. 2016;398:237-272. 10. Yazdankhah S, Lassen J, Midtvedt T, Solberg CO. The history of antibiotics. 2013; 133(23-24):

2502-7.

11. Kate Gould. Antibiotics: from prehistory to the present day. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, Volume 71, Issue 3, 2016; 572–575.

12. Demain AL1, Elander RP. The beta-lactam antibiotics: past, present, and future. Antonie Van Leeuwenhoek. 1999; 75(1-2): 5-19.

13. Percival KM. Antibiotic Classification and Indication Review for the Infusion Nurse. J Infus Nurs. 2017 Jan/Feb;40(1):55-63

14. Rustam I. Aminov. A Brief History of the Antibiotic Era: Lessons Learned and Challenges for the Future. Frontiers in Microbiology. 2010; 1: 134.

44 15. Beta-lactam. En.wikipedia.org. 2017 [žiūrėta 2017.10.13]. Internetinė prieiga:

https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/3/3b/Beta-lactam.svg/375px-Beta-lactam.svg.png

16. Gerald R. Donowitz, M.D., and Gerald L. Mandell, M.D. Beta-Lactam Antibiotics. N Engl J Med 1988; 318:490-500.

17. David J. Waxman and Jack L. Strominger. Penicillin-Binding Proteins and the Mechanism of Action of Beta-Lactam Antibiotics. Annual Review of Biochemistry Volume 52, 1983 Waxman, pp 825-869.

18. Suárez C1, Gudiol F. Beta-lactam antibiotics. Enferm Infecc Microbiol Clin. 2009; 27(2):116-29. 19. Meropenemo „Preparato charakteristikų santrauka“. [žiūrėta 2017-10-13]. Internetinė prieiga:

https://vapris.vvkt.lt/vvkt-web/public/medications

20. Meropenem. pubchem.ncbi.nlm.nih.gov 2017 [žiūrėta 2017.10.13]. Internetinė prieiga:

https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/image/imgsrv.fcgi?cid=441130&t=l

21. European Pharmacopoeia, 8 editon, 2014. p 2716-17, 1811-13, 3039-41.

22. Ceftazidime. pubchem.ncbi.nlm.nih.gov 2017 [žiūrėta 2017.10.13]. Internetinė prieiga:

https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/5481173#section=Top

23. Ceftazidimo „Preparato charakteristikų santrauka“ . [žiūrėta 2017-10-13]. Internetinė prieiga:

https://vapris.vvkt.lt/vvkt-web/public/medications

24. Piperacillin. pubchem.ncbi.nlm.nih.gov 2017 [žiūrėta 2017.10.14]. Internetinė prieiga:

https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/43672#section=Top

25. Piperacilino „Preparato charakteristikų santrauka“ . [žiūrėta 2017-10-14]. Internetinė prieiga:

https://vapris.vvkt.lt/vvkt-web/public/medications

26. Julian Davies, Dorothy Davies. Origins and Evolution of Antibiotic Resistance. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 2010 Sep; 74(3): 417–433.

27. R. Mačiulaitis, V. Petrikaitė, A. Aukštakalnienė, T. Janušonis. Antimikrobinių vaistų vartojimo įvertinimas ir palyginimas su jų racionalaus vartojimo rekomendacijomis. Medicina. 2006; 42(12), 999-1005.

28. Peter M Hawkey, Roderic E Warren, David M Livermore, Cliodna A M McNulty, David A Enoch, et al. Treatment of infections caused by multidrug-resistant Gram-negative bacteria: report of the British Society for Antimicrobial Chemotherapy/Healthcare Infection

Society/British Infection Association Joint Working Party. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, Volume 73, 2018; iii2–iii78.

45 29. Eili Y. Klein, Thomas P. Van Boeckel, Elena M. Martinez, Suraj Pant, Sumanth Gandra, et al.

Global increase and geographic convergence in antibiotic consumption between 2000 and 2015. PNAS, 2018; 3-5.

30. Worthington RJ1, Melander C. Overcoming resistance to β-lactam antibiotics. J Org Chem. 2013;78(9): 4207-13.

31. Jose M. Munita, Cesar A. Arias. Mechanisms of Antibiotic Resistance. Microbiol Spectr. 2016; 4(2): 10.1128/microbiolspec.VMBF-0016-2015.

32. A. Maruška, O. Kornyšova, E. Machtejevas. Efektyviosios skysčių chromatografijos pagrindai. Kaunas. 2005; 9-18.

33. S. Sasnauskienė, R. Firantienė, V. Jablonskienė. Chromatografijos metodai ir jų taikymas. Labaratorinė medicina. 2012; t. 14, Nr. 1(53), p. 33-39.

34. Marie-Clemence Verdier, Oliver Tribut, Pierr Tattevin, Yves Le Tulzo, Christian Michlet, Daniele Bentuc-Ferrer.Simultaneous Determination of 12 β-Lactam Antibiotics in Human Plasma by High-Perofrmance Liquid Chromatography with UV Detection: Application to Therapeutic Drug Monitoring. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2011; 4873-4879 35. Brett C. McWhinneya, Steven C. Wallis, Tara Hillister, Jason A. Roberts, Jeffrey Lipman,

Jacobus P.J. Ungerer. Analysis of 12 beta-lactam antibiotics in human plasma by HPLC with ultraviolet detection. Journal of Chromatography , 878. 2010; p. 2039–2043.

36. Ozlem Coskun. Separation techniques: Chromatography. North Clin Istanb. 2016; 3(2): 156– 160.

37. Shabir G.A. Validation of high-performance liquid chromatography methods for

pharmaceutical analysis Understanding the differences and similarities between validation requirements of the US Food and Drug Administration, the US Pharmacopeia and the International Conference on Harmonization. Journal of Chromatography 2003; 987:57-66 38. U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration. Guidance for

Industry QB2 Validation of Analytical Procedures: Methodology. 2001; 1-10. Internetinė prieiga:

http://www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/

UCM070107.pdf.

39. Gumustas M, Kurbanoglu S, Uslu B, Ozkan SA. UPLC versus HPLC on Drug Analysis: Advantageous, Applications and Their Validation Parameters. Chromatographia 2013;76:1365– 1427

46

PRIEDAI