Durante gli ultimi 50 anni, le benzodiazepine (Bz) hanno assunto un notevole valore in campo terapeutico; l’ampio uso clinico si basa sulla loro attività di potenti ansiolitici, anticonvulsivanti, ipnotico-sedativi e rilassanti muscolari . Il recettore centrale delle benzodiazepine (CBR), che media tutte queste azioni, è localizzato esclusivamente nel sistema nervoso centrale (SNC) e fa parte di un complesso recettoriale sovramolecolare dove sono riconoscibili il sito di legame per l’acido γ-aminobutirrico (GABA), il canale per il cloro e distinti centri di modulazione allosterica sensibili a diversi composti quali le Bz, i barbiturici, la picrotossina, ecc..
Un ulteriore sito di legame per le Bz fu localizzato circa 40 anni fa nei tessuti periferici e fu denominato recettore
periferico delle benzodiazepine (PBR).[ 1 ,2 ] Recentemente al
PBR è stato attribuito il nuovo nome di Proteina Traslocatrice (18 KDa), abbreviato TSPO. Le ragioni che hanno portato a questo cambiamento sono state determin ate dalle nuove scoperte riguardo la localizzazione, la struttura e il ruolo fisiologico di questa proteina. Infatti, è stato osservato che il TSPO non interagisce solamente con le Bz, ma con molti altri ligandi; inoltre non è localizzato esclusivamente a livello periferico e non presenta nemmeno una struttura recettoriale nel senso tradizionale del termine. E’ stato quindi pensato di attribuire come nuovo nome TSPO con riferimento alla principale funzione svolta da questa proteina che è appunto quella del trasporto di molecole come ad esempio il colesterolo
e gli intermedi per la sintesi delle porfirine.[ 3 ] Il TSPO ha una
elevata distribuzione in molti tessuti del corpo. Il cervello ed il fegato presentano livelli relativamente bassi di TSPO, mentre i tessuti e le ghiandole coinvolte nella sintesi degli steroidi ne sono particolarmente ricchi; nel cuore, polmone e
rene la sua presenza è più moderata. Il TSPO, inoltre, è espresso in concentrazioni significative anche nel sistema immunitario e nelle varie sott opopolazioni dei leucociti.
Il TSPO è una proteina evolutivamente conservata, di 18kDa, altamente idrofobica, costituita da 5 domini transmembranali ed espressa principalmente nella membrana
esterna mitocondriale. Alcuni studi hanno riportato
l’espressione del TSPO sulla membrana plasmatica degli eritrociti e sulle membrane nucleari di cellule cancerose. Nei mitocondri il TSPO è un costituente del poro di transizione di
permeabilità mitocondriale ( mitochondrial permeability
transition pore, MPTP), dove è intimamente associato in un
complesso trimerico con il trasportatore dei nucleotidi adenosinici (ANT, 30 kDa) ed il canale anionico voltaggio dipendente (VDAC, 32 kDa) (Figura 1). Questo complesso costituisce un canale localizzato sui siti di contatto tra le
membrane mitocondriali esterna ed interna.[ 3 ]
Fino ad oggi sono state identificate 4 proteine
citoplasmatiche capaci di legarsi al TSPO,[ 1 ] anche se la
funzionalità di due di queste è ancora sc onosciuta:
PRAX-1 Peripheral Benzodiazepine Receptor -associated
Protein 1 (proteina associata al recettore periferico delle benzodiazepine), del peso di 240 kDa, costituita da 1857 aminoacidi;
p10, una proteina di 10 kDa che co-immunoprecipita con
il TSPO;
Steroidogenic Acute Regulatory Protein (STAR) che lega
il colesterolo e ne promuove il trasferimento
mitocondriale;
PAP7, che regola anch’essa la steroidogenesi.
Per quanto riguarda la proteina PRAX-1 è stato
ipotizzato un modello per la sua interazione c on il TSPO.[ 1 ]
Dati stechiometrici evidenziano che la PRAX -1, come monomero, è in associazione con più molecole (almeno due) di TSPO (18kDa) che si trovano nelle sue vicinanze. La porzione della proteina TSPO accessibile per il legame con la PRAX -1 è probabilmente quella C-terminale, di 14 aminoacidi, esposta verso il lato citoplasmatico della membrana esterna mitocondriale. Il ruolo della PRAX-1 è ancora sconosciuto, ma si ritiene che questa sia coinvolta nel reclutamento di siti supplementari nelle vicinanze del TSPO in maniera tale da modularne le funzioni.
Il TSPO riveste un ruolo chiave nella funzionalità cellulare. Ad esso sono attribuite le funzioni di regolazione
della proliferazione cellulare, trasporto di porfirine
(protoporfirina IX, mesoporfirina IX, emina), sintesi dell’eme, immunomodulazione, regolazione della steroidogenesi e apoptosi.
TSPO e steroidogenesi. La biosintesi degli steroidi inizia in tutti i tessuti steroidogenici con la conversione enzimatica del precursore colesterolo in pregnen olone. Il passaggio limitante la velocità di questo processo è il trasporto del colesterolo dai depositi intracellulari, attraverso lo spazio acquoso intermembranale, verso il lato della membrana mitocondriale interna rivolta verso la matrice, a livello de lla quale è presente il citocromo P-450 che catalizza la reazione (Figura 2).[ 1 ]
Il TSPO riveste un ruolo cruciale nel processo steroidogenico: quando viene attivato da un ligando (es. PK11195) lega il colesterolo e regola il suo trasporto dalla membrana mitocondriale esterna a quella interna, aumentando la produzione di pregnenolone e la sintesi degli steroidi. Il meccanismo ipotizzato si basa su un modello sperimentale di dinamica molecolare: il TSPO accoglierebbe nelle sue 5 eliche la molecola di colesterolo formando un canale tramite il quale il colesterolo verrebbe trasportato attraverso la membrana.
