Le nuove procedure diagnostiche sono state messe a punto utilizzando nuovi

PREFAZIONE

Nel corso del tempo sono state descritte più di 100.000 specie di funghi, solo alcune centinaia di queste specie hanno una rilevanza clinica poiché responsabili di micosi o patologie nell’uomo. Negli ultimi vent’anni l’incidenza delle infezioni fungine, causate da funghi patogeni ed opportunisti, è significativamente aumentata parallelamente a un elevato tasso di morbilità e mortalità della popolazione e dei pazienti a rischio. Le cause sono inerenti ai progressi della medicina, all’infezione da HIV, alle nuove tecniche chirurgiche invasive, ai trapianti di organo ed all’uso massivo di antibiotici antibatterici. È aumentata sempre di più, quindi, la necessità di ottenere risultati celeri e specifici sugli agenti eziologici che scatenano tali infezioni in modo tale che i clinici possano subito agire sui paziente con un’appropriata terapia antifungina.

I sistemi diagnostici, attualmente disponibili nei laboratori, richiedono spesso lunghi tempi di esecuzione e non sempre permettono, soprattutto per le specie di recente definizione, una accurata discriminazione. In tale ottica nel presente lavoro sono state messe a punto nuove procedure diagnostiche per l’isolamento ed identificazione di ifomiceti di interesse clinico.

Le nuove procedure diagnostiche sono state messe a punto utilizzando nuovi

terreni di coltura per la crescita degli ifomiceti: Sabouraud GC Agar (Becton

Dickinson), Dermatophyte Agar (Kima), Dermasel Agar Base ( Oxoid), Brain

Heart Infusion (Becton Dickinson), Sabouraud Broth (Liofilchem), HB&L

Sabouraud Kit (Alifax); nuove e diverse modalità di incubazione dei terreni di

coltura tra cui il sistema semiautomatizzato HB&L (Alifax,Italia) e nuovi metodi

di identificazione degli ifomiceti ovvero la spettrometria di massa con tecnologia MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption Ionizzation-Time Of Flight) della Bruker Daltonics .

I ceppi isolati in questo lavoro appartengono a vari generi: Acremonium, Alternaria, Aerobasidium, Aspergillus, Bipolaris, Cladosporium, Chrysosporium, Curvularia, Fusarium, Hormonema, Microsporum, Neoscytalidium, Paecilomices, Penicillium, Scedosporium, Scopulariopsis, Trichophyton, Verticillium, Ulocladium. Essi sono stati identificati prima con il metodo di routine e successivamente mediante lo spettrometro di massa MALDI-TOF.

Il metodo di routine, utilizzato nella maggior parte dei laboratori di micologia, prevede, per l’identificazione di specie, osservazione macroscopica e microscopica delle colonie di ifomiceti.

La spettrometria di massa, invece, con tecnologia MALDI-TOF permette di identificare i microrganismi in pochi minuti mediante ionizzazione di proteine; lo spettro di massa generato da un software, in base al rapporto massa/carica delle proteine ionizzate costituenti il campione, viene confrontato con banca dati (o libreria) in cui sono presenti spettri di riferimento riguardanti microrganismi riconosciuti e caratterizzati.

Confrontando i risultati ottenuti dai due metodi di identificazione si evince che la

tecnologia MALDI-TOF, utilizzata con una libreria aggiornata come “Filamentous

Fungi Library 1.0”, permette di avere una percentuale di concordanza con le

identificazioni degli ifomiceti, ottenute mediante il metodo di routine, pari a circa

80%.

Nel presente lavoro ho utilizzato anche un sistema semiautomatizzato di incubazione, lo strumento HB&L (Alifax, Italia). Tale strumento, mediante la tecnologia light scattering, permette di conoscere sia la crescita degli ifomiceti nei terreni liquidi, espressa in CFU/mL, sia il tempo di crescita.

Dai risultati ottenuti si evince che il MALDI TOF, utilizzato con una libreria aggiornata come “Filamentous Fungi Library 1.0” in associazione con sabouraud liquido, ad esempio HB&L Sabouraud Kit (Alifax), e con sistemi semiautomatizzati di incubazione come lo strumento HB&L (Alifax, Italia), fornisce, in tempi notevolmente ridotti, validi risultati sia sull’identificazione di specie sia sui tempi di refertazione.

In conclusione la tecnologia MALDI-TOF, può essere considerata un’alternativa

valida ai convenzionali sistemi di identificazione utilizzati nei laboratori di

micologia per il riconoscimento degli ifomiceti di interesse clinico poiché è

estremamente veloce, utilizza reagenti a basso costo ed è altamente sensibile e

specifica.