SCOPO DELLA TESI
Lo scopo del presente lavoro è quello di effettuare una caratterizzazione di riarrangiamenti cromosomici mediante tecniche di citogenetica classica e di citogenetica molecolare ed effettuare una eventuale correlazione tra genotipo e fenotipo.
Abbiamo selezionato alcuni pazienti con riarrangiamenti genomici differenti che coinvolgono però la stessa regione del cromosoma 15 (15q11-q13). Prima di tutto è stato effettuato un attento studio di questa regione che risulta sottoposta ad imprinting e particolarmente complessa per la presenza di sequenze ripetute.
Il nostro primo obbiettivo è quello di analizzare i vari riarrangiamenti cromosomici e di caratterizzarli in maniera accurata, usando varie tecniche di citogenetica e genetica molecolare, come cariotipo, FISH, CGH Array, MS- MLPA e analisi dei microsatelliti del DNA.
Infine abbiamo confrontato il fenotipo dei casi da noi studiati con quello dei casi riportati in letteratura che presentano anomalie cromosomiche simili al fine di individuare una eventuale correlazione fenotipo-cariotipo.
2.1. Descrizione clinica dei pazienti studiati
CASO I
Il paziente è un bambino di 2 anni e 3 mesi nato da genitori sani non consanguinei. Durante il primo mese di vita nel bambino si riscontra un severo ritardo dello sviluppo psico-motorio.
Esso giunge alla nostra osservazione all‟età di 2 anni e 3 mesi per sospetti pregressi episodi compulsivi; presenta pannicolo adiposo scarso, addome meteorico, ampia chiazza acromica in sede inguinale destra; presenti lievi note dismorfiche (plagiocefalia, orbite infossate, impianto basso dei padiglioni auricolari, pectus excavatum), stereotipie (dondolamento antero-posteriore del tronco, iactatio capitis, parossismi di iperpnea) e tratti autistici nel comportamento; importante ipotonia assiale, stazione eretta possibile con appoggio; un forte ritardo nell‟acquisizione del linguaggio.
Gli esami ematici basali e le indagini neuro metaboliche eseguite risultano nella norma.
L'elettroencefalogramma (EEG) mostrava modeste anomalie in regioni centrotemporoposteriori.
La risonanza magnetica nucleare (RMN) presenta un aumento degli spazi liquorali pericerebrali soprattutto a livello frontale.
CASO II
Il paziente è una donna di 36 anni, nata da genitori sani non consanguinei. Il peso alla nascita era 2,870 g, lunghezza 50 cm, le tappe dello sviluppo sono risultati normali.
All'età di 12 anni ha presentato menarca seguito da mestruazioni regolari; ha avuto una normale gravidanza all'età di 27 anni e non segnala aborti spontanei. All‟età di 35 anni manifesta amenorrea asintomatica brusca. La signora non presenta
malformazioni o dismorfismi faciali. L‟ecografia pelvica non mostra particolari anomalie; viene però segnalata l'assenza di follicoli nelle ovaie. Il profilo ormonale era normale per FT3, FT4, TSH, prolattina, cortisolo, 17OHP, androstenedione e testosterone, LH e FSH erano nella gamma della menopausa (55,0 e 166,4 mU / mL, rispettivamente). Tali valori sono stati confermati successivamente nel corso di ulteriori accertamenti diagnostici.
CASO III
All‟esame obiettivo, la probanda presenta alcune note morfologiche della facies, in particolare: aspetto trigonocefalico della testa, narici lievemente anteverse, orecchie retroruotate, a basso impianto, con lobo piccolo, labbra carnose. Le mani presentano dita allungate e a livello dei piedi sono presenti primo dito ampio, sandal gap (aumentata distanza fra primo e secondo dito) e sindattilia parziale del secondo e terzo dito, bilateralmente. La paziente non presenta e non ha presentato ritardo psicomotorio; attualmente ha 34 anni è frequenta un corso universitario. Tutte queste caratteristiche non sono comunque indicative di sindromi genetiche specifiche.
2.2. Coltura di sangue periferico per preparati metafasici e profasici
Linfociti di sangue periferico eparinato vengono coltivati e processati seguendo le procedure standard normalmente utilizzate nel nostro laboratorio.
