%spike − non − segnalati = 100 rd

neurali

1 Introduzione alle principali tecniche per l'analisi dei treni

di spike neurali

Gli array di elettrodi corticali sono diventati uno strumento molto utilizzato

nellaricercaneuroscientica perchèrendonopossibilelostudiodell'attività si-

multaneadidiversineuroniinregionidierentidelcervello.E'infattiimportan-

tissimotenereinconsiderazionechesoloattraversolaconoscenzadelleattività

contemporaneediregionidiverseèpossibileindagaresulfunzionamentodiaree

diversedelcervello[1].

Inneurosiologiasiregistra,inrispostaadunostimolo,l'attivitàneuraledi

unaopiùareedelcervellochesicredonoesserecoinvolteconil tipodistimolo

fornito. Questo stimolo può essere di varia natura: sico, come un impulso

luminosooppureunsuono,oastrattoocognitivo,comel'eserciziodellamemoria.

Quello che veramente ha importanza è come caratterizzare quantitativamente

larelazionetralostimoloelarispostadelsingolo neurone,oancoramegliodi

ungruppodineuronidatocheorac'èquestapossibilitàutilizzando diarraydi

elettrodi. Capire come agiscono i neuroni in gruppo puòessere indispensabile

alloscopodidenirelafunzionalitàspecicadiuna certaareacerebrale.

1.1 Lo spike sorting: l'identicazione e la classicazione di

un evento spike

Negli esperimenti di neurosiologia, gli spike individuali non sono registrati

direttamente. Questoavvieneperchèquandovengonoimpiantatimoltielettrodi

ilpotenzialeextracellulareregistratoperciascunelettrodorappresental'attività

elettrica istantanea di un numero a priori sconosciuto di neuroni. Da questi

segnaliènecessarioidenticareivaripotenzialid'azioneedanchelaloroorigine

attraversol'usodialgoritmidiclusterizzazioneedottimizzazione[17].

I passi principali dello spike sorting sono quindi tre: identicazione del-

l'eventospike,identicazionedelnumerodineuronicoinvoltinellaregistrazione

elaconseguenteassociazioneneurone-spike;quellochecisiaspettadi ottenere

treni di spikeneurali: (a) il segnaleregistrato; (b)lo spikesorting; (c-

f) possibili misure di associazione tra i treni di spike usando il cross-

correlogramma (c), il JPSTH (d), un modello di tting parametrico

usandolaverosimiglianza(e), lafunzione dicross-coerenza(f)

n-segnali puliti, ciascuno riferendosi al relativo neurone. Lo spike sorting èil

primopassoperl'analisiditrenidispikemultipli. E'necessariotenerepresente

che l'accuratezza di questa fase di elaborazione inuenza notevolmente tutti i

risultatidelleelaborazionisuccessive.

Inletteraturaèpossibiletrovarenumerosialgoritmiperlospikesorting. Non

esiste almomentounalgoritmomiglioredeglialtrielasceltavienefatta sulla

base deltipodiapplicazione(es.,sortingo-line oin temporeale,supervision-

atoononsupervisionato). Diversialgoritmi,applicatiagli stessidati, possono

infatti dare risultatimolto diversi,mettendo in evidenzacome siacomplesso i

problemidi identicazioneeclassicazionedeglispikes.

Leprincipaliproblematicheetecnichediimplementazionedellospikesorting

verrannoanalizzatedettagliatamentenelparagrafosuccessivo.

1.2 Cross-correlogramma e funzione di cross-intensità

La maggiorparte delle tecniche per l'analisi di treni di spike valutano solo le

associazionitracoppiedi neuroniutilizzandotecnichepossonoesseredivisenel

dominiodel tempoeneldominio dellefrequenze.

Ilmetodopiùcomunementeusato neldominio deltempoeil crosscorrelo-

gramma. Datauna coppiaditrenidispikeedunaspecicalarghezzadi bin,il

cross-correlogramma[2]rappresentalacross-covarianzatra i duesegnali . Con

questatecnicasideveassumerecheitrenidispikesianostazionari,ovveroche

le proprietà stocastiche del segnale non varino con il passare del tempo, ma

talvoltaquestaipotesinonèvericata.

