Capitolo 3

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Capitolo 3: Risultati e discussione

3.1 Isolamento ed identificazione dei composti

Le parti aeree di Euphorbia laurifolia Juss. ex Lam. sono state essiccate e successivamente estratte, tramite una macerazione a temperatura ambiente con solventi a polarità crescente: n-esano, cloroformio, cloroformio-metanolo (9:1) e metanolo.

Dopo evaporazione del solvente, grazie all’aiuto del rotavapor, si sono ottenuti i seguenti residui:

 estratto n-esanico (RE): 15.2 g  estratto cloroformico (RC): 14.6 g

 estratto cloroformio-metanolico (RC-M): 2.7 g  estratto metanolico (RM): 20.2 g

Tutti gli estratti sono stati cromatografati mediante cromatografia su strato sottile (TLC) e sulla base di tali risultati sono stati scelti come oggetti di studio e analisi quello cloroformico, esanico e cloroformio-metanolico. L’estratto metanolico è stato solo sottoposto ad un primo grossolano frazionamento. L’ulteriore separazione dei costituenti sarà infatti oggetto di frazionamento ed analisi in un prossimo futuro. Il processo di separazione ha portato all’isolamento e alla caratterizzazione di 13 composti.

Tra i metaboliti secondari identificati troviamo:

 7 diterpeni (composti 2, 4, 6, A, B, C, D)

 3 iononi (composti 3, 5, 7)

 2 cumarine (composto 1, E)

 1 flavonoide (composto 8)

La determinazione strutturale di tutti i composti è stata effettuata mediante spettri NMR mono e bidimensionali (1_H-NMR, 13_C-NMR, 13_{C-DEPT, HSQC, HMBC,}

DQF-COSY,1D-TOCSY) e confermata tramite spettrometria di massa ESI-MS. I composti A-E sono ancora in corso di caratterizzazione.

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L’analisi NMR è stata eseguita con due tipologie di strumenti operanti a campi diversi: 250 e 600 MHz, quest’ultimo è stato utilizzato soprattutto per piccole quantità di campione al fine di ottenere segnali ben risolti e separati.

Gli esperimenti monodimensionali 1_{H e} 13_{C-NMR hanno fornito informazioni circa il}

numero di protoni presenti, il loro accoppiamento ed il valore delle costanti nonché sul numero di atomi di carbonio. In particolare la tecnica multi-impulso DEPT (Distortionless Enhancement by Polarization Transfer) ha permesso la determinazione del numero di protoni legati a ciascun atomo di carbonio.

L’esperimento 1D-TOCSY (TOtal Correlation SpettroscopY) si è rivelato utile nell’ analisi spettroscopica degli zuccheri ed in generale in tutti i casi in cui il segnale di un singolo protone si rivelava molto complicato nel semplice spettro 1H-NMR. Questo esperimento permette di costruire un sistema di spin eccitando selettivamente un protone che, grazie al trasferimento di magnetizzazione, consente di evidenziare tutti gli altri protoni appartenenti allo stesso sistema. Di fondamentale importanza nella determinazione strutturale dei composti sono sicuramente gli esperimenti di spettroscopia bidimensionale. Questi hanno consentito di ottenere un notevole incremento della risoluzione spettrale in quanto i segnali risultano dispersi in due dimensioni fornendo ulteriori informazioni sulle correlazioni degli stessi. Tutti gli esperimenti NMR bidimensionali sono stati acquisiti in CD3OD in fase positiva con il

trasmettitore regolato sulla risonanza del solvente e sul TPPI (Incremento di Fase Proporzionale al Tempo) al fine di raggiungere una distinzione delle frequenze nella dimensione ω1 .

Gli esperimenti bidimensionali più utilizzati per la determinazione strutturale dei composti isolati sono stati:

 HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence), esperimento di correlazione eteronucleare che, impiegando il protone per la rivelazione del segnale, permette di ottenere l’assegnazione di uno spettro 13_{C a partire dal}

corrispondente spettro protonico e viceversa. Tutto ciò mediante la correlazione diretta 1_H-13_C.

 HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Coherence), esperimento di correlazione eteronucleare long range che consente di rivelare le correlazioni a più di un

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legame (2J e 3_{J) tra un protone ed il carbonio non adiacente, consentendo in}

particolare di evidenziare correlazioni con i carboni quaternari.

