3. MATERIALI E METODI

3. MATERIALI E METODI

3.1 Reagenti.

La γ-Glutammil-7-amido-4-metilcumarina (γGluAMC, G7261), la Glicilglicina (GlyGly, G1002) e tutti i reagenti chimici sono stati acquistati dalla Sigma-Aldrich (Italia).

3.2 Soggetti partecipanti allo studio.

Come popolazione sana di controllo sono stati reclutati 200 soggetti donatori di sangue ai quali, previo consenso informato, è stato prelevato al momento della donazione un campione di sangue per effettuare le misurazioni. I 200 soggetti sono ripartiti in 100 uomini fra 21 e 64 anni con età media di anni 44 (SD 10) e 100 donne fra 20 e 64 anni con età media di anni 40 (SD 11); fra di essi 59 uomini e 96 donne hanno dichiarato di essere astemi, mentre 41 uomini e 4 donne riportano un consumo giornaliero di alcool ai pasti non superiore ai 40 g. I valori di attività plasmatica di GGT per gli uomini sono compresi fra 8 e 107 U/L, media 30.6 U/L (SD 17,5) e per le donne fra 7 e 43 U/L, media 16.1 (SD 6,9). La presenza di malattie acute o croniche è stata eslcusa attraverso l’esame della storia clinica di ciascun soggetto e gli esami di laboratorio. Dallo studio erano stati precedentemente esclusi 70 soggetti (37 uomini e 33 donne) sotto trattamento farmacologico per varie patologie al momento del prelievo.

medio di GGT di 228 U/L (SD 466). 14 di essi risultano bevitori al momento del prelievo mentre 16 soggetti riferiscono astinenza da 2 a 4 settimane. Lo studio è stato approvato dal Comitato Istituzionale di Bioetica e tutti i soggetti hanno dato il loro consenso informato a essere inclusi nello studio stesso.

3.3 Analisi di laboratorio.

In tutti i campioni ottenuti è stato eseguito l’esame emocromo-citometrico e sono stati analizzati i valori di glucusio, emoglobina, creatinina, acido urico, colesterolo totale, colesterolo HDL, trigliceridi, aspartato amminotransferasi (AST), alanina amminotransferasi (ALT), bilirubina (totale, diretta e indiretta) secondo le procedure del laboratorio di analisi chimico-cliniche, utilizzando analizzatori automatici (Beckman Synchron CX 9-PRO, Abbott Cell-Dyn Saphire per la conta dei globuli rossi). I valori di colesterolo LDL e di clearance della creatinina sono stati calcolati usando rispettivamente la formula di Friedewald e la formula di Cockcroft-Gault.

3.4 Determinazione delle frazioni plasmatiche di GGT.

Il prelievo di sangue per l’analisi della GGT è stato eseguito in provette sottovuoto contenenti EDTA come anticoagulante ed antiossidante. Il plasma è stato ottenuto centrifugando il campione a 1500 g per 15 minuti a temperatura ambiente ed è stato conservato a -20°C.

La determinazione dell’attività totale della GGT e delle sue frazioni è stata eseguita con un sistema FPLC (AKTA purifier, GE healthcare) utilizzando una

colonna per cromatografia ad esclusione molecolare (Superrose 6HR 10/300 GL, GE Healthcare) che consente di separare le componenti plasmatiche in base al loro peso molecolare (Franzini et al., 2008). Le frazioni di GGT sono state separate attraverso un’eluizione isocratica, al flusso di 0,5 ml/min, con un tampone sodio fosfato 0,1 mol/L (pH 7,4) contenente NaCl 0,2 mol/L, EDTA 0,1 mmol/L e GlyGly 5,4 mmol/L. Per poter determinare in continuo l’attività di GGT a valle della colonna, attraverso una connessione a T, all’eluato della gel filtrazione è stata continuamente aggiunta una soluzione contenente il substrato fluorescente per la GGT, γ-Glutammil-7-amido-4-metilcumarina (γGluAMC), rilasciata al flusso di 0,1 mL/min. La miscelazione dell’eluato dalla colonna con il substrato della GGT avviene in una spira con volume di 2,6 ml (corrispondente ad un’incubazione di circa 4 minuti) posta in un bagnetto termostatico a 37°C.