100ml di medium RPMI 1640 privo di L-glutammina (GIBCO) vengono supplementari con 25ml di siero bovino fetale (GIBCO), 1ml di L-glutammina
da Penicillina G sodica 1.000.000 U.I. (PHARMACIA) e Streptomicina solfato 1.000.000 U.I. (BRISTOL-MAYERS QUIBB), entrambe disponibili in forma liofilizzata e sciolte ciascuna in 5ml di acqua distillata (S.A.L.F).
A 0.5ml di sangue eparinato si aggiungono 9ml del terreno sopra descritto e agglutinina P (5mg/ml, DIFCO). La coltura è posta in un termostato a 37°C per 72h.
Per i preparati metafasici si allestisce una sola coltura, mentre per i preparati profasici ne allestiamo tre.
2.3. Processamento di sangue periferico per preparati metafisici
Dopo 72h si aggiungono due gocce di colcemid solution (10
di Hanks), si lascia incubare in termostato per 2h e si centrifuga quindi a 1200rcf per 10min.
Una volta eliminato il sopranatante si effettua uno shock ipotonico sospendendo il pellet con 10ml di KCl 0.075M (5.59gr/l) e si pone a incubare in termostato a 37°C per 10min. Al termine dell‟incubazione si aggiungono 0.5ml di fissativo di Carnoy (3:1=metanolo (J.T.BAKER):acido acetico(J.T.BAKER)) come prefissaggio. Successivamente si effettuano tre passaggi in fissativo allo scopo di eliminare eventuali residui citoplasmatici. A questo punto il pellet è sospeso sempre in fissativo e conservato a +4°C.
2.4. Processamento di sangue periferico per preparati profasici
Alle 16.30 del terzo giorno vengono aggiunti 0.8ml di soluzione di bromodeo
Dopo 17h, vengono eseguiti due lavaggi con medium RPMI 1640 addizionato
risospende il pellet, così ottenuto, in 9ml di medium RPMI 1640 (contenente
fitoemoagglutinina P (5mg/ml, DIFCO).
Dopo 5, 5.30, 6 ore, si aggiungono due gocce di colcemid solution
soluzione di Hanks) e le colture così trattate vengono lasciate in termostato a 37°C per 10min e successivamente centrifugate a 1200rcf per 10min. Una volta eliminato il sopranatante si procede come descritto nel processamento di preparati metafasici.
2.5. Stesura di metafasi su vetrino
Il preparato viene centrifugato a 1200rcf per 10min e una volta eliminato il sopranatante si aggiungono alcune gocce di fissativo di Carnoy (3:1=metanolo:acido acetico) per risospende il campione. Due o tre gocce si lasciano quindi cadere su un vetrino che viene poi fatto asciugare al vapore di un bagnetto termostato a 37°C. La qualità della stesura viene valutata ad un microscopio (LEITZ WETZLAR) a contrasto di fase che permette di osservare le metafasi presenti.
2.6. Bandeggio G
In 100ml di tampone fosfato pH=6.88 (tabella 2.4.) si diluisccono 5mg di tripsina (Trypsin 1:250 confezione 25g DIFCO) un enzima proteolitico che degrada le proteine associate al DNA. Il vetrino steso il giorno prima viene immerso in tale soluzione per 10-40sec (i tempi di immersione sono relativi alla qualità del preparato metafasico). Dopo essere stato sciacquato con acqua corrente il vetrino viene quindi colorato con Giemsa, un colorante chimico che si lega al DNA, (Giemsas-Losung, MERCK) sciolto allo 0.25% nel tampone fosfato per 5min. A questo punto i vetrini sono pronti per essere osservati con un microscopio LEIKA DMRBE.
2.7. Colorazione di preparati di cromosomi profasici
Il vetrino viene lasciato invecchiare per 72h, e quindi immerso in 2XSSC (Saline-Sodium Citrate) (tabella 2.4.) a temperatura ambiente per almeno 1h.
Si prepara una soluzione di HOECHST (Bisbenzimid 25mg/250ml di H2O) all‟1% in 2XSSC e vi si immerge il vetrino per 15min a temperatura ambiente in assenza di luce.
Successivamente si lava il vetrino con acqua corrente, si immerge in 2XSSC, e si espone quindi agli U.V. per 20-25min ad una distanza di 20cm. Infine si colora in Giemsa sciolto nel tampone fosfato al 10% per 8min.