 DQF-COSY (Double Quantum Filtered COrrelated SpettroscopY), esperimento che consente di ottenere informazioni su protoni accoppiati attraverso due o tre legami e di correlare i chemical shifts mediante gli accoppiamenti scalari omonucleari. Inoltre tale metodica permette di assegnare i vari sistemi di spin presenti nella molecola anche laddove si abbiano costanti di accoppiamento molto piccole e, di conseguenza, segnali non ben risolti. Infine l’esperimento difiltrato DQF permette di distinguere i segnali in prossimità del solvente, altrimenti coperti.

Ulteriori informazioni sui composti isolati sono state ottenute mediante analisi spettrometriche come ESI-MS che ne hanno confermato la struttura mediante il loro peso molecolare e le frammentazioni, espresse come rapporto massa/carica elettrica (m/z).

3.2 Frazionamento dell’estratto cloroformico (R

)

Dall’estratto cloroformico (RC) attraverso cromatografia su colonna di gel di silice

usando il sistema di purificazione flash Biotage® _{Isolera™ Spektra, si sono ottenute}

delle frazioni complesse che a loro volta sono state separate mediante cromatografia ad alta pressione su fase inversa RP-HPLC. Sono stati così isolati ed identificati 7 metaboliti secondari. Tra questi, una cumarina (1), quattro diterpeni (2, 4, 6, A) e due iononi (3, 5).

I composti 5 e 6 sono composti di nuovo isolamento, mai caratterizzati in precedenza in studi fitochimici.

Qui di seguito è riportato lo schema di frazionamento dell’estratto cloroformico, ed i risultati conseguentemente ottenuti (Fig 3.1):

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Fig 3.1 - Schema di frazionamento dell’estratto cloroformico RC

Estratto R_C Biotage® _Isolera™ Spektra R_C/5 RP-HPLC MeOH-H₂O (55:45) Composto 1 R_C/7 RP-HPLC MeOH-H₂O (85:15) Composto A R_C/9 RP-HPLC MeOH-H2O (7:3) Composto 2 RC/11 RP-HPLC MeOH-H2O (65:35) Composto 3 Composto 4 R_C/12 RP-HPLC MeOH-H2O (4:6) Composto 5 R_C/14 RP-HPLC MeOH-H₂O (55:45) Composto 6

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3.3 Frazionamento dell’estratto

n

-esanico (R

)

L’estratto n-esanico (RE) è stato ripartito in una frazione n-esanica (REE) ed in una

miscela MeOH-H2O (3:2) (REW), entrambe sottoposte a sistema di purificazione flash

Biotage® _{Isolera™ Spektra ed una frazione dell’estratto R}

EW (REW/3) è stata

sottoposta anche a cromatografia HPCPC (High Performance Centrifugal Partition Chromatography). In seguito le frazioni interessanti risultanti da queste cromatografie sono state separate tramite RP-HPLC. Sono stati così isolati 3 metaboliti secondari, tutti appartenenti alla classe dei diterpeni (B, C, D), la cui struttura è in corso di delucidazione. Lo schema di seguito riportato (Fig 3.2) riassume il procedimento eseguito nell’analisi dell’estratto n-esanico ed i risultati ottenuti:

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Fig 3.2 - Schema di frazionamento dell’estratto n-esanico (RE)

3.4 Frazionamento dell’estratto cloroformio-metanolico (R

)

L’estratto cloroformio-metanolico (RC-M) è stato sottoposto a cromatografia su

colonna Sephadex LH-20 ad esclusione molecolare; le frazioni ottenute sono state ulteriormente separate grazie a cromatografia ad alta pressione su fase inversa RP-HPLC. Si è giunti così all’isolamento di tre metaboliti secondari di cui uno appartenente alla classe degli iononi (7), un altro già isolato nell’estratto cloroformico

Estratto R_E REW Biotage® _Isolera™ Spektra _{Frazione R} EW/3 HPCPC REW/E RP-HPLC MeOH-H₂O (75:25) Composto B R_EW/F RP-HPLC MeOH-H2O (75:25) Composto C Composto D REW/G RP-HPLC MeOH-H2O (8:2) Composto D REE Ripartizione (1:1) n-esano/MeOH-H2O (3:2)

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appartenente alla classe dei diterpeni (6) ed infine uno appartenente alla classe delle cumarine (composto E) ancora in fase di caratterizzazione.