Unamisurarelativadell'associazionetraidueprocessipuntualistazionariè

lafunzione di cross-intensità[3]. Questa funzionestima lafrequenza di scarica

diunneuroneperdiversitempidiritardorispettoall'attivitàdiscaricadelsec-

ondoneurone. Sebbenequestatecnicasiastatasviluppataadhocpermisurare

l'associazionetra due processi puntuali, in realtànonviene usata spesso nelle

applicazionineuroscientiche.

1.3 Istogramma JPST(Joint Peri-Stimulus Time

Histogram)

Il JPSTH si può considerarecome l'estensione del PSTH[4 ]. Mentre ilPSTH

tienecontodel numerodegli spikeperunitàdi tempoad uncertotempo t,il

JPSTHèunistogrammabidimensionalecherappresentalacontadeglispikeper

unità ditempoperunneuroneaduntempoue perl'altroad unaltro tempo

v. Ladiagonaleche divideil quadrante mostrailgracoperucoincidentecon

confrontando l'attività) allo scopo di ovviare alla possibilità che due neuroni

conattivitàindipendentemaconunafrequenzadiscaricamoltosimilevengano

associati. Lasommadellediagonalidin-JPSTHproduceilcross-correlogramma

normalizzato.

1.4 Metodi di classicazione del pattern dello spike

Glialgoritmiingradodidistingueredeipatternprecisiditemporizzazionedegli

spike sono spesso usati come metodo per associare tra loro spike train neu-

rali. Loscopodi queste tecniche èvalutareleinterazionineuralidi alto-livello

nell'attivitàdiuna popolazionedineuroni.

Quellochefannoquestialgoritmièmapparelecoincidenzeevalutarestatis-

ticamente sesonopredicibilisottol'ipotesi nullachegliistantidi tempoin cui

avvienel'eventospikesianoindipendenti,poilaricorrenzadiquestecoincidenze

vienestudiatainrelazioneconciòchesisupponeabbiaportatoadaverequella

registrazione.

1.5 Metodi che sfruttano la funzione di verosimiglianza

Il metodo di massimaverosimiglianza("likelihood method") è uno strumento

fondamentale dell'indagine statistica ed è una misura statistica di quanto un

modello proposto si avvicina ai dati sperimentali del sistema che si cerca di

riprodurre. Iparametrichecaratterizzanoilmodellopossonoesserestimatidai

datisperimentali,attraversounaproceduradistimaformalecomeilmetododei

momentiodellamassimaverosimiglianza.

Questimetodi trovanoetroverannosemprepiùspazionelmondodelleneu-

roscienze computazionali, in quanto possono essere utilizzati per una serie di

problematichepropriedell'analisididati,comeilgoodness-of-t,lacostruzione

di intervallidicondenzaopportunienumerositeststatistici.

Lasdarappresentatanell'utilizzodellaverosimiglianzaneimetodiaproces-

sopuntualenell'analisidi trenidispikeneuralimultiplièdatadallapossibilità

chesihadideniremodellimultivariatidiprocessipuntualichesianoingradodi

rappresentarel'attivitàneuraledigruppidineuroni[5]. Inoltreèpossibileusare

latecnicadellamassimizzazionedel likelihoodanche perottimizzare algoritmi

peril ttingdi modelli[6].

1.6 Metodi nel dominio delle frequenze

L'analisisvoltaneldominiodellefrequenzepuòessereeettuata,conl'ipotesidi

coerenzapercoppiedi trenmi di spike. La coerenzaèinfatti unamisura della

correlazione,dipendente dallafrequenza,didue processi.

Itrenidispikepossonoancheesserenonstazionarimadovutiadunostimolo

esterno, in questi casi il segnale può essere analizzato in una nestra mobile

stimandosemprespettroecoerenza(spettrogrammaediagrammidicoerenza).