Figura 2
E’ stato inoltre osservato che i livelli sistemici di steroidi aumentano in seguito ad una lesione, ad un dolore o ad una febbre, in risposta alla stimolazione da parte di alcune
P450 Pregnenolone Cellula gliale Terminazione presinaptica GABAergica Colesterolo Pregnenolone SO4 DHEA-SO4 3aOH-DHP THDOC DBI mRNA DBI Proteina di legame Sito di legame mitocondriale per le Bz (TTN) Membrana interna Membrana esterna + _ Cl -Endozepine DBI DBI DBI GABA Recettore del neurotrasmettitore a b Cl -g Recettore GABAA Neurone postsinaptico
citochine della secrezione del fattore di rilascio delle corticotropine. Il coinvolgimento del TSPO nella sintesi di steroidi può quindi contribuire a questo meccanismo difensivo. Inoltre, la relazione presente fra i bassi livelli di steroidi e l’ansia ha indicato il TSPO come un promettente target per il trattamento dei disturbi psichiatrici che sono
correlati ad una disfunzione nella sintesi di steroidi.[ 1 ] Alcuni
composti altamente affini al TSPO come PK11195 e la classe delle N,N-dialchil-2-fenilindol-3-ilgliossilamidi, recentemente sintetizzate nel nostro laboratorio, hanno mostrato come effetto un aumento della biosintesi del pregnenolone, e quindi dei neurosteroidi, risultando potenzialmente utili per il
trattamento dell’ansia. [ 4 ]
TSPO e apoptosi. La cascata apoptotica che porta alla morte cellulare è stata ben caratterizzata e, in questo processo, l’evento critico iniziale risulta essere la dissipazione del
potenziale transmembranale mitocondriale causata
dall’apertura dell’MPTP. L’apertura di tale poro, se reversibile e a basso livello di conduttanza, causa un netto influsso di ioni ed acqua dentro la matrice mitocondriale al fine di mantenere il corretto equilibrio ionico dell’organello. L’apertura prolungata del MPTP-poro può al contrario innescare una serie di eventi che hanno importanti conseguenze sulla fisiologia mitocondriale e sull’equilibrio bioenergetico della cellula. In particolare è stata osservata la dissip azione del potenziale transmembrana. Inoltre influenza l’omeostasi degli ioni intracellulari, favorendo il rilascio di calcio dalla matrice, e determina il rigonfiamento colloido-osmotico della matrice mitocondriale e l’efflusso dal mitocondrio di proteine e molecole tra cui il citocromo c e la flavoproteina AIF (fattore d’induzione dell’apoptosi). Quest’ultima trasloca nel nucleo
dove induce condensazione della cromatina e frammentazione del DNA. Nel citosol il citocromo c interagisce con Apaf -1 (fattore attivante dell’apoptosi) innescando le reazioni della caspasi che portano all’attivazione di un complesso di enzimi fondamentale nell’indurre il riarrangiamento strutturale del nucleo, del citoscheletro e della membrana plasmatica,
caratteristici dell’apopt osi.[ 1 ]
Il TSPO è un modulatore endogeno di questo processo, ma l’esatto meccanismo non è ancora stato definitivamente stabilito. La sua regolazione può avvenire a diversi livelli e il meccanismo proposto include la modulazione dell’MPTP o la diretta interazione con molecole pro - o anti-apoptotiche. E’ stato dimostrato che i suoi ligandi modulano l’MPTP e la risposta apoptotica. PK11195 e FGIN -1-27 sono in grado di
diminuire il potenziale di membrana mitocondriale,
provocando apoptosi e arresto del ciclo ce llulare nella fase
G1/G0 in diverse linee cellulari tumorali.[ 1 ] Il secondo
meccanismo è stato proposto dal momento che, a livello dei siti di contatto tra la membrana esterna e quella interna del mitocondrio, il TSPO è coinvolto nella formazione dell’MPTP poro.
TSPO e immunomodulazione. La presenza del TSPO in un gran numero di cellule immunomodulatorie come la microglia, i monociti del sangue, i linfociti e i leucociti, ha portato a pensare ad un coinvolgimento del TSPO nella risposta immunitaria; tuttavi a, il meccanismo attraverso il quale ciò avviene è ancora sconosciuto. I macrofagi presentano molti siti di legame per il TSPO e, in particolari studi effettuati sui topi, è stato osservato che le Bz inibiscono la capacità dei macrofagi di produrre ROS e a lcune citochine
Inoltre, il TSPO è coinvolto nel metabolismo ossidativo ad opera dei fagociti, processo necessario per eliminare
definitivamente antigeni esterni. La funzione
immunosoppressiva di alcuni ligandi che vanno ad interagire con il TSPO ha dimostrato l ’importante ruolo rivestito da questa proteina nella risposta infiammatoria.
Nel SNC il TSPO è espresso prevalentemente nelle cellule microgliali. L’attivazione della microglia dà inizio ad una risposta infiammatoria che può esacerbare la perdita neuronale in varie malattie infiammatorie neurodegenerative, come ad esempio l’Alzheimer. Poichè si è osservata una sovraespressione di TSPO nella microglia attivata, si è pensato che l’infiammazione presente a livello cerebrale durante le patologie neurodegenerative coinvolga tale recettore. Si presenta così la possibilità di utilizzare degli specifici ligandi per il TSPO per prevenire o limitare la neuroinfiammazione. Tuttavia il coinvolgimento della microglia attivata in varie patologie del SNC è differente a seconda del suo ruolo nella progressione e nella gravità della patologia. E’ plausibile quindi ipotizzare che, attraverso l’utilizzo del TSPO come marker di tali cellule sia possibile determinare con esattezza quale ruolo la neuroinfiammazione gioca in specif iche condizioni patologiche che coinvolgono il SNC, aprendo così le porte alla cura o all’inibizione della progressione della malattia.[ 5 ]
Altre funzioni del TSPO. Numerosi studi sul TSPO hanno dimostrato la modulazione della sua espressione in stati fisiologici e patologici. L’espressione del TSPO è sotto il controllo del sistema ormonale che colpisce l’interazione del suddetto recettore con VDAC e ANT. Anche altri fattori come le citochine (IL-1 o TNF-α), la vitamina A e le catecolamine
modulano l’espressione del TSPO. L’attività del TSPO sembra comprendere anche la modulazione della risposta cellulare nelle infezioni virali. Una delle strategie adottate dai virus per aggirare i meccanismi protettivi della cellula contro le infezioni, è quella di bloccare il processo di apoptosi. Molteplici studi hanno dimostrato che diversi virus patogeni utilizzano proprio il TSPO come target per mettere in atto il blocco dell’apoptosi. Questa scoperta offre quindi numerose prospettive per nuove strategie antivirali.