2.9. Estrazione degli YAC
Le colonie di lieviti vengono strisciate su una piastra Petri contenente terreno AHC, supplementato di agar all‟1%, glucosio al 40%, adenina (2mg/ml) e ampicillina 2000X (tabella 2.2.) e fatte crescere in termostato a 30°C per 72h. Il terzo giorno si preleva dalla piastra una singola colonia di lievito e si mette a crescere in 10ml di terreno AHC supplementato di glucosio al 40%, adenina
(2mg/ml) e ampicillina 2000X (tabella 2.2.) in bagnetto termostato a 30°C in agitazione per 2 giorni.
Tabella 2.1. Terreno AHC per YAC
Per 1l di terreno
Yeast nitrogen base 1.7g
Ammonio solfato 5g
Casaminoacidi 10g
H2O 940ml
La crescita ottenuta viene sottoposta ad estrazione. Si centrifuga a 1000rcf per 5min, si elimina il sopranatante e si risospende il pellet in 0.5ml di soluzione YRB (Yeast Resuspension Buffer) (tabella 2.3.). Si aggiungono quindi 0.5ml dell‟enzima liticasi (10000U/ml) e si lascia ad incubare in bagnetto termostato a 37°C per 2h. Successivamente si centrifuga a 6000rcf per 5min e, dopo aver eliminato il sopranatante, si risospende il pellet in 0.5ml di TE pH=7.4 (tabella 2.3.).
Dopo l‟aggiunta di 50
2.3.) si effettua una incubazione in bagnetto a 65°C per 45min, segue quindi una precipitazione con 0.2ml di K-acetato (tabella 2.3.) in ghiaccio per 60min. Al sopranatante, ottenuto in seguito ad una centrifugazione a 13000rcf per 10min, viene aggiunto un ugual volume di isopropanolo (tabella 2.3.). Si lascia agire l‟isopropanolo per 5min a temperatura ambiente. Il pellet, che si è depositato in seguito ad una
ulteriore centrifugazione, viene risospeso in 0.3ml di TE pH=7.4 (tabella 2.3.) ed incubato in bagnetto termostato a 37°C per 30min dopo che vi sono stati aggiunti 2
Si procede aggiungendo 0.03ml di Na-acetato (tabella 2.3.), 0.3ml di isopropanolo (tabella 2.3.) e centrifugando a 12000rcf per 1min. Una volta eliminato il sopranatante si effettua un lavaggio in etanolo 70%
freddo. Al termine il pellet è risospeso in una quantità opportuna di TE pH=7.4.
La concentrazione del DNA estratto viene calcolata caricando su un gel
orange G e
2
2.8. Sonde utilizzate per l’ibridazione in situ a fluorescenza (FISH)
Per la caratterizzazione di riarrangiamenti cromosomici mediante FISH nel corso dei nostri studi sono state utilizzate sonde diverse per natura, complessità e lunghezza:
Una sonda commerciale (Bouty) per chromosome painting fornita dalla ditta già marcata con Biotina che ibrida sui cromosomi 6 e 8
Una sonda commerciale (Vysis) che ibrida sulla regione telomerica del braccio corto del cromosoma 6
YAC localizzati nella regione critica del cromosoma 8 coinvolta nel riarrangiamento
Gli YAC (yeast artificial chromosome) sono stati selezionati dalla CEPH YAC library attraverso il sito inernet http://carbon.wi.mit.edu:8000/cgi- bin/contig e forniti dallo YAC screening centre ( DIBIT, c/o Ospedale San Raffaele, Milano).
Per il nostro studio sul cromosoma 8 abbiamo scelto gli YAC 787-C-11, 773-C-4, 920-D-12 e 946-C-9.
2.10. Marcatura del DNA estratto
Il metodo più comunemente utilizzato per la marcatura della sonda è la nick translation. Esso si basa, da un lato, sull‟attività esonucleasica della DNA polimerasi I di Escherichia coli che fa traslare l‟incisione (nick) a singolo filamento creata dalla desossiribonucleasi I pancreatica e, dall‟altro lato, sul successivo inserimento di nucleotidi modificati assieme a quelli normali (es: biotina-11-dUTP) ottenendo in tal modo la sintesi di un‟elica di DNA marcata.
Nel nostro lavoro, la marcatura degli YAC viene effettuata utilizzando un Nick Translation Kit (BOEHRINGER MANNHEIM) dove il nucleotide modificato introdotto nel DNA è biotina-11-dUTP. Si fa proseguire la reazione di sintesi per 2-3h in un bagnetto a 15°C, dopo di che si blocca tale reazione per mezzo di 0.2M EDTA (0.2M) a pH=8.0.