Innelewavelet,di cuisi parleràin manieradettagliataneicapitolisuccessivi,

sonounimportantestrumentoperlostudiodiquestacategoriadi segnali.

1.7 Decodica del treno di spike

Glialgoritmididecodicasonotecnichematematicheusateinneuroscienzeper

studiare come i treni di spike di un singolo neurone o di una popolazione di

neuronirappresentinostimoliesterniosegnali biologici.

Questotipodi analisi prevede due fasi: una di codicaa cui segueuna di

decodica[7]. Nellaprima fasevienecaratterizzatal'attivitàdi scaricaneurale

come funzione del segnale biologico, mentre nella seconda parte la relazione

viene invertita ed è quindi il segnale che vienestimato dall'attività di scarica

neurale. Perdecodicarel'attivitàdi unneuronepertuttigliistantidi tempo

è necessario calcolare il vettore popolazione (con questo nome ci si riferisce

alprodottoscalare dell'attivitàrelativaaduna notanestra temporaleconla

funzione di scarica di ciascunneurone). Ilvaloredel segnaleperilqualesi ha

il massimodelvettorepopolazionesaràpoipreso comestimadi decodicadel

segnale.

1.8 Teoria dell'informazione

Anchelateoriadell'informazionevieneusatanelleanalisideitrenidispikeneu-

rali. Attraversolavalutazionedell'entropiaèpossibilequanticarelavariabilità

diuntrenodispikeedattraversolavalutazionedellamutuainformazioneèpos-

sibile misurarel'associazionetra due processi, come ad esempiotra due treni

di spikeotrauntrenodi spikeeduno stimolo. Queste tecnichehannotrovato

numeroseapplicazioniperlostudiodella"quantitàdiinformazione"contenuta

in un treno di spike ed usando metodi basati sull'istogramma è possibile sti-

mareempiricamente la curvadella densitàdi probabilitàdegli eventi: usando

queste informazionidiventa quindipossibilemodellareil sistemanervosocome

tanticanalidicomunicazioniconlalibertàdinonfareassunzionisuiritardidel

sistemachesivaesaminando.

Esisteperòunagrossalimitazionecaratteristicadiquestotipodiapproccio:

in attività: (a)le analisidi encodinge leattività; (b) leanalisiperla

decodica con cui si stimano i campi recettivi, che vengono poi usati

peril calcolo della posizionedel ratto. La posizionepredetta riesccea

ricalcarebenequellaosservata.

notaevaquindistimata,tenendoinconsiderazionecheaumentarequestapreci-

sioneimplicaaumentareesponenzialmenteilnumerodidatidaconsiderare. Per

questo motivosièancoralontanidalpoterestenderequesto tipodi approccio

perstimarelamutuainformazionetratrenidispikemultipliesegnalibiologici.

Unapprocciovoltoadestenderequestepotentitecnicheancheperleanalisi

neuroscienticheèdatodallalorounioneconimetodidiverosimiglianza,iquali

fornisconounmodelloprobabilistico delsistemadastudiarerendonoin questo

modopossibilelastima dellamutua informazione,una volta che siconosce la

distribuzionedi densitàdi probabilitàdeglieventi.

2 Introduzione allo spike sorting

Lapossibilitàdiregistrarel'attivitàneuraledalsistemanervosocentraleèpar-

ticolarmenteinteressanteerappresentaunrequisitofondamentaleperlaricerca

dellecaratteristichefunzionalidelcervello.

Ineuronicomunicanoattraversoscaricheelettrichedi piccolaintensità, che

possonoessereregistrateconmicroelettrodi. Inbasealgoalcheilneurosiologo

desidera raggiungere,sipuòeseguireilsortingdeidatiassegnandodeterminati

spike a determinati neuroni con modalità chiamate in gergo tecnico "soft" e

"hard". Nelprimocasoall'assegnamentovieneassociatounvalorerealedazero

nonlosiaccetta(caso crisp).