L’attività del TSPO risulta implicata anche nello stress. Infatti la sua attivazione durante l’esposizione acuta ad agenti stressogeni può essere vista come una predisposizione neuronale e metabolica per un migliore adattamento allo
stress.[ 1 ]
Un’elevata espressione di tale recettore è stata inoltre riscontrata nelle cellule e nei tessuti neoplastici dell’ovario, nell’adenocarcinoma, nel carcinoma del fegato, del colon e nei gliomi. Questo aumento dell’espressione del TSPO è
correlabile con il grado di aggressi vità della forma tumorale. Il
monitoraggio dell’espressione di tale recettore, dunque, può essere una procedura rilevante in clinica per diagnosticare e/o seguire la progressione della patologia.
Il TSPO è sovraespresso anche nelle cellule microgliali attivate ed in generale nelle aree in cui è in corso una significativa risposta infiammatoria. Una up-regulation della proteina è osservabile anche in vari disturbi neurodegenerativi come ad esempio il morbo di Alzheimer e di Huntington, e nella sclerosi multipla. Una down-regulation di tale recettore è stata al contrario osservata in pazienti affetti da ansia, da
La comprensione dei meccanismi attraverso i quali il TSPO modula le risposte cellulari, insieme alla descrizione delle variazioni della sua espressione, costituisce la base razionale per un uso terapeutico dei ligandi di tale recettore. Di conseguenza il TSPO ha assunto un notevole interesse come possibile target terapeutico.
Una grande varietà di molecole endogene mostra alta affinità per il TSPO. Una delle prime molecole identificate, isolata sia a livello centrale che nei tessuti periferici (ghiandola surrenale, rene e testicoli), è un residuo di neuropeptide di 11 kDa composto da 86 aminoacidi che inibisce il legame del diazepam con il sito recettoriale delle Bz, chiamato “inibitore del legame del diazepam (DBI)”. Oltre a questa molecola e ai suoi metaboliti, sono stati isolati altri ligandi endogeni come le porfirine (protoporfirina IX, mesoporfirina IX ed emina) ed il colesterolo.
Le principali classi di ligandi sintetici descritti in
letteratura sono:[ 1 , 5 ] (Figura 3):
benzodiazepine (4'-clorodiazepam, Ro5-4864)
isochinolincarbossamidi (PK11195)
imidazopiridine (Alpidem)
derivati indolacetamidici (FGIN-1, SSR180575)
derivati fenossifenilacetamidici (DAA1097)
pirazolopirimidine (DPA714)
N,N-dialchil-2-fenilindol-3-ilgliossilamidi.
Tutti questi ligandi, che mostrano un’alta affinità di
legame per il TSPO, con valori di Ki nell’ordine del
nanomolare, sono stati utilizzati come strumenti farmacologici di ricerca per caratterizzare le proprietà e le funzioni del TSPO.
N N Cl N O CH3 CH3 N N CH3 CH3 O Cl CH3 Alpidem ( 1 ) PK11195 ( 2 ) N N O Cl CH3 Cl Ro5-4864 ( 3 ) N O N R1 X R2 R3 H R FGIN-1 ( 4 ) N H N N O N CH3 CH3 O SSR180575 ( 5 ) Figura 3
I ligandi FGIN-1-27 e PK11195 hanno mostrato, in vitro, attività antitumorale, inducendo l’apoptosi e l’arresto del ciclo cellulare in linee cellulari di cancro esofageo, colon -rettale e in colture primarie di cancro.
Cl N CH3 O CH3 CH3 O DAA1097 ( 6 ) O N N H3C N N CH3 CH3 O F O DPA714 ( 7 )
L’ipotesi che il TSPO partecipi allo sviluppo della malattia è supportata dalla sua localizzazione anche a livello nucleare e perinucleare in alcune linee cellulari cancerose: in questa sede il recettore regolerebbe la proliferazione cellulare facilitando il trasporto del colesterolo nel nucleo. Inoltre studi di imaging diagnostico non invasivo, mediante l’utilizzo di
ligandi marcati per il TSPO ([3H]PK11195), hanno fornito dati
di notevole interesse nella visualizzazione dei tumori in test come la tomografia a emissione di positroni (PET).