Lo schema qui di seguito riportato riassume il procedimento eseguito nel frazionamento dell’estratto cloroformio-metanolico (Fig 3.3)

Fig 3.3 - Schema di frazionamento dell’estratto cloroformio-metanolico RC-M

3.5 Frazionamento dell’estratto metanolico (R

)

L’estratto metanolico (RM) è stato ripartito per mezzo dell’imbuto separatore con una

miscela n-BuOH-H2O (1:1), in una porzione n-butanolica RBu (2.9 g) ed in una

porzione acquosa. Frazione R_C-M Sephadex LH-20 MeOH R_C-M/2 RP-HPLC MeOH-H₂O (55:45) Composto 6 R_C-M/3 RP-HPLC MeOH-H₂O (1:1) Composto 6 Composto 7 R_C-M/5 RP-HPLC MeOH-H₂O (25:75) Composto E

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Il residuo n-butanolico ottenuto è stato sottoposto a cromatografia ad esclusione molecolare su colonna Sephadex LH-20. Si è giunti così all’isolamento di un metabolita secondario appartenente alla classe dei flavonoidi, il composto 8.

Fig 3.4 - Schema di frazionamento dell’estratto metanolico (RM)

3.6 Diterpeni

3.6.1 Composto 2

Il composto è stato isolato dall’estratto cloroformico (RC). La frazione RC/9 è stata

ottenuta in seguito a cromatografia dell’estratto RC (5.0 g) su colonna di gel di silice

usando il sistema Biotage® _{Isolera™ Spektra eluita con CHCl}

3-MeOH (95:5  9:1),

successivamente è stata sottoposta a cromatografia ad alta pressione su fase inversa RP-HPLC eluendo con una miscela MeOH-H2O (7:3) (tR= 12 min). Ciò ha condotto

all’isolamento del composto 2 (Fig 3.5) che si presenta come un solido bianco cristallino. Frazione RM R_M/9 Composto 8 Sephadex LH-20 MeOH

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Fig. 3.5 - ent-16α,17-Diidrossikauran-3-one

La formula molecolare del composto è stata determinata come C20H32O3, ed è stata

ottenuta mediante esperimenti ESI-MS che mostrano in modalità negativa il picco quasi molecolare a m/z 319 [M-H]-_{. L’analisi dello spettro monodimensionale} 1

H-NMR mostra segnali per tre gruppi metilici terziari (δ 1.03, 3H, s; 1.07, 3H, s; 1.12, 3H, s) e due protoni di un gruppo idrossimetilenico (δ 3.42, d, 1H; 3.32, d, 1H; J=11 Hz). L’analisi dello spettro 13C-NMR e DEPT mostrano la presenza di tre metili, nove metileni, tre metini e cinque gruppi quaternari. Il confronto con i dati presenti in letteratura (Ding e Jia, 1991) ha permesso di identificare il composto 2 come ent-16α,17-diidrossikauran-3-one.

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Tab 3.1 - Dati 1_{H-NMR e} 13_{C-NMR del composto 2}a _(CD

3OD, 250 MHz) Ent-16α,17-diidrossikauran-3-one Posizione δH δc Posizione δH δc 1a 1.50 b _{39.0 11b 1.58} b _- 1b 2.06 m - 12a 1.85 m 27.0 2 2.50 b _{35.0 12b 1.52 m -} 3 - 218.0 13 2.09 m 42.8 4 - 45.0 14 1.50 b _42.0 5 1.48 b _{54.0 15 1.44} b _53.0 6 1.58 b _{21.0 16 - 78.0} 7a 1.90 m 38.6 17a 3.42 d (11.0) 70.5 7b 1.12 b _{- 17b 3.32 d (11.0) -} 8 - 43.0 18 1.07 s 28.0 9 1.22 dd (9.0, 2.0) 56.0 19 1.03 s 21.3 10 - 39.0 20 1.12 s 19.5 11a 2.13 m 20.4

a _{I valori di chemical shift sono indicati in ppm e le costanti di accoppiamento sono in parentesi e riportate in Hz.} b

segnali sovrapposti.

3.6.2 Composto 4

Il composto è stato isolato dall’estratto cloroformico (RC). La frazione RC/11 è stata

ottenuta in seguito a cromatografia dell’estratto RC (5.0 g) su colonna di gel di silice

usando il sistema Biotage® _{Isolera™ Spektra eluita con CHCl}

3-MeOH (9:1  8:2),

successivamente è stata sottoposta a cromatografia ad alta pressione su fase inversa RP-HPLC eluendo con una miscela MeOH-H2O (65:35) (tR= 17 min). Ciò ha condotto

all’isolamento del composto 4 (Fig. 3.6) che si presenta come un solido bianco cristallino.