Successivamente si aggiungono Cot-
sopprimere le sequenze ripetute, e si precipita con NaCl (250mM) ed etanolo 100% freddo a –20°C overnight.
Si centrifuga quindi a 12000rcf per 20min a 4°C, si fa un lavaggio in etanolo 70% freddo. Il pellet così ottenuto viene risospeso nella miscela di ibridazione ( 50% Formammide, 20% Destran Solfato al 50%, 10%20XSSC, 20% H20) conservata a –20°C.
Tabella 2.2. Soluzioni utilizzate per l‟estrazione di YAC
SOLUZIONI COMPOSIZIONE CONCENTRAZIONE
FINALE
YRB (Yeast Resuspension Buffer)
Sorbitolo
Tris-HCl pH=7.5 EDTA
-mercaptoetanolo
1.2M 10mM 20mM 14mM
TE Tris-HCl pH 7.4
EDTA
50mM 20mM
SDS LaurilSolfatoSodico 10%
K-acetato K-acetato Acido acetico H2O
5M
Isopropanolo 2-propanolo
AcONa AcNa/AcOH (pH=5.5) 3M
2.11. Estrazione del DNA da sangue periferico
Il DNA di ciascun paziente da analizzare viene estratto da campioni di sangue periferico. Il primo passaggio consiste in una centrifugazione a 2800rcf per 8-10min. In questo modo si può osservare la stratificazione dei linfociti all‟interfaccia tra plasma ed eritrociti, che si raccolgono sul fondo. Successivamente si elimina il plasma, si aggiunge il lysis buffer (tabella 2.5.) e si centrifuga nuovamente a 2800rcf per 8-10min.
Una volta eliminato il sopranatante si ripete l‟ultimo passaggio 2 o 3 volte fino a che non si ottiene un pellet sufficientemente chiaro. Il pellet, dopo essere stato sospeso in 1ml di TNE (tabella 2.5.), viene centrifugato a 9000rcf per 7min. Si elimina quindi il TNE rimasto in sospensione e si sospende di nuovo il pellet
2.5.). Il campione viene così digerito a 37°C overnight oppure a 50°C per 3h.
Terminata la digestione si procede all‟estrazione del DNA:
Si aggiunge al lisato un ugual volume di PCI (Fenolo
Cloroformio Isoamilico) (tabella 2.5.), si agita per inversione per almeno 5min, si centrifuga a 10000rcf per 5min e si trasferisce la fase contenente il DNA in un‟altra provetta
Si ripete esattamente il precedente passaggio
Si ripete ancora una volta l‟operazione sostituendo però
il PCI con il CI (Cloroformio Isoamilico) (tabella 2.5.) Si procede eliminando il sopranatante e aggiungendo 2 volumi e mezzo di etanolo 99% freddo e 1/10 di volume di sodio acetato (tabella 2.5.). Il DNA precipita sotto forma di una “medusa” filamentosa in sospensione.
Si lascia a –20°C per 3h oppure a temperatura ambiente overnight. Si centrifuga quindi a 12000rcf per 10min a 4°C, si elimina il sopranatante e si risospende in etanolo freddo al 70%. Si conclude l‟estrazione centrifugando e asciugando il pellet per eliminare le tracce di etanolo, quindi si risospende il pellet in TE (tabella 2.5.) o in acqua sterile e si conserva a –4°C o a –20°C.
La concentrazione e la purezza del DNA è determinata con una lettura spettrofotometrica.
Tabella 2.4. Soluzioni utilizzate nell‟estrazione di DNA da sangue periferico
SOLUZIONI COMPOSIZIONE CONCENTRAZIONE
FINALE
EDTA pH=8 EDTA
NaOH (pasticche)
0.5M
TRIS-HCl TRIS base
HCl
1M LYSIS BUFFER Saccarosio
TRIS-HCl pH =7.5 MgCl2 1M Tryton X100
0.32M 10mM 5mM 1%
TNE TRIS-HCl pH 8
NaCl EDTA pH 8
1M 10mM 0.5M
SDS LaurilSolfatoSodico 10%
PROTEINASI K 20mg/ml
P.C.I Fenolo (saturato con Tris pH=8) CHCl3
(CH3)2CHCH2CH2OH-alcool isoamilico
50%
2%
48%
C.I. CHCl3
(CH3)2CHCH2CH2OH-alcool isoamilico
98%
2%
EtOH EtOH
99%
70%
AcONa AcNa/AcOH (pH=5.5) 3M
TE TRIS-HCl
EDTA
1M 0.5M
2.12. Ibridazione in situ a fluorescenza (FISH)
I preparati metafisici vengono invecchiati overnight a temperatura ambiente e quindi utilizzati per la FISH.