Ligandi come il Ro5-4864 ed il PK11195 limitano la gravità e la progressione di diversi processi infiammatori. Ciò è stato dimostrato utilizzando questi ligandi in studi sperimentali come il test della carragenina e nella terapia di patologie infiammatorie (infiammazione e iperplasia s inoviale, degenerazione del tessuto osseo e cartilagineo). SSR180575 è risultato efficace nella terapia dell’artrite reumatoide. Ulteriori sperimentazioni hanno dimostrato l’efficacia del SSR180575 e del PK11195 nella terapia del Lupus erythematosus
(patologia autoimmune).[ 1 ] Recentemente è stata sintetizzata
una nuova classe di farmaci, le pirazolopirimidine, affine e selettiva per il TSPO ed in particolare il composto DPA714, in grado di aumentare la steroidogenesi dell’ 80% rispetto ai livelli fisiologici. E’ stato osservato che i livelli sistemici di steroidi risultano significativamente aumentati a seguito di una lesione, di un dolore o di una febbre, a causa della stimolazione da parte di alcune citochine sulla secrezione del fattore di rilascio delle corticotropine. L’utilizzo di ligandi in grado di interagire con il TSPO e stimolare la sintesi di steroidi può quindi contribuire ad una risposta difensiva e anti-infiammatoria. Altri ligandi in grado di stimolare la
sintesi di steroidi sono i derivati fe nossifenilacetamidici
(DAA1097).[ 5 ]
Come descritto in precedenza a livello cerebrale il TSPO è localizzato principalmente nelle cellule gliali. E’ stato riscontrato un elevato aumento della sua densità in caso di lesioni o situazioni patologiche a livello del sistema nervoso centrale (SNC), in modo particolare negli stati acuti e cronici di patologie neurodegenerative. Da ciò è nata l’ipotesi che la regolazione delle funzioni del TSPO possa avere un ruolo neurotrofico e neuroprotettivo nelle lesioni neuron ali. I risultati sperimentali hanno suggerito che l’espressione del TSPO poteva essere regolata da segnali provenienti da assoni in via di rigenerazione. Un recente studio ha dimostrato come il ligando SSR180575 manifesti proprietà neuroprotettive in diversi modelli di patologie degenerative progressive del sistema nervoso centrale e periferico. Precisamente sia il
ligando SSR180575 che il Ro5-4864 promuovono la
sopravvivenza del neurone e la riparazione successiva ad assotomia. I meccanismi ipotizzati per tale azione sono: (i) regolazione del processo apoptotico che favorisce la sopravvivenza delle cellule gliali; (ii) produzione di mediatori come neurosteroidi, citochine o altri fattori neurotrofici che supportano la sopravvivenza del nervo.
La classe delle N,N-dialchil-2-fenilindol-3-ilgliossilamidi
I è stata recentemente individuata nel laboratorio di ricerca
presso il quale è stato svolto questo lavoro di tesi. Questi nuovi ligandi, che rappresentano una variazione della struttura base dell’alpidem, sono altamente affini e selettivi
N R5 N O O R1 R2 H R3 R6 I
Sono state sintetizzate numerose indolgliossilamidi portanti gruppi sostituenti con diverse proprietà steriche, lipofile ed elettroniche. Moltissimi nuovi derivati sono
risultati attivi e selettivi per il TSPO, con valori di Ki di ordine
nanomolare. La selettività verso il recettore periferico è stata accertata con test di binding per il CBR nei quali i composti hanno dimostrato scarsa o nulla affinità ( Tabella 1). Per alcune delle indolgliossilamidi I è stata inoltre evidenziata la capacità di stimolare la biosintesi del pregnenolone in cellule C6 di glioma di ratto. [ 6 ]
Le più importanti considerazioni sulle relazioni struttura-attività (SAR), emerse dall’esame dei dati di affinità riportati nella Tabella 1, sono le seguenti: per quanto riguarda
la natura dei sostituenti R1 ed R2 sull’azoto della catena
gliossilamidica in posizione 3, ottimi risultati in termini di affinità sono stati ottenuti attraverso la disostituzione con catene alchiliche lineari ed uguali tra loro, di lunghezza compresa tra 3 e 6 atomi di carbonio; si sono inoltre dimostrati altamente affini composti con sostituzione asimmetrica dell’azoto amidico, in particolare N -etilbenzilamidi e N-metilbutilamidi.
Considerando la posizione para sul fenile in posizione 2,
subnanomolari. Tra questi derivati, quelli con catene n-esiliche e con un sostituente in posizione 4' come un alogeno, fluoro (1p) e cloro (1t), o un gruppo nitro (1x), risultano
particolarmente potenti con valori di Ki rispettivamente 0.37
nM, 0.55 nM e 0.27 nM. E’ interessante notare che l’affinità mostrata è simile, se non superiore, a quella dell’alpidem,
preso come riferimento (Ki=0.5-7nm). Al contrario l’inserzione
di un gruppo elettrondonatore come il metile nella posizione 4' non ha determinato un aumento significativo di affinità: infatti questi composti (1dd-1gg) sono equipotenti ai corrispondenti non sostituiti.
Infine, per quanto riguarda la posizione 5 del sistema
indolico, prodotti recanti un sostituente di tipo
elettronattrattore come F, Cl, NO2 (1hh-1ss), hanno mostrato
una buona attività, che risulta ulteriormente potenziata se è
contemporaneamente presente un secondo sostituente
elettronattrattore in posizione 4' ( 1yy-1jjj, 1www-1zzz).
In particolare, il derivato più attivo di tutta la serie delle indolgliossilamidi è rappresentato dal 4',5 -dicloro sostituito, portante in posizione 3 una catena N-metilbutilamidica (1xxx,
Ki=0.15 nM).
Le SAR di questa classe di composti sono state razionalizzate sulla base di un modello di farmacoforo
-recettore, secondo il quale i siti di legame sono costituiti da
tre tasche lipofile (L1, L3 e L4) e da un sito donatore capace di
formare un legame a idrogeno H1.[ 6 ]
Nella Figura 4 è rappresentato lo schema di interazione delle indolgliossilamidi I con il recettore, paragonato con le modalità di legame del derivato isochinolinico PK11195.