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Fig. 3.6 - ent-16α,17-diidrossiatisan-3-one

La formula molecolare del composto è stata determinata come C20H32O3, ed è stata

ottenuta mediante esperimenti ESI-MS che mostrano in modalità negativa il picco quasi molecolare a m/z 639 [2M-H]-_{. L’analisi dello spettro monodimensionale} 13

C-NMR mostra valori a δ 220.0, 74.8 e 69.4 relativi rispettivamente all’atomo carbonio del gruppo chetonico (C-3), dell’alcol primario (C-17) e dell’alcol terziario (C-16). L’analisi degli spettri 1H-NMR e 13C-NMR mostrava la presenza di segnali tipici di uno scheletro atisanico. Il confronto con i dati presenti in letteratura ha permesso di identificare il composto 4 come ent-16α,17-diidrossiatisan-3-one (Lal et al., 1990). I dati 1_{H-NMR e} 13_{C-NMR sono riportati qui sotto (Tab 3.2):}

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Tab 3.2 - Dati 1_{H-NMR e} 13_{C-NMR del composto 4} a _(CD

3OD, 250 MHz) Ent-16α,17-diidrossiatisan-3-one Posizione δH δc Posizione δH δc 1a 1.40 b _{38.9 11b 1.28 m -} 1b 1.93 m - 12 1.86 m 32.8 2a 2.68 ddd (16.0, 12.0, 7.0) 34.5 13a 1.52 m 24.0 2b 2.36 ddd (16.0, 6.0, 3.0) - 13b 1.71 br t (13.0) - 3 - 220.0 14a 0.88 m 27.8 4 - 47.0 14b 1.94 m - 5 1.41 b _{56.9 15a 1.11} b _53.3 6a 1.48 m 20.5 15b 1.21 b _- 6b 1.58 m - 16 - 74.8 7a 1.22 m 39.6 17a 3.40 d (11.0) 69.4 7b 1.45 m - 17b 3.54 d (11.0) - 8 - 33.2 18 1.11 s 26.3 9 1.39 b _{51.9 19 1.10 s 21.8} 10 - 38.1 20 1.19 s 13.7 11a 2.06 br t (12.0) 23.7

a _{I valori di chemical shift sono indicati in ppm e le costanti di accoppiamento sono in parentesi e riportate in Hz.} b

segnali sovrapposti.

3.6.3 Composto 6: nuovo diterpene naturale

Il composto è stato isolato dall’estratto cloroformico (RC). La frazione RC/14 è stata

ottenuta in seguito a cromatografia dell’estratto RC (5.0 g) su colonna di gel di silice

usando il sistema Biotage® _{Isolera™ Spektra eluita con CHCl}

3-MeOH (8:2);

successivamente tale frazione è stata sottoposta a cromatografia ad alta pressione su fase inversa RP-HPLC eluendo con una miscela MeOH-H2O (55:45) (tR= 13 min). Il

composto è stato anche isolato dall’estratto cloroformio-metanolico (RC-M). Le frazioni

RC-M/2 ed RC-M/3 sono state ottenute in seguito a cromatografia dell’estratto RC-M (2.7

g) ad esclusione molecolare su colonna Sephadex LH-20 eluendo con MeOH a flusso costante di 1 ml/min. Successivamente sono state sottoposte a cromatografia ad alta pressione su fase inversa RP-HPLC eluendo, per la frazione RC-M/2, con una

miscela MeOH-H2O (55:45) (tR= 24 min); mentre per la frazione RC-M/3 con una

miscela MeOH-H2O (1:1) (tR= 16 min). Ciò ha condotto all’isolamento del composto 6 (Fig. 3.7) che si presenta come un olio giallo, otticamente attivo con [α]D= +19 (c

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mediante esperimenti HRESIMS (Fig 3.8) che mostrano in modalità positiva un picco quasi molecolare a m/z 501.2446 [M+Na]+ _{e un picco di frammentazione a m/z}

339.1924 [M+Na-162]+_{, fortemente indicativo della presenza di un’unità di esoso. I}

dati 1_H-NMR, 13_{C-NMR (Tab 3.3) e} 13_{C DEPT indicano oltre ai segnali attribuibili a una}

frazione zuccherina, la presenza di due gruppi chetonici, un gruppo idrossimetilenico, due doppi legami (uno trisostituito e uno tetrasostituito), e 13 atomi di carbonio con ibridazione sp3, fra cui quattro metili, quattro metileni, quattro metini e un carbonio quaternario. I segnali caratteristici a chemical shifts δ 0.56 e δ 0.77 suggeriscono la presenza di un anello ciclopropanico, tipico dello scheletro di molti diterpeni delle piante appartenenti alla famiglia delle Euphorbiaceae (Liao et al., 2005). Inoltre, lo spettro 1_{H-NMR (Fig 3.9) mostra un segnale a δ 5.71 (1H, s) con i corrispondenti}

segnali nello spettro 13C-NMR a δ 116.6 e 145.9, rivelando la presenza di un gruppo vinilico. Per di più è stato osservato nei dati degli spettri NMR la presenza di un metile vinilico a δ 1.68 (3H, s) e 20.7 ppm. Gli esperimenti DQF-COSY (Fig 3.10),