Per prima cosa si effettua un pretrattamento in 2XSSC (tabella 2.4.) pH=7.0 per 30min in un bagnetto termostato a 37°C. Successivamente il vetrino viene disidratato attraverso una serie di passaggi di 2min ciascuno in etanolo 70%- 80%-95% a temperatura ambiente e, dopo essere stato asciugato all‟aria, viene denaturato per 2min in una soluzione composta da 70%formammide/2XSSC pH=7.0 a 73°C in un bagnetto termostato.
Si fa quindi una disidratazione seriale con passaggi di 2min ciascuno prima in etanolo 50%-70% freddo, al fine di evitare una rinaturazione, e successivamente in etanolo 80%-95% a temperatura ambiente.
Il trattamento della sonda varia in base al protocollo da seguire:
1. Sonda telomerica: si denatura una miscela di
ib 2
buffer (fornito da Vysis)
2. Chromosome paint: si denatura una miscela di ibridazione buffer (fornoto da Bouty) a 65°C per 10min e si lascia 60-90min a 37°C
3. YAC
10min e si lascia per 15-30min a 37°C
Una volta che il vetrino è completamente asciutto viene messo a contatto con la sonda ed incubato overnight a 37°C in una camera umida.
Nel caso della sonda telomerica i lavaggi post-ibridazione vengono effettuati in una soluzione di 0.4XSSC/0.3%NP40 a 73°C per 2min e in una soluzione 2XSSC/0.1%NP40 per 1min a temperatura ambiente.
Nel caso del chromosome painting e degli YAC, i lavaggi post-ibridazione vengono effettuati in una soluzione al 50%formammide/2XSSC pH=7.0 a 43°C per 15min, in una soluzione di 2XSSC a 37°C per 8min, e in una soluzione di lavaggio composta da 0.05% Tween20 in 4XSSC a temperatura ambiente per 10min.
Le sonde di questo tipo necessitano di un trattamento successivo che permette la rilevazione e l‟amplificazione del segnale fluorescente.
Viene utilizzato un Kit Biotina-FITC (Fluoresceina-IsoTiaCianato) (ONCOR) composto da due soluzioni: la prima soluzione è costituita da avidina (coniugata con il fluorocromo FITC), capace di legarsi alla biotina con cui è stato marcato il DNA, mentre la seconda è costituita da anticorpi anti-avidina capaci di amplificare il segnale fluorescente. Si effettuano tre passaggi successivi applicando
passaggio è seguito da una incubazione di 12min a 37°C in una camera umida e da tre lavaggi di 4min ciascuno nella soluzione composta da 0.05% Tween20 in 4XSSC a temperatura ambiente.
I cromosomi sono evidenziati con un colorante di contrasto blu, il DAPI (4‟,6- DiAmidino-2-PhenilIndole). Tale soluzione viene precedentemente preparata
PI (0.2mg/ml) in 2ml di tampone
la reazione di colorazione viene portata avanti per 7min in una camera buia a temperatura ambiente. Per rimuovere l‟eccesso di colorante il vetrino viene lavato velocemente con PBS (Phosphate Buffered Saline Solution) (tabella 2.4.) e acqua distillata.
Quando il vetrino è completamente asciutto viene montato con un vetrino coprioggetti utilizzando il mounting medium H-100 (VECTOR), che ha la capacità di mantenere più a lungo il segnale ed esaltare la sua fluorescenza, e osservati ad un microscopio a fluorescenza (LEIKA DMRBE), dotato di una lampada da 100Wtt, sul quale sono montati filtri a doppia e tripla banda per la visualizzazione contemporanea del colorante di contrasto e dei segnali di ibridazione specifici. Per visualizzare il segnale delle sonde si utilizzano telecamere ad alta risoluzione e sistemi computerizzati, in particolare il sistema Cytovision della Applied Imaging con telecamera CCD raffreddata.