N O N Me Me Me N O N R1 R2 R3 R6 O PK11195 L3 Cl N,N-dialchil-2-fenilindol-3-ilgliossilamidi I ( R4 =H ), II ( R4=CH3 ) H1 L1 L4 H1 L1 L4 L3 R4 Figura 4
Per le indolgliossililamidi si può ipotizzare che il fenile in posizione 2 sia coinvolto in una interazione con un anello aromatico elettron-ricco presente nell’area lipofila L1 e che
questa interazione sia rafforzata d a sostituenti
elettronattrattori come gli alogeni o il gruppo nitro in
posizione 4'. I sostituenti alchilici R1 ed R2 interagirebbero con
le aree lipofile L3 e L4, rispettivamente, mentre il secondo carbonile del ponte ossalilico della catena laterale svol gerebbe il ruolo di accettore nella formazione di un legame a idrogeno con il sito H1 presente sul recettore.
PROBES MOLECOLARI PER LA CARATTERIZZAZIONE DEI RECETTORI ATTRAVERSO TECNICHE CHIMICO -FISICHE:
LIGANDI RADIOATTIVI
Negli ultimi anni il molecular imaging si è dimostrato un utile strumento biomedico che consente la visualizzazione, la caratterizzazione e la quantificazione dei processi biologici
che si verificano a livello cellulare e subcellulare applicabile direttamente su organismi viventi, incluso l’uomo. I processi biologici possono così essere studiati nel loro autentico ambiente fisiologico.
Il molecular imaging permette di monitorare la progressione di una patologia in uno specifico paziente consentendo un approccio di terapia personaliz zata. La risposta ad un trattamento farmacologico è differente da individuo a individuo e dipende da vari fattori (corredo genetico, qualità di vita, dieta). L’utilizzo di una terapia personalizzata risulta quindi utile nella diagnosi, nel trattamento e nella prevenzione di una patologia. Una terapia personalizzata è resa possibile da queste nuove tecniche che consentono il monitoraggio di eventi che avvengono a livello molecolare prima ancora che si verifichino i primi sintomi. Il molecular imaging è anche un utile strumento non invasivo nella diagnosi e nel monitoraggio di patologie cardiache, di varie forme tumorali e di alcuni disturbi neurologici. Comprende differenti modalità e tecnologie come ad esempio la medicina nucleare (PET, CT/PET, SPECT), la ri sonanza magnetica nucleare, gli ultrasuoni. Alcune di queste tecniche prevedono l’utilizzo di probes molecolari.
Con il termine di probes molecolari si indicano ligandi utili per la determinazione o caratterizzazione di un recettore mediante varie tecniche chimico-fisiche.
Esempi di probes molecolari sono i ligandi radioattivi e i ligandi fluorescenti, oppure ligandi in grado di formare un legame covalente con opportuni costituenti recettoriali (affinity labels).
PET e Radioligandi
Lo sviluppo della tomografia ad emissione di positroni (PET), grazie all’utilizzo dei radioligandi ha facilitato la localizzazione e lo studio dell’espressione del TSPO nei topi, nei primati e anche nell’uomo.
La PET è una delle principale tecniche di imaging nel campo della radiologia e della medicina nucleare. Questa tecnica fornisce informazioni solo di tipo fisiologico e si basa sull’emissione di radiazioni gamma dal corpo del paziente a seguito dell’iniezione di opportuni radioligandi. Pur essendo una tecnica efficiente nella determinazione della presenza di tumori, la PET fornisce informazioni solo di tipo qualitativo. Per rendere quantitativa l’indagine PET occorre una precisa mappatura dei coefficienti di assorbimento all’interno del corpo del paziente e ciò è possibil e ricorrendo alla fusione dell’immagine CT (Computed Tomography) e di quella PET (CT/PET). Il campo di applicazione della PET è la Medicina Nucleare.
La diagnostica PET si basa sulla somministrazione al paziente di un radiofarmaco, che si distribuisce nel corpo a seconda della sua composizione chimica e dell’attività
metabolica nei vari organi di quella particolare sostanza.
Alcune molecole del farmaco iniettato contengono radioisotopi
marcatori nei cui nuclei si ha un’eccessiva presenza di protoni
rispetto ai neutroni: ciò causa un decadimento b+,
schematizzato nel modo seguente:
Z
X →
Z-1X* + e
+
Il nucleo finale può trovarsi in uno stato metastabile (contrassegnato dall’asterisco) con conseguente emissione di un fotone per decadimento. Ogni positrone emesso, dopo aver subito un rafreddamento dovuto a successive interazioni coulombiane nel tessuto, annichilisce con un elettrone emettendo due fotoni con direzione di volo opposte formando un angolo di 180° a 511 keV secondo la reazione:
e
++ e
-→
g
+
g
I due fotoni emessi vengono rivelati da opportune matrici di rivelatori, le quali possono essere arrangiate in modo planare su un supporto rotante, o su anelli. Tramite coincidenza elettronica, è possibile determinare se due fotoni, incidenti su due rivelatori opposti, sono stati emessi nell’annichilazione della medesima coppia elettrone-positrone.
Alcuni dei traccianti radioattivi utilizzati in PET sono
1 1C (T1 / 2 = 20 min), 1 3N (T1 / 2 = 10 min), 1 5O (T1 / 2 = 2 min), 1 8F
(T1 / 2 = 110 min). La brevità della vita media di questi isotopi
b+ emittenti garantisce un basso livello di dose rilasciata al
paziente, ma causa la necessità di un ciclotrone in -loco, o comunque non lontano, per la loro utilizzazione. Per studi che
necessitano diversi giorni di osservazione, si usa l’isotopo 1 2 4I
(T1 / 2 = 4,1 gg).
Una delle caratteristiche che rende così importante la PET per gli studi fisiologici, è la sua capacità di individuare variazioni metaboliche nanomolari, tipiche degli organismi e delle funzionalità cellulari.
Le maggiori applicazioni dell’imaging PET sono la detezione dei tumori al cervello, seno, cuore e polmoni. In neurologia, la PET è particolarmente indicata per la sua capacità di mostrare l’attività dei neurorecettori, i quali hanno
una concentrazione troppo bassa (mol, o inferiore) per essere investigata con altre tecniche diagnostiche.