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TOCSY (Fig 3.11) e HSQC (Fig 3.12) hanno permesso di stabilire le seguenti connessioni: H-2─H-3 per l’anello A e H-7─H-13 per l’anello B, che rappresentano le porzioni strutturali di un diterpene appartenente alla classe dei lathyrani (Rondon et al., 2005). Le analisi dei chemical shifts, delle molteplicità dei segnali, dei valori assoluti delle costanti di accoppiamento e la loro dimensione nello spettro 1_H-NMR,

così come i dati riportati dallo spettro 13C-NMR, indicano la presenza di un residuo glucopiranosico con configurazione β al carbonio anomerico. Le assegnazioni di chemical shifts degli atomi di carbonio sono state stabilite dagli spettri HSQC e HMBC. In particolare nell’esperimento HMBC (Fig 3.13) sono stati osservati i picchi di correlazione fra H2-3C-1, H2-3C-4, H2-3C-15; H2-7C-5, H2-7C-6, H2-7

C-9, H2-7C-11, H2-7C-17; Me-16C-1, Me-16C-2, Me-16C-3; Me-17C-4,

Me-17C-5, Me-17C-6, Me-17C-7; H2-18C-1glc; Me-20C-11, Me-20C-12,

Me-20C-13, Me-20C-14, che hanno permesso di posizionare il gruppo chetonico in posizione 1 e 14, i doppi legami coniugati fra gli atomi di carbonio 4/15 e C-5/C-6, e il residuo di glucosio sul C-18. Da tutti questi dati si è potuto così giungere ad identificare il composto 6 come 18-idrossi-9αH,11αH-lathyra-4(15),5(6)-dien-1,14-dione-18-β-D-glucopiranoside. La stereochimica relativa al composto

6 è ancora in corso di elucidazione.

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Fig 3.9 - Spettro 1_{H-NMR del composto 6}

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Fig 3.12 - Spettro HSQC del composto 6

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Tab 3.3 - Dati 1_{H-NMR e} 13_{C-NMR del composto 6 (Metanolo-d}

4, 600MHz)a 18-Idrossi-9αH,11αH-lathyra-4(15),5(6)-dien-1,14-dione-18-β-D-glucopiranoside Posizione δH δc Posizione δH δc 1 - 213.4 13 3.32 m 44.6 2 2.62 m 40.9 14 - 211.4 3a 2.97 dd (14.0, 3.5) 37.2 15 - 142.0 3b 2.53 dd (14.0, 2.0) - 16 1.22 d (6.5) 16.6 4 - 169.3 17 1.68 s 20.7 5 5.71 s 116.6 18a 3.59 d (11.0) 80.4 6 - 145.9 18b 3.40 d (11.0) - 7a 2.37 m 79.7 19 1.02 s 11.5 7b 2.25 br t (12.0) - 20 1.07 d (6.5) 17.3 8a 1.89b _{23.6 Glc 1’ 4.31 d (7.5) 103.6} 8b 1.18 m - 2’ 3.22 dd (9.0, 7.5) 75.0 9 0.56 br t (13.0) 26.2 3’ 3.29 t (9.0) 77.6 10 - 21.7 4’ 3.34 t (9.0) 71.3 11 0.77 ddd (13.0, 8.0, 3.0) 22.7 5’ 3.37 m 78.0 12a 1.89b _{27.5 6’a 3.88 dd (12.0, 3.5) 62.5} 12b 1.40 ddd (15.0, 8.0, 3.0) - 6’b 3.71 dd (12.0, 5.0) -

a _{I valori di chemical shift sono indicati in ppm e le costanti di accoppiamento, in Hz, sono riportate tra parentesi;}

dati confermati da esperimenti DQF-COSY, 1D-TOCSY, HSQC, HMBC. b _{segnali sovrapposti.}

3.7 Iononi

3.7.1 Composto 7

Il composto è stato isolato dall’estratto cloroformio-metanolico (RC-M). La frazione R C-M/3 è stata ottenuta in seguito a cromatografia dell’estratto RC-M (2.7 g) sottoposta a

cromatografia ad esclusione molecolare su una colonna di Sephadex LH-20 eluendo con MeOH a flusso costante di 1 ml/min. Successivamente è stata sottoposta a cromatografia ad alta pressione su fase inversa RP-HPLC eluendo con una miscela MeOH-H2O (55:45) (tR= 7 min). Ciò ha condotto all’isolamento del composto 7 (Fig.