Inmolticasi l'attivitàdi unasingolaunità puòessereottenutaconunsin-

golo microelettrodo e con una rilevazione così detta "a soglia", ovvero viene

rivelatol'eventospikequandoilsegnaledelpotenzialesuperaunvalorepresta-

bilito. Tuttaviapuòcapitarechenonsiriescaamisurarel'attivitàdiunsingolo

neurone,echesiadicileaccorgersidelladierenzatraglispikedidiversineu-

roni della stessa areadi registrazione perchè molto simili tra loro in forma e

dimensione. Inoltrepuòsuccederecheapproccisemplicicomeildetectionhard-

wareasogliapossanopolarizzarel'esperimentoversoqueineuronichehannoun

potenzialed'azione piùevidente,rendendoimpossibilelarilevazionedeglialtri

neuronivicini. Unasoluzionevalidaaquestacategoriadiproblemièrappresen-

tatadallaanalisidelsegnalegrezzo,equindidaunfasedidetectioneettuata

viasoftwareenonviahardware.

Unodeimotivipercuiènatolospikesortingèquellodiaiutarelostudioneu-

roscienticodipopolazionidineuroni. Inalcunicasièpossibilemisurarel'attiv-

itàdiunapopolazionedineuroniusandoarraydielettrodiseparatispazialmente

tanto dasupporreche ciascunofunzioni da singolo elettrodo indipendente. Il

vantaggiodel sorting deglispike èche, teoricamente,rendepossibilelo studio

dipopolazionilocalidineuronitroppovicinitraloropergarantirel'isolamento

tra levarie registrazioni e permette di investigare sulla temporizzazione degli

spikedistinguendoduespikedovutianeuronidierenticoincidentinellostesso

istantetemporale.

Inletteraturasiriscontraungrandeinteresseperquestoproblemaneurosci-

entico,infattisono numerosissimeletecniche chesono statesviluppateconil

passaredeltempoperrisolvereilproblemadelsortingdeglispike[8].

2.1 I problemi principali dello spike sorting

Osservandodelleformed'ondaregistrateextracellularièchiarocomesianosem-

prepresentidierentitipidipotenzialid'azione,informaedimensione. Quello

che invece rimane da chiarire è come e perchè: corrispondono ad attività di

neuroni diversioaquelladi unsolo neurone? Sonoartefattiosono datenere

in considerazione? Conquale criterioè consentito decidere quali spike tenere

in considerazione come "buoni" e quali scartare come "cattivi"? E come ri-

conoscerespikecoincidenticomesommadidueopiùelementiconosciutienon

comeunnuovoelementosconosciuto? Questesonoleprincipalidomandeacui

sivuoledareunarispostaconl'applicazionedellemetodologiedispikedetection

espikesorting.

unnonprecisatonumerodineuroni.

rale,diventanecessarioipotizzarecheineuronidiunacertapopolazionegener-

ino potenzialid'azione conuna forma caratteristicae questa ipotesi, anchese

spessoèvalida,nonèsemprevericata. Tuttavia,moltineuronigeneranopoten-

ziali d'azione che hanno una forma variabile anche perchè spesso, durante la

fase di registrazione, l'elettrodo scivola lentamente lungo il tessuto. Questo

fenomeno determina per l'appunto un graduale cambiamento nella forma dei

potenziali d'azione registrati dallo stesso neurone. Quanto ne segue è che il

processo successivo di clustering ne rimane inuenzato, determinando gruppi

con formapoco compatta. Inoltre c'è la dicoltàdata dalla sceltadel valore

di soglia, che èun problema di tipo statistico. Il livellodella soglia determi-

na un trade-o tra la mancata detenzione degli eventi(falsi negativi, FN) ed

ladetenzionedi eventiinesistenti(falsipositivi,FP):idealmente questovalore

dovrebbeesseresceltoperottenereil rapporto

F N

F P desiderato. Solonelcasoin cuiillivellodirumoredifondoèpiccoloparagonatoalvalorediampiezzadegli

spikeèpossibilefareunabuonadistinzionetrasegnaleerumoreconilmetodo

dellasoglia.