Poichè l’accettore della reazione catalizzata dalla GGT è incluso nella fase mobile, la presenza dell’enzima è visualizzata attraverso la liberazione del composto fluorescente amminometilcumarina (AMC) secondo la reazione:

γ-Glu-AMC + GlyGly

→

Il prodotto AMC è rilevato tramite un fluorimetro operante a una lunghezza d’onda di eccitazione di 380 nm e di emissione di 440 nm.La soluzione madre di γGluAMC è stata preparata alla concentrazione di 4,5 mmol/L in etanolo 30% w/w contenente NaOH 0,005N e conservata a una temperatura di -20° C. Questa soluzione è stata diluita giornalmente 25 volte in tampone Tris-HCl 0,25 M, pH 8,5 (25°C).

L’intensità di fluorescenza del segnale è espresso in unità arbitrarie di fluorescenza (f.u.) e l’area sotto i picchi è proporzionale all’attività di GGT

Pompa FPLC

Es

cl

u

si

on

e

Mole

co

la

re

V_inj= 100 µL, plasma diluito 1:4

Spira di reazione

Spettrofluorimetro

Pompa post-iniezione

γ-Glutammil-7-

A

mido-4-

M

etil

C

umarina

Glu-

AMC

GGT

AMC

FIGURA 3.1 Schema delle componenti dello strumento per la

separazione e la determinazione dell’attività totale di GGT e delle sue frazioni.

3.5 Quantificazione delle frazioni di GGT.

L’attività totale di GGT, espressa in U/L, è stata calcolata in base ad una curva di calibrazione ottenuta dal grafico nel quale è stata riportata l’area totale (f.u. x ml) sottesa al cromatogramma dell’attività di GGT dei 200 soggetti sani in funzione dell’attività totale del plasma iniettato (fattore di sensibilità ± SD = 4.62 ± 0.06 area x L x U-1; intercetta ± SD = 16.4 ± 1.6 area; r2 = 0.96, P < 0.0001).

L’area delle frazioni di GGT è stata calcolata con l’aiuto del software MATLAB (Version 7 MathWorks, Inc.). Il programma permette di descrivere ogni picco con una curva Gaussiana modificata esponenzialmente, per ogni curva sono stati definiti gli intervalli di variazione dell’altezza, della larghezza a metà altezza, della posizione e della asimmetria. L’area è stata calcolata utilizzando un algoritmo non lineare di minimizzazione dei minimi quadrati, la somma delle quattro curve così ottenute corrisponde al cromatogramma registrato.

3.6 Statistica.

I parametri biologici e i valori delle frazioni di GGT fra uomini e donne sani sono stati confrontati con il test t di Student; per eseguire un’analisi statistica parametrica, ai valori di trigliceridi e di b-, m- e s-GGT è stata applicata la trasformazione logaritmica naturale (ln) per ridurre l’asimmetria della distribuzione. La deviazione dalla distribuzione gaussiana dell’attività di GGT totale e delle frazioni nei soggetti sani è stata misurata usando il test di Kolmogorov-Smirnov con i valori di P di Dallal-Wilkinson-Lilliefor. L’associazione tra le variabili biologiche misurate e l’attività delle frazioni di GGT è stata stimata con l’analisi di regressione

lineare, il grado di correlazione tra le suddette variabili è espresso con il quadrato del coefficiente di correlazione di Pearson (r2). Il confronto statistico fra i valori delle frazioni di GGT dei soggetti sani e degli alcolisti è stata eseguito con il test ANOVA a una via (Kruskal-Wallis test) seguito dal test di Dunn per il confronto multiplo. Una correlazione con un P <0.05 è stata considerata significativa.