Tabella 2.3. Soluzioni utilizzate nella colorazione di preparati cromosomici e nella FISH
Soluzione Composizione
PBS pH=7.5 8g NaCl
1.76g Na2HPO4 0.2g HCl 0.2g KH2PO4 (volume finale=1l)
20XSSC pH=7 175.3g NaCl
88.2g Na Citrato (volume finale=1l) Tampone Mc Ilvaine pH=7.0 Acido Citrico 0.1M
2.13. CGH array
L‟array CGH rappresenta un‟evoluzione della CGH classica. Infatti mentre nella CGH classica i DNA sono ibridati su delle metafasi normali, nella array CGH i cromosomi delle metafasi di riferimento sono stati sostituiti da una matrice su cui possono essere disposti cloni BAC o PAC oppure oligonucleotidi (oligo CGH array).
L‟utilizzo di tali cloni permette di correlare un‟alterazione presente con una mappa genetica di riferimento e quindi di definirne l‟esatta estensione e i geni eventualmente presenti.
La risoluzione genomica dipende dal tipo di sonda posta sull‟array (BAC, cDNA, oligonucleotidi) e dalla densità ovvero dalla distanza spaziale fra una sonda e l‟altra.
Per i nostri esperimenti abbiamo utilizzato una piattaforma a 44K
oligonucleotidi (60 bp), ad una distanza media di circa 35 Kb. La risoluzione di questa piattaforma e‟ all‟incirca sulle 110 Kb.
Il principio su cui si basa la tecnica di CGH array è la co-ibridazione del DNA in esame e quello di un controllo, marcati con fluorocromi diversi.
Il DNA del paziente viene isolato da sangue periferico con i metodi standard.
1µgr del DNA genomico del paziente (il campione) ed del controllo (campione
„normale‟) viene digerito con gli enzimi di restrizione RSAI e ALUI. Il campione del DNA viene marcato con Cy5-dCTP e ed il controllo con Cy3- dCTP mediante reazione con random primers (Agilent, Santa Clara,
California). La reazione di marcatura viene purificata e quindi il DNA del paziente e quello del riferimento vengono co-ibridati e messi sul vetrino;
successivamente vengono incubati per 24h a 65°C. Il vetrino viene lavato e sottoposto a scansione utilizzando uno scanner apposito.
Lo scanner è dotato di due laser che rilevano per ogni singolo oligonucleotide i valori di fluorescenza generati dai fluorocromi Cy5-dCTP e Cy3-dCTP. Si generano in questo modo due immagini distinte (in verde e in rosso) che verrano poi unite a dare un‟immagine composita (in giallo).
Le immagini del vetrino vengono poi analizzate da apposito software, che 1- grazie all‟ausilio del cosidetto gal file, individua i diversi spot e li
posiziona tramite una griglia di riferimento. In questo modo è possibile stabilire l‟identità di ciascuno spot (tipo e sequenza dell‟oligo).
2- Una volta posizionata correttamente la griglia e identificati gli spot, il software può procedere alla quantificazione dei relativi valori di
vengono processati, normalizzati, vengono esclusi quei valori relativi a zone anomale („sporco‟ residui di un non corretto lavaggio, graffi, bolle) e combinati gli spot replicati.
Al termine del processamento un grafico riassuntivo riporta solo i risultati ritenuti affidabili, e fornisce anche informazioni più generali sulla qualità dell‟esperimento.
Un secondo software estrapola i dati finora ottenuti e fornisce l‟immagine di un
„cariotipo molecolare‟. Per ogni esperimento, sono riportati ideogrammi dei singoli cromosomi, con le relative bande citogenetiche, ed accanto i valori di fluorescenza per ogni singolo oligo. Otteniamo quindi una successione di spot che si distribuiranno intorno allo zero (valore di normalità). In caso di delezione il rapporto di fluorescenza sarà 1/2=0.5, il cui log2 è -1, per cui i valori attesi saranno lungo il valore dell‟asse -1. Nel caso di duplicazione invece, il rapporto è circa 3/2, cioè 1.5, il cui log2 è circa 0.56, per cui i valori attesi saranno intorno a questo valore. Vengono prese in considerazione spostamenti intorno a questi valori di almeno 3 oligo consecutivi, per cui la risoluzione media dei vetrini da noi usati è circa 35Kb (distanza media fra 2 oligo successivi) X 3=
110 Kb.
Il software posiziona anche gli oligo facendo riferimento alla mappa genomica Hg18 (USCB 2006); in tal modo, quando viene trovata una regione alterata, è possibile stabilirne i confini (inizio e fine in bp) e sapere se nella regione sono contenuti geni noti.
2.14. Scelta degli oligonucleidi
L‟amplificazione di ciascun microsatellite necessita di una coppia di primers:
forward (ROCHE) e reverse (NTG). I primers forniti dalla NTG sono marcati all‟estremità 5‟ con una fosforamidite fluoresceinata (6-FAM, HEX).