Inaggiuntaalrumoredifondo,che,almenoin primaapprossimazione,può

essereconsideratodi naturagaussiana,l'altezzadellospikepuòvariareconsid-

erevolmentesecisonoaltrineuroninellaregionechegenerapotenzialid'azione

che generanoa loro volta potenziali di dimensioni signicativeche vadano in

qualchemodoasommarsitraloro. Unastimadiquantofrequentementecapita

ditrovarelasovrapposizione,ancheparziale,dellecurvedeipotenzialid'azione

didiversineuronipuòesserevalutataconsiderandolafrequenzadiscaricadella

popolazione. Infattisipuòvalutarelapercentualediscarichenonrilevatecome

laprobabilitàcheilsingoloeventocapitiincorrispondenzadellafasenegativadi

unaltroeventocoincidente-oquasi-disottofondo. Considerandorilvaloredi

frequenzadiscaricavalutatainHertzedladuratadellafasenegativavalutata

in millisecondi,siavrà

%spike − non − segnalati = 100 rd

1000

dellafasenegativaèapprossimativamentedi20mssiottienechecircal'1%degli

spike vengano persi. E' importante tenere presente, infatti, che solo quando

la fase negativa del background ha una durata sucientemente lunga questo

fenomenoètaledarappresentareunproblemaperlarilevazionedeglispike. Un

altrapotenziale fontedierrore,sempredovutaallasovrapposizionedeisegnali,

si haquandoduespikedi sottofondosicombinanoassieme. Inquestocaso,se

dueneuroniindipendentihannofrequenzadiscarica

r

r

sommatipersuperarelasogliaadunafrequenzadicirca

(r

r

)

d

siintendelalarghezzadellospikeinmillisecondi. Questosignicachesecisono

due neuronibackgroundchesparanoalla frequenzadi 20Hz esesisupponela

larghezzadiognisingolospikeparia

1

4 ^dimillisecondo,ènotocheverràgenerato unfalsopositivoconunafrequenzadi

1

10 ^{diHertz. Questometododistimaha}

sensosoloperneuroniadiacentichepresentanoattivitàstrettamentecorrelate:

caveat emptor, in quanto la frequenza degli spike non segnalati o comunque

deglieventidi sovrapposizionevienetipicamente sottostimata. Un altropunto

sucuiènecessarioprestareattenzioneèchelastimaèbasatainlineadimassima

sull'assunzionecheleattivitàdeineuronisianoindipendentiechelanaturadella

distribuzionedegliISI(InterSpikeInterval)siadinatura poissoniana: lastima

del numero delle coincidenzeè quindi conservativa epotrebbequindi rivelarsi

maggioreseineuroniavesseroattivitàdi scaricacorrelatetraloro.

2.2 Il clustering dei dati

Per analizzare i segnali neurali bisogna innanzitutto identicare gli istanti di

tempoincuilacellulaneuralegenerailpotenzialed'azione;solosuccessivamente

sarànecessariaunaclassicazionedeglieventichesonostatiidenticati: questa

partedellavorovienechiamataclusteringdeidati.

Il problema del clustering è di carattere generale ed è stato arontato in

tutte oquasi le discipline ingegneristiche. Tuttavia, si tratta di un problema

estremamente complesso anche a livellocomputazionale. Infatti tecniche, en-

trambe validepercasi diversitra loro, potrebbero dare risultatiincompatibili

traloroseapplicateallostessoset didati.

Esisteun processo molto simile a quello di clustering, che viene chiamato

analisidiscriminante: ladierenzatrai duestanelfatto chementrenel primo

casoabbiamounaseriedi elementidi cuinonabbiamoconoscenzasullaprove-

nienza,nel secondoègiànoto unset di clustere lafasedi analisiserve"solo"

perassociareinuovielementiallepreclassi,chegiàsononote.

Sononumerose le tecniche di clustering sviluppate per dierenti problemi

Fig.5: Dati(olorofeature)proiettatinellospaziodilavoro

X

X

.

tinguere questetecnichein diversetipologie. Letecnichedi clustering possono

esserequindiraggruppatesecondounaspecicatassonomia.