La PET presenta però anche alcuni limiti . Il range medio percorso dai positroni prima di annichilire è, in acqua (che è il maggior componente dei tessuti biologici), di circa 1 -2 mm, e varia a seconda del particolare radionuclide usato. Ciò comporta una degradazione nella risoluzione spaziale dell’immagine, poichè la rivelazione dei fotoni in coincidenza
elettronica porta alla determinazione del punto di
annichilazione della coppia, e non del punto in cui il positrone viene emesso. Questo è il cosiddetto effetto range. Inoltre l’emissione dei fotoni di annichilazione non avviene esattamente back-to-back, ma si ha una piccola deviazione
angolare. Tenendo conto del solo moto termico de lle particelle
si dovrebbe avere emissione dei fotoni a 180° ± 0.25° ma ciò non concorda con i risultati sperimentali. In effetti, la deviazione angolare è maggiore ed è dovuta all’instaurarsi di uno stato legato elettrone-positrone, chiamato positronio. Tale stato legato può interagire con elettroni esterni, annichilando con essi (pick-off) e provocando l’aumento della dispersione angolare dei fotoni (Figura 5).
Effetto range Deviazione angolare Figura 5
Le distorsioni dell’immagine dovute all’effetto range e alla deviazione angolare non sono matematicamente rimovibili, e costituiscono una limitazione fondamentale della PET. Tuttavia, la loro entità è tale da essere trascurata se non si usano tomografi con elevata risoluzione spaziale, o distanze elevate tra rivelatori e paziente.
La tecnica PET può essere utilizzata per marcare il TSPO attraverso specifici radioligandi consentendo così il controllo della progressione delle malattie ad esso associate e la determinazione dell’effetto che esercita la terapia in tali
patologie (ad esempio patologie neuroinfiammatorie).
L’utilizzo di radioligandi specifici per il TSPO e della tecnica PET consente la visualizzazione di una eventuale perdita neuronale e della gravità della neuroinfiammazione e ciò può essere un valido strumento per determinare un differente trattamento per uno specifico paziente. Inoltre grazie alla localizzazione della microglia attivata è possibile anche
determinare lo stadio della malattia.[ 5 ]
Il PK11195 è stato il primo ligando per il TSPO ad essere radiomarcato ad utilizzato per il diagnostic imaging per evidenziare alcune patologie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer, di Hungtinton, il Parkinson e la sclerosi multipla; tuttavia, la visualizzazione del recettore a livello cerebrale nel primate si è dimostrata spesso insoddisfacente in quanto l’uptake del radioligando a questo livello non è sufficiente per un’analisi quantitativa.
Nel 1998 è stata sintetizzata una nuova classe di composti acetamidici altamente affini per il TSPO. Fra questi sono stati scelti due ligandi, il DAA1106 e il DAA1197, in grado di oltrepassare la barriera ematoencefalica nel ratto, da
distribuzione del recet tore a livello cerebrale grazie all’utilizzo della tecnica PET. E’ stato osservato sul ratto che
questi [1 1C]ligandi si distribuiscono soprattutto nel bulbo
olfattorio e nel cerebellum, due regioni con un’alta densità di tale recettore. Questo legame si è dimostrato selettivo in quanto la co-somministrazione di composti non radiomarcati
affini per il TSPO, riduce il legame dei [1 1C]ligandi in
entrambe le regioni. Attraverso l’utilizzo di questi ligandi radiomarcati e della PET è stato possibile effettuare studi di binding in vivo su cervello di primate e di valutare la percentuale non metabolizzata dei composti presente sia a
livello cerebrale che plasmatici.[ 7 ]
Come già descritto in precedenza i composti
pirazolopirimidinici, in particolare DPA713 e DPA71 4, sono altamente affini al TSPO, in misura maggiore del PK11195. In un recente studio è stato pensato di radiomarcare DPA713 con
[1 1C] per valutare in vivo sul primate la distribuzione del
TSPO. Esperimenti su modelli di ratto affetti da
neurodegenerazione hanno evidenziato che questo composto
possiede delle proprietà di imaging migliori rispetto al [1 1
C]-PK11195 esibendo inoltre un signal-to-noise maggiore che
consente una quantificazione più precisa del recettore.[ 8 ]
N CH3 O O [11CH 3] DAA1106 O F O CH3 11CH 3 N N CH3 CH3 O Cl [11CH3] PK11195 11CH 3 N N H3C N N CH3 CH3 O O [11CH 3] DPA713 CH3 11CH 3
Negli ultimi anni, le
N,N-dialchil-2-fenilindol-3-ilgliossilamidi (fig.4) sono state descritte come una serie di potenti e selettivi ligandi per il TSPO con valori di Ki nell’ordine del nanomolare. Tali composti da un punto di vista conformazionale sono analoghi derivati dell’indoloacetamide FGIN-1 (fig.3).
L’alta affinità di tali composti ha recentemente permesso lo sviluppo di nuovi probes molecolari utili per lo studio della localizzazione e del livello di espressione del TSPO nei tessuti di interesse, dando luogo ad una linea di sviluppo di nuovi radioligandi per il TSPO a partire da questa classe di precursori.
I dati relativi alle relazioni struttura attività in accordo
precedentemente descritto, suggeriscono che l’N-H indolico non dovrebbe essere coinvolto nel legame con la proteina recettoriale (fig.4). A partire da questa ipotesi sono stati, quindi, sviluppati una serie di derivati 2 -fenil-indol-3-ilgliossilamidi di formula generale II, portanti un gruppo metilico sull’atomo di azoto indolico (fig.4). Tali derivati N-metilati sono risultati essere, come previsto, ligandi ad alta
affinità per il TSPO[ 9 ].
Questi composti, grazie alla presenza del gruppo metilico sull’ azoto indolico, sono suscettibili di marcatura
con [1 1C], (t1 /2 = 20.4 min) e tramite l’utilizzo della tecnica PET
possono essere impiegati come utili strumenti diagnostici.