Le sequenze oligonucleotidiche relative a ciascun microsatellite sono state ottenute dal sito internet http://genome.ucsc.edu
D15S97:
Forward F: 5‟- CTTCTAGCCTCAGGTTCCCC -3‟ (marcato
con HEX)
Reverse R: 5‟- ATTCACTTTTCAAACCACCCC -3‟
D15S122:
Forward F: 5‟- GATAATCATGCCCCCCA -3‟ (marcato con
HEX)
Reverse R: 5‟- CCCAGTATCTGGCACGTAG -3‟
D15S133:
Forward F: 5‟- GACATGAACAGAGGTAAATTGGTGG-3‟ (marcato con 6- FAM)
Reverse R: 5‟- GCTCTCTAAGATCACTGGATAGG-3‟
GABRβ3:
Forward F: 5‟-GCGACAGAGTGAAACTCCAT-3‟ (marcato con 6-FAM)
Reverse R: 5‟-ACCAATCCAGTGAATTAAGGC-3‟
D15S11:
Forward F: 5‟- GACATGAACAGAGGTAAATTGGTGG-3‟
(marcato con 6-FAM)
Reverse R: 5‟- GCTCTCTAAGATCACTGGATAGG -3‟
D15S128:
Forward F: 5‟- GCTGTGTGTAAGTGTGTTTTATATC-3‟
Reverse R: 5‟- GCAAGCCAGTGGAGAG-3‟ (marcato con HEX)
D15S986:
Forward F: 5‟- GCAGGAATATGTCCAGGG-3‟
Reverse R: 5‟- CATGGCTGGTCTTTAGGTG-3‟ (marcato con HEX)
D15S1002:
Forward F: 5‟- GTATCCCAAGGCCATACCCT-3‟
Reverse R: 5‟- CTCTTGCTAGAGACAGCAGG-3‟ (marcato con 6-FAM)
D15S1012:
Forward F: 5‟- CAACAAGAACGAAACTGTCA-3‟
Reverse R: 5‟- AGCCTTAAGTTCCTGGACTC-3‟ (marcato con HEX)
D15S153:
Forward F: 5‟- AGTACCTGAAAGGGTGGG-3‟ (marcato con HEX)
Reverse R: 5‟- GATCAGTGTAGGCTCCAAA-3‟
D15S205:
Forward F: 5‟- CTTAATGGTTTGGCAGGATA-3‟ (marcato con HEX)
Reverse R: 5‟- AGCTTAAAANCAAAATCTCCC-3‟
2.15. Polymerase Chain Reaction (PCR)
Il DNA estratto dai pazienti studiati e dai relativi genitori è stato impiegato per l‟amplificazione dei microsatelliti tramite la reazione a catena della polimerasi.
Il protocollo di PCR usato è riportato nella tabella 2.6:
Tabella 2.5. Mix PCR 1-2
Tabella 2.6. Mix PCR triplex
REAGENTE CONCENTRAZIONE INIZIALE VOLUME FINALE
Buffer 10X 2.5 10
MgCl2 50Mm 0.6 4.8
dNTPs 10mM 2 8
Primer F 1 4
Primer R 1 4
H2O 12.9 49.2
Vol.finale 20 80
REAGENTE CONCENTRAZIONE INIZIALE VOLUME FINALE
Buffer 10X 2.5 10
MgCl2 50Mm 1 8
dNTPs 10mM 2.5 10
Primer F 1 4
Primer R 1 4
Primer F 1 4
Primer R 1 4
Primer F Gabr 1.5 4
Primer RGabr 1.5 4
H2O 7 20
Vol.finale 20
Tabella 2.7. Mix linkage
La reazione di PCR è effettuata nella macchina GeneAmp 9700 PCR System PE Applied Biosystems. I campioni, dopo una denaturazione iniziale di 95°C per 5min, sono sottoposti a 30 cicli di amplificazione, ciascuno dei quali comprende le seguenti tre fasi:
- denaturazione a 95°C per 1min, che consente la separazione dei due filamenti di DNA
- annealing a 55°C per 1min, che consente l‟appaiamento dei primers alle sequenze complementari del campione di DNA - estensione a 72°C per 1min, in cui la taq polimerasi si attacca ai
primers e copia i filamenti di DNA target originando così due molecole di DNA a doppia catena
Al termine viene eseguita un‟estensione finale a 72°C per 7min affinchè eventuali prodotti incompleti siano completati.