*Partizionatoogerarchico,

chesiriferisceallanaturadellaclassicazione. Seadesempiosihauninsieme

dielementidatoda{A,B,C,D,E,F,G}distribuitinellospaziocomemostrato

ingura,sesiadottaunalgoritmopartizionatosiotterrannotrecluster,mentre

sesiadottaunalgoritmogerarchicononèdetto,dipendedallozoomconcuisi

vaavalutareilclustering.

Unesempiogracocherendebenel'ideadigerarchiadiunclusteringèinvece

datodalmetododeldendrogramma,chevienemostratoingura.

*Aggiuntivaosottrattiva,

che si riferisce nello specico al tipo di operazione che l'algoritmo fa. Un

algoritmo di tipo aggiuntivo comincia associando a ciascun elemento da clas-

sicare il titolo di cluster, e successivamente fonde i cluster tra loro no al

raggiungimentodiuncertocriterio. Ilmetodosottrattivoinvececominciaasso-

Fig.7: Esempiodidendrogrammaconidatimostratiprecedentemente.

*Hardosoft,

chesiriferiscealtipodilogicadegliinsiemichesidecidediapplicare,ovvero

sela logicacrispolalogicafuzzy rispettivamente. Un clustering di tipohard

assegnaunaspecicalocazioneperognielemento,mentre unclusteringdi tipo

softassegnai gradidi appartenenzadi ognielementoadognicluster. Talvolta

siricorreallaclassicazionefuzzyperottenerneunacrisp,ovverosiassegnaallo

specicoelementolalocazionechegodedelmaggiorgradodiappartenenza.

*Monoteticoopolitetico,

questo aspetto si riferisceall'uso sequenzialeo simultaneo delle caratteris-

tiche degli elementi che si vanno classicando. Infatti, secondo la denizione

di Sokale Sneath, un insieme A si dice monotetico rispettoad un insieme di

proprietàP,seilpossessodell'insiemedelleproprietàPècondizionenecessaria

e suciente per l'appartenenza all'insieme A. L'insieme monotetico è quindi

un insieme compostoda elementi totalmente omogenei rispetto alle proprietà

costituenti P. In pratica unatale omogeneità rispettoad uninsieme sucien-

temente numeroso di proprietà scelte in funzione dell'indagine si verica solo

raramente ed è perciò risultato necessario rendere piùessibili i criteri ed in-

trodurre la nozione di insieme politetico. Un insieme A si dice politetico in

rapportoaP (insieme di proprietà),se ognioggettodi A possiede unnumero

sucientediproprietàdell'insiemeP,seogniproprietàdell'insiemePèattribui-

taadunnumerosucientementegrandedioggettidell'insiemeAese,perqual-

siasiproprietàdell'insiemeP, l'attribuzioneall'oggettodi questaproprietànon

è condizione necessaria per l'appartenenza dell'oggetto all'insieme A. Questa

denizione rendepossibile, dopoaverprecisato che cosasignichi "suciente-

mente grande",stabilireseA, insieme dato,èpolitetico rispettoall'insiemedi

proprietàP.L'insiemepoliteticoèquindiincertosensosucientementeomoge-

neorispettoaduninsiemedatodiproprietà,mamenoomogeneodiuninsieme

monotetico.

*Deterministicoostocastico,

chesiriferisceall'approccioutilizzatoperl'ottimizzazionedellaclassicazione

in atto. Questaottimizzazione sipuòottenere siausandotecnichetradizionali

cheattraversounaeuristicaricercanellospaziodeglistati.

*Incrementaleono,

inquantoquandoilsetdidaticoncuisilavoraègrandeediltempodianalisi

o quantità di memoria dedicata sono fattori vincolanti è necessario ridurre il

numerodiscansionidellevarieclassi. Conimetodideldataminingèpossibile

realizzarealgoritmidiclusteringconquestecaratterisiche.