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La formula molecolare del composto è stata determinata come C19H30O8 ottenuta

mediante esperimenti ESI-MS che mostrano in modalità positiva il picco quasi molecolare [M+Na]+ _{am/z 409 e un picco di frammentazione a m/z 795 [2M+Na]}+_.

Gli spettri 1H e 13C-NMR mostrati in tabella (Tab 3.4) insieme con gli esperimenti COSY, HSQC e HMBC mostrano la presenza di un’unità β-glucopiranosidica e una frazione agliconica costituita da 13 atomi di carbonio. Tra i segnali attribuibili all’aglicone troviamo quelli relativi ai protoni (E)-olefinici in C-7 e C-8 (δ 5.76, d, J=15.5 Hz; δ 5.98, dd, J=15.5, 6.4 Hz), un protone ossimetinico in C-9 (δ 4.54, dq, J=6.4, 6.5 Hz) un gruppo metilico in C-10 (δ 1.29, d, J=6.5 Hz). Lo scheletro dell’aglicone risulta riconducibile al roseoside e ciò è stato confermato anche dai valori spettroscopici relativi a tre gruppi metilici terziari, di cui uno vinilico (δ 1.95, J=1.1 Hz) un protone vinilico (δ 5.88, s) ed un gruppo carbonilico (δC 197.2) (Caliş et

al., 2002). Il confronto di questi dati con quelli presenti in letteratura ha permesso di identificare il composto 7 come corchoinoside C. I dati 1_{H-NMR e} 13_{C-NMR sono}

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Tab 3.4 - Dati 1_{H-NMR e} 13_{C-NMR del composto 7}a _(CD

3OD, 250 MHz) Corchoinoside C Posizione δH δc Posizione δH δc 1 - 42.0 11 1.04 s 23.2 2a 2.62 d (16.6) 50.4 12 1.02 s 24.5 2b 2.18 d (16.6) - 13 1.95 d (1.1) 19.2 3 - 197.2 1’ 4.27 d (7.8) 100.9 4 5.88 br s 126.9 2’ 3.21 dd (9.0, 7.8) 74.7 5 - 163.6 3’ 3.27 t (9.0) 78.0 6 - 78.5 4’ 3.24 t (9.0) 71.8 7 5.76 d (15.5) 133.5 5’ 3.15 m 78.0 8 5.98 dd (15.5, 6.4) 133.4 6’a 3.85 dd (12.0, 5.0) 62.8 9 4.54 dq (6.4, 6.5) 74.3 6’b 3.65 dd (12.0, 5.0) - 10 1.29 d (6.5) 21.8

a _{I valori di chemical shift sono indicati in ppm e le costanti di accoppiamento sono in parentesi e riportate in Hz.} b

segnali sovrapposti

3.7.2 Composto 3

Il composto è stato isolato dall’estratto cloroformico (RC). La frazione RC/11 è stata

ottenuta in seguito a cromatografia dell’estratto RC (5.0 g) su colonna di gel di silice

usando il sistema Biotage® Isolera™ Spektra eluendo con CHCl3-MeOH (9:1  8:2),

è stata sottoposta successivamente a cromatografia ad alta pressione su fase inversa RP-HPLC eluendo con una miscela MeOH-H2O (65:35) (tR= 6 min). Ciò ha condotto

all’isolamento del composto 3 (Fig. 3.15) che si presenta come un olio giallo. I dati presenti in letteratura hanno permesso di caratterizzare questo composto come vomifoliol. O OH OH 1 2 3 4 5 6 ₇ 8 9 10 11 12 13 Fig. 3.15 - Vomifoliol

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La formula molecolare del composto è stata determinata come C13H20O3 ottenuta

mediante esperimenti ESI-MS che mostrano in modalità negativa il picco quasi molecolare [M-H]- am/z 223. Gli spettri 1_{H-NMR e} 13_{C-NMR (Tab 3.5) del composto} 3 erano molto simili a quelle del composto 7, da cui differivano per l’assenza dei segnali relativi al residuo di glucosio (Caliş et al., 2002).