L’affinità di legame dei nuovi derivati N1-metilati (8-20)
recentemente sintetizzati, espressa in valori di Ki, è riportata in tabella 1 insieme ai valori di Ki dei ligandi standard (1,2 e
3) del TSPO. Inoltre sono riportati per confronto anche i valori
di affinità di legame degli omologhi N -demetilati (1d, 1e, 1g,
1i, 1n, 1p, 1v, 1hh, 1ttt, 1vvv) .
Tutti i composti recentemente sintetizzati sono risultati potenti ligandi per il TSPO con valori di Ki nell’ordine di grandezza del nanomolare. L’inserimento del gruppo metilico
in posizione N1 non influenza significativamente il legame al
TSPO, infatti, la maggior parte dei derivati 8-20 mostra valori di Ki nell’intervallo compreso tra 0,3 e 60 nM, valori, essenzialmente comparabili con quelli dei loro omologhi n on sostituiti 1d, 1e, 1g, 1i, 1n, 1p, 1v, 1hh, 1ttt e 1vvv. L’unica eccezione si rileva per il composto 13 che mostra una bassa affinità (Ki 190 nM). Al contrario i composti 9 e 10 possiedono la più alta affinità di tutta la serie (Ki = 0,30 nM ) rispettivamente 25 e 4,6 volte maggiore dei risp ettivi omologhi
Questi risultati perciò concordano con l’ipotesi precedentemente enunciata, con l’ausilio del modello farmacoforo recettore, tramite la quale si supponeva che l’NH indolico non fosse coinvolto nel legame con la proteina recettoriale.
In conclusione, da tale studio, si evince che l’alta affinità di questi nuovi composti N-metilati fa di essi degli ottimi candidati per lo sviluppo di nuovi radioligandi per il TSPO.
La scelta del migliore candidato a essere radiomarcato
con il [1 1C] tra i derivati è stata fatta sulla base di due requisiti
principali: un’ alta affinità di legame verso il TSPO, in modo da avere bassi livelli di legami aspecifici , e un adeguato
rapporto lipofilia/idrofilia tale da permetterne
l’attraversamento della barriera ematoencefalica (BEE), quindi la loro entrata nel tessuto nervoso centrale. Sulla base di questi due parametri è stato, quindi, selezionato il composto
20 come ligando della nuova serie, che mostra la migliore
combinazione di affinità di legame (Ki 5,7 nM) e lipofilia
(cLogP 3,95) per essere radiomarcato con il [1 1C] e valutato
come radioligando per il TSPO in vivo.
A tal proposito il composto 20 è stato radiomarcato e, una volta somministrato, ha rapidamente superato la BEE e raggiunto il cervello delle scimmie sottoposte allo studio , dando un’ elevata percentuale di legame specifico rev ersibile
nei confronti del TSPO [ 9 ]. Questo ha suggerito quindi la
possibilità di cercare e sviluppare nuovi radioligandi da questa nuova classe strutturale.
Tabella1. Dati di binding dei derivati 2-arilindol-3-ilgliossilamidi 1a-20 [ 6 ,9 ] N R6 O N O R1 R2 R4 R3 R5 N R1 R2 R3 R4 R5 R6 PBR[a] Ki (nM) CBR[b] 1 9.300.50 2 23.03.1 3 0.5-7 1a (CH2)2CH3 H H H H H 81580 3293381 1b (CH2)3CH3 H H H H H 116799 12% 1c CH2CH3 CH2CH3 H H H H 43.04 1d (CH2)2CH3 (CH2)2CH3 H H H H 12.21.0 16% 1e (CH2)3CH3 (CH2)3CH3 H H H H 7.500.7 3% 1f (CH2)4CH3 (CH2)4CH3 H H H H 16.02.0 3% 1g (CH2)5CH3 (CH2)5CH3 H H H H 1.400.2 10% 1h CH(CH3)2 CH(CH3)2 H H H H 1039.0 1i CH(CH3)CH2CH3 CH(CH3)CH2CH3 H H H H 17.02.0 5% 1j CH2CH3 CH2C6H5 H H H H 11.01.0 1k (CH2) H H H H 2400125 4% 1l (CH2) H H H H 66530 3% 1m (CH2) H H H H 33.03.0 3% 1n (CH2)2CH3 (CH2)2CH3 F H H H 4.280.32 4.3% 1o (CH2)3CH3 (CH2)3CH3 F H H H 2.400.81 0% 1p (CH2)5CH3 (CH2)5CH3 F H H H 0.370.13 0% 1q (CH2)CH3 CH2C6H5 F H H H 1.680.12 10% 1r (CH2)2CH3 (CH2)2CH3 Cl H H H 4.650.52 14% 1s (CH2)3CH3 (CH2)3CH3 Cl H H H 1.000.27 0% 1t (CH2)5CH3 (CH2)5CH3 Cl H H H 0.550.19 4.2% 1u CH2CH3 CH2C6H5 Cl H H H 1.300.15 7.3% 1v (CH2)2CH3 (CH2)2CH3 NO2 H H H 0.950.1 1w (CH2)3CH3 (CH2)3CH3 NO2 H H H 0.230.07 1x (CH2)5CH3 (CH2)5CH3 NO2 H H H 0.270.10 1y CH2CH3 CH2C6H5 NO2 H H H 1z (CH2)2CH3 (CH2)2CH3 CF3 H H H 1.690.2 1aa (CH2)3CH3 (CH2)3CH3 CF3 H H H 1.160.1 1bb (CH2)5CH3 (CH2)5CH3 CF3 H H H 1cc CH2CH3 CH2C6H5 CF3 H H H 1dd (CH2)2CH3 (CH2)2CH3 CH3 H H H 5.500.98
