CAPITOLO 5
5. Risultati
5.1. Controllo della presenza del trasgene nelle piante trasformate.
Tutti i campioni analizzati per mezzo di una PCR con primer specifici per il costrutto genico inserito, mostrano una banda in corrispondenza del peso molecolare atteso, anche se i campioni 1, 2, 7 e 11 mostrano una bassa efficienza di amplificazione, e nel campione 6 la banda è quasi non rilevabile. Questi campioni non sono stati presi in considerazione per le successive analisi. È da notare che il campione non trasgenico (DNA della pianta non trasformata), come atteso, non presenta la banda di amplificazione.
Figura 1. Gel elettroforetico di Agarosio all’1% sul quale sono stati caricati 20µl della reazione
PCR con primer CalHSP5’int e AtHSP70int ter. Frammento atteso: 500 bp. Pozzetti 1-25 DNA da piante di tabacco selezionate su kanamicina; 1bis DNA plasmidico del clone ptTopo1bis; NT Dna da pianta di tabacco non transgenica
1 2 3 4 5 6 7 8 9 1Kb 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
L’amplificazione degli stessi campioni con i primer specifici per nad5 ha dato una banda di amplificazione di circa 400 basi in tutti i campioni analizzati che
corrisponde al peso molecolare atteso (figura 2).
Figura 2. Gel elettroforetico di Agarosio all’1% sul quale sono stati caricati 20µl della reazione
PCR con NAD F e NAD R. Frammento atteso : 400 bp
5.2 Analisi dell’espressione del costrutto CalHSP70.
14 piante transgeniche, scelte tra quelle positive all’analisi PCR che presentavano una sviluppo maggiore, sono state selezionate per l’estrazione dell’RNA. In dettaglio sono stati scelti i cloni identificati dalle sigle: 3, 4, 5,12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 23 e 24. I campioni di RNA sono stati visualizzati caricando 1 µl dell’estratto su un 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1kb 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
1 KB 13 15 16 20 22 25 1KB 3 4 5 12 17 18 19
1KB controllo 1KB 21 23 24
Figura 3 separazione elettroforetica su gel di agarosio all’1% dell’RNA totale estratto da piante di
tabacco transgeniche. Per ogni campione è stato caricato 1µl di RNA
Di seguito vengono riportate le curve standard e le curve di amplificazione ottenute amplificando rispettivamente i campioni con i primer e la sonda specifici per il 18 s (A) e HSP70 (B). Entrambe le curve hanno una pendenza che rientra all’interno dei limiti teorici e tutti i campioni da analizzare rientrano all’interno dei punti del campione standard.
Standard Curve Graph for FAM-490
18 S
HSP70
I dati ottenuti sono stati utilizzati per calcolare l’espressione del gene HSP70 normalizzandola rispetto al corrispondente 18s. Nell’esperimento sono stati inseriti anche 2 campioni di RNA di Arabidopsis (ricordiamo che il gene inserito in tabacco è un gene HSP70 inducibile isolato da Arabidopsis). Il campione denominato
Arabidopsis AA è un RNA di Arabidopsis non sottoposto a shock termico mentre il
campione AL è stato sottoposto a shock termico a 50°C x 60 min.
Campioni Media HSP/media
18s) s (HSP/18s) Tab 3 0,0118 0,0017 Tab 4 0,0297 0,0078 Tab 15 0,0802 0,0075 Tab 16 0,0138 0,0068 Tab 19 6,1096 1,4159 Tab 20 0,0026 0,0007 Tab 12 0,1093 0,0389 Tab 13 0,0153 0,0052 Tab 22 0,0067 0,0019 Tab 24 7,1000 1,1443 Tab 25 0,0015 0,0006 Arabidopsis AL 0,1640 0,0769
Figura 6 Espressione del gene HSP70 normalizzata rispetto al corrispondente 18s
Come si può osservare dall’analisi della grafico riportato nella figura precedente 2 tra le 11 piante transgeniche analizzate mostrano un’espressione considerevole del costrutto CalHSP70. I primer utilizzati sono specifici per il transgene inserito e anche se in tabacco è presente il gene endogeno per l’HSP70 questi non viene amplificato dai primers utilizzati come dimostra il dato sul campione di tabacco non trasformato (Tab CTRL) che mostra espressione nulla del gene HSP70.
I campione di Arabidopsis AA (campione non sottoposto a shock termico) mostra, come atteso, una espressione irrilevante mentre sottoponendo le piantine di
Arabidopsis a shock termico(AL) l’espressione aumenta di 4 volte.
I livelli di espressione nei diversi eventi di trasformazione di tabacco-HSP70 sono molto variabili e vanno da 0 a 7, valore di gran lunga superiore a quello ottenuto in
Arabidopsis sottoponendo le piantine a stress termico.
Tabacco HSP/18s 0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00 10,00
Tab 3 Tab 4 Tab 15 Tab 16 Tab 19 Tab 20 Tab 12 Tab 13 Tab 22 Tab 24 Tab 25
Arabidopsis AL Arabidopsis AA
Tab ctrl
samples
5.3. Determinazione dell’accumulo delle protiene
Nella figura pagina 89, è riportato il risultato del gel SDS.-PAGE e del Western blot effettuato sui campioni transgenici di tabacco. Come già puntualizzato i campioni 13, CTRL-s e 3-s appaiono meno concentrati su gel SDS-PAGE colorato con Comassie. Negli altri campioni, invece, è possibile evidenziare una concentrazione omogenea. Dall’analisi del western blot, però, non abbiamo notate differenze nell’accumulo delle proteine HSP70 tra le piante transgeniche e il controllo non trasformato né tanto meno osserviamo differenze tra i campioni di proteine microsomiali e le corrispondenti proteine HSP70 citoplasmatiche. Inoltre sul WB notiamo in tutti i campioni, eccetto in 16s e 20s, la presenza di 2 bande molto vicine. La più bassa ha lo stesso peso molecolare della nostra proteina di controllo (costituita dal gene HSP70 espresso in E.coli) mentre la seconda ha un peso molecolare leggermente più alto. Bisogna comunque tenere conto che l’analisi Western non è propriamente un’analisi quantitativa e possiamo supporre che l’intensità di banda sia arrivata già a saturazione e quindi non possiamo apprezzare le differenze nel contenuto in HSP70 tra i diversi eventi di trasformazione. Inoltre l’anticorpo utilizzato non riesce a discriminare tra la forma inducibile e la forma costitutiva dell’HSP70 per cui non possiamo discriminare quanta HSP70 sia attribuibile all’espressione del transgene. Questo dato ha bisogno di ulteriore conferma tarando la quantità di proteine totali per riuscire ad apprezzare le differenze tra i controlli non transgenici ed i transgeni.
Ladder CTRL Ctrl -s 13 15 12 4 3 3-s Proteina HSP70 Ladder CTRL 16 -s 24 25 22 20 16 20 -s Proteina HSP70 A B
Figura 7 SDS-PAGE e Western Blot su 10 eventi di trasformazione indipendenti di tabacco ed il
controllo non transgenico (CTRL). Proteine microsomiali e citoplasmatiche (come descritto nel corpo della tesi) sono state caricate su gel di PAA e separate mediante elettroforesi. Le proteine sono state trasferite su membrana PVDF e fatte reagire con un anticorpo policlonale ottenuto immunizzando i conigli con il gene HSP70 espresse in E. coli.