Tab 3.5 - Dati 1_{H-NMR e} 13_{C-NMR del composto 3}a _(CD

3OD, 250 MHz)

a _{I valori di chemical shift sono indicati in ppm e le costanti di accoppiamento sono in parentesi e riportate in Hz.} b

segnali sovrapposti Vomifoliol Posizione δH δc Posizione δH δc 1 - 42.0 7 5.79 d (15.7) 129.8 2a 2.52 d (17.0) 50.4 8 5.79 ddd (15.7, 5.8) 136.8 2b 2.15 d (17.0) - 9 4.32 dq (6.4, 5.8) 68.6 3 - 197.2 10 1.23 d (6.4) 23.2 4 5.88 br s 126.8 11 1.00 s 24.3 5 - 163.6 12 1.02 s 23.2 6 - 78.5 13 1.92 d (1.3) 19.2

3.7.3 Composto 5: nuovo ionone naturale

Il composto è stato isolato dall’estratto cloroformico (RC). La frazione RC/12 è stata

ottenuta in seguito a cromatografia dell’estratto RC (5.0 g) su colonna di gel di silice

usando il sistema Biotage® Isolera™ Spektra eluendo con CHCl3-MeOH (9:1 8:2);

successivamente tale frazione è stata sottoposta a cromatografia ad alta pressione su fase inversa RP-HPLC eluendo con una miscela MeOH-H2O (4:6) (tR= 24 min). Ciò ha

condotto all’isolamento del composto 5 (Fig. 3.16) che si presenta come un solido amorfo, risulta otticamente attivo con [α]D= +8 (c 0.125, MeOH).

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La formula molecolare del composto è stata determinata come C13H22O4 ottenuta

mediante esperimenti HRESIMS che mostrano in modalità positiva il picco quasi molecolare [2M+Na]+ a m/z 507.3278, oltre che con il supporto dei dati NMR. Gli spettri 1_{H-NMR e} 13_{C-NMR (Fig 3.17) (Tab 3.6) indicano che il composto 5 è un}

derivato del megastigmano con un gruppo carbonilico in C-3, un gruppo funzionale idrossilico in C-6 e un doppio legame disostituito. Un segnale relativo a un idrossimetilene è stato anche osservato negli spettri 1_{H-NMR (δ}

H 3.85, dd, J=10.5,

5.0 Hz, e δH 3.61, dd, J=10.5, 3.0 Hz) e 13C-NMR (δC 64.0). L’elucidazione dello

scheletro strutturale del composto 5 è stata raggiunta sulle basi delle correlazioni ottenute dagli spettri HSQC e HMBC (Fig 3.18-3.19), le quali hanno anche permesso di assegnare tutte le risonanze nello spettro 13_{C-NMR dei relativi carboni. In accordo}

con lo spettro HMBC i protoni idrossimetilenici mostrano una correlazione long range con C-4 (δC 41.5), C-5 (δC 43.6) e C-6 (δC 78.1), mentre il protone del doppio legame

a δ 5.80 (H-7) rivela una correlazione long range con i segnali C-6 e C-9, indicanti che la funzione idrossimetilenica è collocata sull’atomo di carbonio C-5, mentre il doppio legame al C-7 e C-8 (De Marino et al., 2004). La stereochimica relativa al composto 5 sarà ottenuta sulle basi dei dati 2D-ROESY. Questi risultati hanno suggerito che la struttura del composto 5 sia quella del 6,9,13-triidrossi-megastigman-7-en-3-one.

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Fig 3.20 - Spettro DQF-COSY del composto 5

Tab 3.6 - Dati 1_{H-NMR e} 13_{C-NMR del composto 5 (Metanolo-d}

4, 600MHz)a 6,9,13-Triidrossi-megastigman-7-en-3-one Posizione δH δc Posizione δH δc 1 - 43.6 7 5.80 d (15.5) 132.0 2a 2.96 d (13.5) 53.0 8 5.98 dd (15.5, 6.0) 137.6 2b 1.86 d (13.5) - 9 4.37 q 69.0 3 - 215.2 10 1.29 d (6.5) 24.4 4a 2.80 t (13.0) 41.5 11 0.92 s 24.0 4b 2.29 dd (13.0, 2.0) - 12 0.92 s 24.0 5 2.21 m 43.6 13a 3.85 dd (10.5, 5.0) 64.0 6 - 78.1 13b 3.61 dd (10.5, 3.0) -

a _{I valori di chemical shift sono indicati in ppm e le costanti di accoppiamento, in Hz, sono riportate tra parentesi;}

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3.8 Cumarine

3.8.1 Composto 1

Il composto è stato isolato dall’estratto cloroformico (RC). La frazione RC/5 è stata

ottenuta in seguito a cromatografia dell’estratto RC (5.0 g) su colonna di gel di silice

usando il sistema Biotage® _{Isolera™ Spektra eluendo con CHCl}

3 CHCl3-MeOH (100

 95:5). Tale frazione è stata successivamente sottoposta a cromatografia ad alta pressione su fase inversa RP-HPLC eluendo con una miscela MeOH-H2O (55:45) (tR=

11 min). E’ stato così isolato il composto 1 (Fig. 3.21) che si presenta come un solido amorfo giallo fosforescente.

