Capitolo 3. RISULTATI 3.1.

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Capitolo 3 – Risultati

Capitolo 3. RISULTATI

3.1. Tesseropora atlantica

L’amplificazione dei 30 individui (di cui alcuni non hanno fornito amplificazione per alcuni dei primer testati, dedi Appendice 2) per ciascuna delle quattro località considerate con i cinque primer ISSR utilizzati ha portato all’individuazione di 79 loci (Tab. 3.1). Le dimensioni dei frammenti ottenuti variano approssimativamente tra 200 e 1350 paia di basi.

L’analisi della distribuzione dei genotipi in T. atlantica rileva 91 genotipi diversi alcuni dei quali condivisi da più di un individuo proveniente dalle diverse località (Tab. 3.2).

Tab. 3.1 Sigle e sequenze dei primer, numero di loci rilevati per primer e lunghezza dei frammenti espressa in paia di basi (bp).

Primer N° di loci _rilevati

Lunghezza dei frammenti (bp) SAS 1 35 200-1050 SAS 3 10 250-370 SAS 5 5 850-1200 UBC 811 16 330-940 UBC 827 13 490-1350

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Tab. 3.2 Analisi dei genotipi in T. atlantica (Frequenza = numero di individui che presentano quel genotipo)

Località Genotipo Frequenza Località Genotipo Frequenza

1 1 25 1 2 1 26 1 3 1 47 1 4 5 48 1 5 1 49 1 6 5 50 1 7 1 51 1 8 2 52 1 9 1 53 1 10 1 54 1 11 1 55 1 12 1 56 1 13 1 57 2 14 1 58 1 15 1 59 1 16 1 60 1 17 1 61 1 18 1 62 1 19 1 63 1 20 1 64 1 Faja Grande 21 1 65 1 22 1 66 1 23 1 67 1 24 1 68 1 25 1 69 1 26 1 70 1 27 2 71 1 28 1 Forcada 72 1 29 1 73 3 30 1 74 1 31 1 75 2 32 1 76 1 33 1 77 1 34 1 78 1 35 1 79 1 36 1 80 2 37 1 81 2 38 1 82 2 39 2 83 3 40 1 84 3 41 1 85 2 42 1 86 1 43 4 87 1 44 1 88 1 45 1 89 1 46 1 90 1 Baia das Mos Maia 91 1

All’interno dei campioni, in generale, si osservano bassi livelli di diversità genetica (Tab. 3.3.).

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Tab. 3.3 Valori di diversità genetiche di Nei (H) (1973) e dell’indice di Shannon (I) per le quattro località e relative deviazioni standard (S.D.).

Località H S.D. _{di Shannon}Indice S.D.

Faja Grande 0.0665 ±0.1297 0.1108 ±0.1927

Baia das Mos 0.0812 ±0.1493 0.1316 ±0.2156

Forcada 0.1215 ±0.1757 0.1899 ±0.2524

Maia 0.0959 ±0.1566 0.1528 ±0.2300

Il t-test applicato sui valori di eterozigosità (diversità genetica di Nei 1973) (Tab. 3.4) e sui valori degli indici di Shannon (Tab. 3.5) per locus trasformati in arcoseno della radice quadrata di x (Archie, 1985) ha dato significative differenze tra i campioni di Faja Grande e Forcada.

Tab. 3.4 Risultati del t-test applicato ai valori di eterozigosità

Faja Grande Baia das Mos Forcada

Baia das Mos 0.4307 - -

Forcada 0.0040 ** 0.0533 -

Maia 0.2192 0.5821 0.1911

Tab. 3.5 Risultati del t-test applicato ai valori dell’indice di Shannon.

Baia das Mos 0.4370 - -

Forcada 0.0060 ** 0.0690 -

Maia 0.2456 0.6186 0.2063

I valori di Fst di Weir e Cockerham (θ) evidenziano come i campioni

provenienti da località diverse (θS) differiscono geneticamente, così come quelli

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Tab. 3.6 Valori di θ, relativa deviazione standard, valori

massimi e minimi dell’intervallo di confidenza al 95% (θS= divergenza genetica tra località, θP = divergenza genetica tra isole).

L’analisi UPGMA delle distanze genetiche di Nei (1978) ha permesso la costruzione di un dendogramma i cui nodi mostrano un elevato sostegno bootstrap (>70) eccetto il secondo nodo (48) (Fig. 3.1).

Fig. 3.1. T. atlantica. Dendogramma UPGMA. La robustezza dei nodi del dendrogramma è stata valutata mediante “bootstrapping” con 10000 repliche. (FJG= Faja Grande, BDM= Baia das Mos, FOR= Forcada, MAIA=Maia).

La matrice dei valori a coppia delle distanze genetiche (θ), calcolati con il programma TFPGA, e delle distanze geografiche utilizzate per il test di Mantel sono riportate in Tab. 3.7.

F statistica S.D. Intervallo di _confidenza

θS = 0.3024 0.0663 0.1735 < θS < 0.4239

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Tab. 3.7 Matrice delle distanze genetiche (θ, sotto la diagonale) e geografiche (chilometri, sopra la diagonale) per ciascuna coppia di campioni.