I prodotti di PCR vengono controllati su gel di agarosio (2% in TBE 1X).
REAGENTE CONCENTRAZIONE INIZIALE VOLUME FINALE
Buffer II PE 1.5 30
MgCl2 50Mm 1.5 30
dNTPs 10mM 0.375 7.5
Taq Gold 0.12 2.4
H2O 5.505 40.1
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2.16. Analisi dei prodotti di PCR
Una miscela costituita da 1
di uno standard marcato con esteri NHS fluorescenti (TAMRA), viene denaturata a 95°C per 5min e successivamente caricata in un sequenziatore automatico ABI PRISM 310 che permette di separare, mediante una elettroforesi capillare, frammenti di DNA in base alla loro lunghezza. I risultati ottenuti vengono analizzati dal software GeneScan, che utilizza gli strumenti di analisi genetica Perkin-Elmer ABI PRISM per determinare le dimensioni e le quantità dei frammenti di DNA attraverso un sistema automatico di rilevamento fluorescente.
2.17. Methylation-specific MLPA
Il kit da noi utilizzato (SALSA® MS-MLPA® kit), oltre ad evidenziare variazioni nel numero di copie, consente di analizzare (in maniera
semiquantitativa) lo stato di metilazione di isole CpG nella regione 15q11.
Nel kit sono presenti 32 sonde specifiche per sequenze che si trovano nella regione critica PWS/AS e che possono essere utilizzate per rilevare il
cambiamento del numero di copie. Cinque di queste sonde sono specifiche per sequenze “imprinted” poiché contengono un sito di riconoscimento per
l‟enzima HhaI sensibile alla metilazione; queste sonde possono essere utilizzate per evidenziare pattern di metilazione alterati conseguenti a disomia
uniparentale e a difetti di imprinting;
Per l‟analisi dei risultati il kit comprende poi 14 sonde di controllo localizzate all‟esterno della regione PWS/AS. Infine, ci sono 3 sonde che servono a monitorare l‟avvenuta digestione da parte dell‟enzima HhaI (nella reazione di quantificazione di metilazione).
Approssimativamente viene denaturato circa 50 ng di DNA genomico in 5 ml di tampone TE [10 mM Tris-HCl (pH 8.5) e 1 mM di EDTA], per 10 min a 98° C.
Vengono poi aggiunti il buffer SALSA MLPA (1.5µl) e le sonde MS-MLPA (1 fmol ognuna e 1,5 vol ml) e, dopo incubazione per 1 min a 95°C, si ibridizzano ai rispettivi targets per circa 16 ore a 60°C. Dopo l‟ibridazione, la miscela viene diluita a temperatura ambiente con H2O e 3 µl di Ligase buffer A raggiungendo un volume finale di 20 µl e successivamente vengono divise equamente in due
In una provetta viene aggiunta a 49°C una miscela di 0,25 µl di ligasi-65
(MRC-Holland), 5 U HhaI (Promega) e 1,5 µl di Ligase buffer B, in un volume finale di 10 µl. La seconda provetta viene trattata allo stesso modo, tranne che l'enzima HhaI viene sostituito con H2O. La reazione di ligation e la digestione viene effettuata mediante incubazione per 30 min a 49°C, seguita da 5 minuti a 98°C per l‟inattivazione termica degli enzimi. I prodotti della reazione di
ligation vengono poi amplificati con la reazione della PCR aggiungendo di 5 µl della miscela di ligation e 20 µl della miscela di PCR che contiene il buffer, dNTPs, la polimerasi SALSA e i primer PCR (uno è marcato e l‟altro no) a 60°C come descritto da Schouten et al.2002.
La quantificazione del numero numero di copie viene calcolato dividendo il picco dell‟ area di ogni campione per il picco delle aree dei controlli più vicine.
Il numero di copie relativo è stata ottenuta confrontando questo rapporto con rapporto ottenuto da un campione di controllo. La quantificazione dello stato di metilazione di un sito CpG particolare è stato calcolato dividendo l'area del picco con le aree delle sonde dei controlli dove manca un sito HhaI. Infine, l'area del picco relativo di ogni sonda del campione digerito è stato confrontato con quelli ottenuti dal campione non digerito. La metilazione viene considerata aberrante quando la percentuale di metilazione calcolata è maggiore di 10%.
Eventuali percentuali di metilazione al di sotto di questo livello sono stati considerati come background.
