INDICE
Riassunto I
Abstract
IV1. INDRODUZIONE
1.1 L’ematopoiesi ... pag. 1 1.2 Le cellule staminali... pag. 5 1.2.1 Le cellule staminali embrionali (ES)………... pag. 6 1.2.2 Le cellule staminali adulte……….. pag. 9 1.2.3 Le cellule staminali neurali (NSC)………... pag. 14 1.2.4 Le cellule staminali mesenchimali (MSC) ……….. pag. 16 1.2.5 Le cellule staminali ematopoietiche (HSC) ………... pag. 18
1.3 L’ontogenesi del sistema ematopoietico………. pag. 27 1.4 I fattori di crescita ……….. pag. 34 1.5 Altri regolatori dello sviluppo……….… pag. 42 1.6 I fattori di trascrizione nell’ematopoiesi…….……….… pag. 47 1.7 I geni contenenti HMG box ……….………...… pag. 63 1.7.1 I fattori di trascrizione Sox ……….. pag. 66 1.7.2 Le proteine HMG nell’ematopoiesi ………. pag. 72 1.8 Il gene Sox2 ……….………... pag. 75
2. SCOPO DELLA TESI
………....
pag. 80
3. MATERIALI E METODI
3.1 Generazione dei topi ………..………..pag. 82 3.1.1 Topi Sox2 knock down………..………pag. 82 3.1.2 Topi riceventi per saggi di ripopolazione………..…...pag. 83 3.2 Analisi del sangue periferico ………...…...pag. 83 3.3 Saggio clonogenico in metilcellulosa………...pag. 83
3.3.1 Protocollo del saggio clonogenico ………pag. 84 3.4 Colture secondarie di precursori midollari……….………....pag. 86 3.5 Saggi di ripopolazione in vivo a lungo termine………. pag. 86 3.6 Citocentrifuga……… pag. 88 3.7 Preparazione e colorazione dei vetrini……….. pag. 88 3.8 Morfologia……… pag. 89 3.9 Congelamento delle cellule ……….. pag. 89 3.10 Scongelamento delle cellule……… pag. 89 3.11 Reagenti………... pag. 90 3.11.1 IMDM ( Iscove’s modified Dulbecco’s medium)………. pag. 90 3.11.2 Preparazione della metilcellulosa………. pag. 90 3.12 Genotipo delle colonie……… pag. 91
4. RISULTATI
4.1 Analisi comparativa delle cellule mature del sangue di topi wild type,
Sox2 eterozigoti e Sox2 knock down……… pag. 93 4.2 Analisi comparativa dei precursori ematopoietici di topi wild type, Sox2
eterozigoti e Sox2 knock down………. pag. 93 4.3 Colture secondarie di CFU-Mix di topi wild type, Sox2 eterozigoti e
Sox2 knock down... pag. 95 4.4 Saggi di ripopolazione competitiva in vivo a lungo termine…… pag. 96 4.4.1 Analisi comparativa dei topi trapiantati con midolli wild type e
Sox2 knock down……….. pag. 96 4.5 Analisi genotipica delle cellule midollari dei topi trapiantati con diverse
concentrazioni di midolli wild type e midollo Sox2 knock down.pag. 98