1ee (CH2)3CH3 (CH2)3CH3 CH3 H H H 3.800.91 1ff (CH2)5CH3 (CH2)5CH3 CH3 H H H 1.600.13 1gg CH2CH3 CH2C6H5 CH3 H H H 1.330.2 1hh (CH2)2CH3 (CH2)2CH3 H H H F 2.670.48 1ii (CH2)3CH3 (CH2)3CH3 H H H F 4.000.15 1jj (CH2)5CH3 (CH2)5CH3 H H H F 0.370.12 1kk CH2CH3 CH2C6H5 H H H F 1ll (CH2)2CH3 (CH2)2CH3 H H H Cl 2.800.3 1mm (CH2)3CH3 (CH2)3CH3 H H H Cl 4.910.4 1nn (CH2)5CH3 (CH2)5CH3 H H H Cl 58.46 3% 1oo CH2CH3 CH2C6H5 H H H Cl 4.60.5 1pp (CH2)2CH3 (CH2)2CH3 H H H NO2 20.22.02 0% 1qq (CH2)3CH3 (CH2)3CH3 H H H NO2 21.62.15 1% 1rr (CH2)5CH3 (CH2)5CH3 H H H NO2 30.39.15 0% 1ss CH2CH3 CH2C6H5 H H H NO2 18.30.15 0% 1tt (CH2)2CH3 (CH2)2CH3 H H H OCH3 32845 8.6% 1uu (CH2)3CH3 (CH2)3CH3 H H H OCH3 65.23.4 8.8% 1vv (CH2)5CH3 (CH2)5CH3 H H H OCH3 35.58.7 7.2% 1xx CH2CH3 CH2C6H5 H H H OCH3 69.53.6 5.7% 1yy (CH2)2CH3 (CH2)2CH3 F H H Cl 2.830.80 14% 1zz (CH2)3CH3 (CH2)3CH3 F H H Cl 3.050.45 17% 1aaa (CH2)5CH3 (CH2)5CH3 F H H Cl 7.751.55 1bbb CH2CH3 CH2C6H5 F H H Cl 4.010.26 9.7% 1ccc (CH2)2CH3 (CH2)2CH3 F H H F 6.731.39 1ddd (CH2)3CH3 (CH2)3CH3 F H H F 1eee (CH2)5CH3 (CH2)5CH3 F H H F 1fff CH2CH3 CH2C6H5 F H H F 1.670.37 1ggg (CH2)2CH3 (CH2)2CH3 Cl H H Cl 0.620.06 1hhh (CH2)3CH3 (CH2)3CH3 Cl H H Cl 1.90.2 1iii (CH2)5CH3 (CH2)5CH3 Cl H H Cl 5.80.6 1jjj CH2CH3 CH2C6H5 Cl H H Cl 3.30.3 1kkk (CH2)2CH3 (CH2)2CH3 H H Cl H 141.5 0% 1lll (CH2)3CH3 (CH2)3CH3 H H Cl H 3.40 1% 1mmm (CH2)5CH3 (CH2)5CH3 H H Cl H 2.40.3 0% 1nnn CH2CH3 CH2C6H5 H H Cl H 5.00.4 0% 1ooo (CH2)2CH3 (CH2)2CH3 H H CH3 H 253 1ppp (CH2)3CH3 (CH2)3CH3 H H CH3 H 60.60 1qqq (CH2)5CH3 (CH2)5CH3 H H CH3 H 1.900.20 1rrr CH2CH3 CH2C6H5 H H CH3 H 2.300.20 1sss CH3 CH2CH3 H H H H 940120 15% 1ttt CH3 (CH2)3CH3 H H H H 53.34 1uuu CH3 (CH2)5CH3 H H H H 12.61 1vvv CH2CH3 (CH2)3CH3 H H H H 12.11 1www CH3 CH2CH3 Cl H H Cl 9.541.29 15% 1xxx CH3 (CH2)3CH3 Cl H H Cl 0.150.02 1yyy CH3 (CH2)4CH3 Cl H H Cl 0.180.02 1zzz CH2CH3 (CH2)3CH3 Cl H H Cl 8 (CH2)2CH3 (CH2)2CH3 H CH3 H H 19.51.5 9 (CH2)3CH3 (CH2)3CH3 H CH3 H H 0.3000.050 10 (CH2)5CH3 (CH2)5CH3 H CH3 H H 0.2990.050
12 CH2CH3 CH2C6H5 H CH3 H H 2.920.30 13 CH3 (CH2)3CH3 H CH3 H H 19010 14 CH3 (CH2)4CH3 H CH3 H H 38.24.0 15 CH3 CH2C6H5 H CH3 H H 20.91.8 16 (CH2)2CH3 (CH2)2CH3 H CH3 H F 23.72.1 17 (CH2)2CH3 (CH2)2CH3 F CH3 H H 19.82.0 18 (CH2)5CH3 (CH2)5CH3 H CH3 H H 1.070.11 19 CH3 CH2C6H5 H CH3 H H 6.770.50 20 (CH2)2CH3 (CH2)2CH3 NO2 CH3 H H 5.700.45
[a] La concentrazione dei composti saggiati che inibisce il 50% del legame del [3H]PK1195 nelle
membrane mitocondriali delle di rene di ratto(IC50) è ststa determinata mediante analisi log-probit
utilizzando 6 concentrazioni diverse del composto. I valori di Ki sono medie SEM di 3
determinazioni. [b] Le percentuali di inibizione del legame specifico del [ 3H]Ro151788 ad
una concentrazione 10 M del composto sono medie SEM di 5 determinazioni. I valori di
![Figura 1 Proteina Traslocatrice (18kDa) (TSPO) [ 3 ]](https://thumb-eu.123doks.com/thumbv2/123dokorg/7550093.109286/3.892.264.676.717.1055/figura-proteina-traslocatrice-kda-tspo.webp)