O H3CO OCH3 1 2 3 4 10 5 6 7 8 9 HO O Fig. 3.21 - Isofraxidina

La formula molecolare del composto è stata determinata come C11H10O5 mediante

esperimenti ESI-MS che mostrano in modalità negativa il picco quasi molecolare [M-H]- a m/z 221 con relativi picchi di frammentazione a m/z 206 [M-H-15]- _{dovuto alla}

perdita di un gruppo metilico ed un altro a m/z 191 [M-H-15-15]- _{dovuto alla perdita}

di un secondo gruppo metilico. In modalità positiva lo spettro mostra un picco quasi molecolare a m/z 223 [M+H]+_{. Nello spettro monodimensionale} 1_{H-NMR erano}

presenti chemical shifts di due gruppi metossilici a δ 3.88 (3H, s), e δ 3.95 (3H, s), di due protoni relativi ad un doppio legame di tipo cis a δ 6.02 (d, J=9.6 Hz), 7.79 (d, J=9.6 Hz) ed infine di un protone aromatico a δ 6.81 (1H, s). Il confronto di tali dati con quelli presenti in letteratura hanno permesso la caratterizzazione del composto 1 come isofraxidina (Borris et al., 1980). I dati 1_{H-NMR relativi ai segnali di chemical}

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Tab 3.7 - Dati 1_{H-NMR del composto 1}a _(CD

3OD, 250 MHz) Isofraxidina Posizione δH 1 - 2 - 3 6.02 d (9.6) 4 7.79 d (9.6) 5 6.81 s 6 3.88 s 7 - 8 3.95 s 9 - 10 -

a _{I valori di chemical shift sono indicati in ppm e le costanti di accoppiamento sono in parentesi e riportate in Hz.}

3.9 Flavonoidi

3.9.1 Composto 8

La frazione RM/9, ottenuta in seguito a cromatografia dell’estratto RM (20.1 g)

sottoposto a cromatografia ad esclusione molecolare su una colonna di Sephadex LH-20 eluendo con MeOH a flusso costante di 1 ml/min, si presentava su TLC come una singola macchia di colore bruno-arancio. Le analisi spettroscopiche ed il confronto con i dati presenti in letteratura hanno permesso di identificarlo come un flavonoide già noto: quercetina 3-O-β-D-glucuronopiranoside (composto 8) (Fig. 3.22).

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Fig. 3.22 - Quercetina 3-O-β-D-glucuronopiranoside

La formula molecolare del composto è stata determinata come C21H18O13 dall’analisi

di esperimenti ESI-MS che mostrano in modalità negativa il picco quasi molecolare [M-H]- am/z 477, con relativo picco di frammentazione a m/z 301 [M-H-176]-_{, e in}

modalità positiva un picco quasi molecolare a m/z 479 [M+H]+_{. I dati spettroscopici} 1_{H-NMR e} 13_{C-NMR mostravano i segnali caratteristici dell’aglicone quercetina con}

uno zucchero legato in posizione C-3. Il residuo glucidico è stato identificato come acido glucuronico (Parejo et al., 2004). I dati 1_{H-NMR e} 13_{C-NMR sono qui di seguito}

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Tab 3.8 - Dati 1_{H-NMR e} 13_{C-NMR del composto 8}a _(CD

3OD, 250 MHz) Quercetina 3-O-β-D-glucuronopiranoside Posizione δH δc Posizione δH δc 1 - - 2’ 7.64 d (2.0) 117.2 2 - 158.9 3’ - 145.8 3 - 135.3 4’ - 149.8 4 - 179.0 5’ 6.83 d (8.5) 115.9 5 - 162.7 6’ 7.60 dd (8.5, 2.0) 123.5 6 6.13 d (2.0) 99.8 1” 5.32 d (8.0) 104.3 7 - 165.8 2” 3.49 dd (9.0, 8.0) 75.3 8 6.32 d (2.0) 94.7 3” 3.48 t (9.5) 77.5 9 - 158.2 4” 3.59 t (9.5) 72.8 10 - 105.5 5” 3.72 d (9.5) 76.9 1’ - 122.7 6” - 172.4