In funzione del tipo di marcatura si distinguono gli enzyme immuno assays, se l’antigene è marcato con enzimi e fluorescent immunoassay, se l’antigene è marcato con una sostanza fluorescente.

73

Appendice: Cenni sulle principali metodiche analitiche.

Tra i test di screening più diffusi ci sono quelli che sfruttano, per la rilevazione delle sostanze nelle matrici biologiche, tecniche di immuno-chimica e la maggior parte di questi è progettata per essere effettuata sulle urine.

Tali metodiche si basano sulla competizione tra la sostanza da identificare e la stessa sostanza marcata e aggiunta in concentrazione nota, per un anticorpo specifico:

tanto maggiore sarà la presenza della sostanza tossica nel campione, tanto maggiore sarà, per la legge di azione di massa, la quantità di sostanza marcata esclusa dal legame.

In funzione del tipo di marcatura si distinguono gli enzyme immuno assays, se l’antigene è marcato con enzimi e fluorescent immunoassay, se l’antigene è marcato con una sostanza fluorescente.

Nell’enzyme immuno assay, quando il complesso antigene-enzima viene incubato in presenza di un anticorpo specifico per quell’antigene, l’attività enzimatica è marcatamente diminuita per il blocco del sito attivo da parte dell’anticorpo. Nel momento in cui, invece, un antigene esogeno, contenuto nelle urine o nel siero, venga aggiunto al complesso immune, questo compete con il complesso farmaco-enzima per legarsi all’anticorpo. Il complesso farmaco-enzima, così liberato, determina un aumento dell’attività enzimatica che è proporzionale alla concentrazione dell’antigene nel campione biologico.

Figura A.1: Schema di EMIT

74

Una tecnica fluorescent immuno assay è rappresentata dal fluorescence polarization immuno assay, in cui l’antigene è covalentemente legato ad una molecola sonda. Quando la molecola fluorescente viene eccitata da una luce polarizzata, se la molecola è stazionaria, cioè se è relativamente immobile, emetterà una luce polarizzata; se invece si muove liberamente in soluzione la polarizzazione viene persa. La polarizzazione fluorescente dell’antigene è alta quando il complesso è legato all’anticorpo; l’aggiunta di antigene esogeno determina lo spiazzamento di alcuni complessi che passano in soluzione determinando una riduzione della polarizzazione della fluorescenza, direttamente proporzionale alla concentrazione dell’antigene stesso.

Figura A.2: Schema di FPIA

Tra le analisi di conferma, invece, la principale è rappresentata dalla spettrometria

di massa, accoppiata con tecniche separative quali gas cromatografia e cromatografia

liquida ad alte prestazioni (HPLC).

75

L’analisi cromatografica è una tecnica di separazione che si basa sulla distribuzione della sostanza tra una fase stazionaria e una mobile, in base alla affinità relativa per l’una o l’altra fase; i composti che interagiscono più fortemente con la fase stazionaria vengono trattenuti più a lungo di quelli che si legano di più alla fase mobile. Per identificare i campioni è possibile utilizzare il tempo di ritenzione , valore caratteristico per ciascun composto, cioè il tempo necessario per l’eluizione del composto che è correlato con la forza della sua interazione con la fase stazionaria e quella mobile.

Nella gascromatografia la fase mobile è un gas, inerte rispetto alla sostanza da separare, mentre i due tipi di fase stazionaria comunemente usati sono gli assorbenti solidi (cromatografia a gas solida, GSC) e liquidi che rivestono un supporto solido (cromatografia gas liquida GLC). La gascromatografia viene utilizzata per il dosaggio di composti di natura volatile o che possono essere trasformati in tale forma.

Molti composti organici sono troppo instabili o non sufficientemente volatili per essere analizzati in gascromatografia; in tali casi si preferisce utilizzare la cromatografia liquida, in particolare la HPLC che presenta numerosi vantaggi rispetto alle altre tecniche come ad esempio una maggiore risoluzione e tempi di analisi più corti: nella cromatografia liquida la fase mobile è costituita da solventi che partecipano alla separazione, aumentandone l’affinità.

La spettrometria di massa è, invece, una tecnica basata sullo studio dei frammenti ionici che vengono prodotti a seguito dell’interazione della sostanza in esame con un fascio di elettroni o molecole cariche: a seguito di ciò si producono ioni che vengono separati e analizzati secondo il loro rapporto massa/carica. L’abbondanza relativa degli ioni in funzione del rapporto massa /carica costituisce lo spettro di massa di quella sostanza che è caratteristico: tale analisi è, quindi, in grado di fornire informazioni strutturali sulle molecole in esame consentendo un’ indagine qualitativa e quantitativa con elevata sensibilità.

Bibliografia:

1. Hand C, Baldwin D. Immunoassays. In: Moffat AC, Osselton MD, Widdop B, editors.

Clarke's Analysis of drugs and pisoning: Pharmaceutical Press; 2004.

76 2. Crouch DJ, Peat MA, Chinn DM, Finkle BS. Drugs and driving: a systematic analytical approach. J Forensic Sci. 1983; 28(4): 945-56.

3. Pincus MR, Abraham NZ. Tossicologia e monitoraggio della terapia farmacologica. In:

Henry JB, editor. Diagnosi clinica e metodi di laboratorio: Antonio Delfino Editore; 2005. p. 407- 43.

4. Fucci N, De Giovanni N. Le principali sostanze d'abuso. Il laboratorio di tossicologia forense. p. 80-6.

5. Watson D. Mass Spectrometry. In: Moffat AC, Osselton MD, Widdop B, editors. Clarke's Analysis of Drugs and Poisoning: Pharmaceutical Press; 2004.

6. Payne JP. Gas chromatography. Alcohol in blood and urine. Proc R Soc Med. 1968; 61(5):

530-4.

7. Loomis TA. Blood alcohol in automobile drivers: measurement and interpretation for medicolegal purposes. I. Effect of time interval between incident and sample acquisition. Q J Stud Alcohol. 1974; 35(Pt A): 458-72.

8. Cosbey SH. Drugs and the impaired driver in Northern Ireland: an analytical survey.

Forensic Sci Int. 1986; 32(4): 245-58.