Il test di Mantel non ha evidenziato la presenza di isolamento da distanza (Z= 592.5520, P= 0.0837).

L’analisi della varianza molecolare (AMOVA) è stata eseguita considerando tre livelli gerarchici: individui, località, isole. I risultati sono riportati nella Tab. 3.8.

Tab. 3.8 Risultati dell’analisi della varianza molecolare (AMOVA) sui campioni di T. atlantica. Valori di P calcolati con un test di permutazione (10000 repliche); gl= gradi di libertà.

Fonte della varianza gl _{della varianza}Componente _{della varianza}Percentuale Φ-statistica P Tra isole 2 1.08993 29.78 ΦCT = 0.29783 0.1665 Tra località

all’interno delle isole 1 -0.06153 -1.68 ΦSC = -0.02394 0.9593 Tra individui all’interno

delle località 115 2.63116 71.90 ΦST = 0.28102 <0.0001** FJG BDM FOR MAIA FJG ***** 365 380 620 BDM 0.2739 ***** 30 290 FOR 0.3082 0.1109 ***** 260 MAIA 0.3473 0.3113 0.2634 *****

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L’ottenimento, come nel caso delle popolazioni all’interno delle isole, di valori leggermente negativi delle componenti della varianza è un fenomeno non raro. Ciò avviene quando la componente in questione è molto vicina (o uguale) a zero. Nel presente lavoro, quindi, considerando uguale a zero la componente negativa, si ottiene che circa il 70% della varianza molecolare è attribuita al livello intralocalità ed il restante 30% è a carico della varianza presente tra le isole.

3.2. Chthamalus stellatus

L’amplificazione degli individui di Chthamalus stellatus (30 per Faja Grande, 26 per Baia das Mos, 29 per Forcada, 30 per Maia) con i tre primer ISSR utilizzati (SAS1, UBC827, UBC811), ha portato all’individuazione di un totale di 117 loci (Tab. 3.9). Le dimensioni dei frammenti ottenuti variano tra 120 e 1900 paia di basi.

Tab. 3.9 Sigle e sequenze dei primer, numero di loci rilevati per primer e lunghezza dei frammenti espressa in paia di basi (bp).

Primer N° di loci _rilevati

Lunghezza dei frammenti (bp) SAS 1 40 200-1400 UBC 811 41 120-1200 UBC 827 36 380-1900

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L’analisi della distribuzione dei genotipi in C. stellatus rileva 115 genotipi tutti unici e, perciò, mai presenti in più di un individuo.

In generale si osservano bassi livelli di diversità genetica (Tab. 3.10).

Tab. 3.10 Valori di diversità genetiche di Nei (H) (1973) e dell’indice di Shannon (I) per le quattro località e relative deviazioni standard (S.D.)

Località H S.D. _{di Shannon}Indice S.D.

Faja Grande 0.1112 ±0.1147 0.2001 ±0.1721

Baia das Mos 0.0797 ±0.0988 0.1473 ±0.1591

Forcada 0.1144 ±0.1106 0.2061 ±0.1686

Maia 0.1225 ±0.1064 0.2219 ±0.1602

Il t-test applicato sui valori di eterozigosità (diversità genetica di Nei 1973) (Tab. 3.11) e sui valori degli indici di Shannon (Tab. 3.12) per locus trasformati in arcoseno della radice quadrata di x (Archie, 1985) ha dato significative differenze tra i campioni di Faja Grande-Baia das Mos, Forcada-Baia das Mos, Maia- Baia das Mos.

Tab. 3.11 Risultati del t-test applicato ai valori di eterozigosità

Tab. 3.12 Risultati del t-test applicato ai valori degli indici di Shannon.

Baia das Mos 0.0001** - -

Forcada 0.7122 0.0001** -

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I risultati del t-test effettuato sia su H, che su I, sul totale dei campioni, in modo tale da testare eventuali differenze significative tra le due specie, ha mostrato risultati non significativi: P=0.3508 per la diversità genetica di Nei (1973), P=0.1801 per l’indice di Shannon.

I valori di Fst di Weir e Cockerham (θ) evidenziano come i campioni

provenienti da località diverse (θs) differiscono geneticamente, mentre tale

eterogeneità non si osserva tra i campioni provenienti da isole diverse (θP)

(Tab. 3.13). Al test di permutazione con 10000 repliche, infatti, i valori di θs

risultano significativamente maggiori di zero, contrariamente a quelli di θp.

Tab. 3.13 Valori di θ, relativa deviazione standard, valori massimi

e minimi dell’intervallo di confidenza al 95% (θS=divergenza genetica tra località, θP = divergenza genetica tra isole).

L’analisi UPGMA delle distanze genetiche di Nei (1978) ha permesso la costruzione di un dendogramma in cui tutti i nodi mostrano un elevato sostegno bootstrap(>70) eccetto il terzo nodo (56) (Fig. 3.2).

F statistica S.D. Intervallo di confidenza

θS = 0.0457 0.0131 0.0229 < θS < 0.0718

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Fig. 3.2. C. stellatus. Dendogramma UPGMA. La robustezza dei nodi del dendrogramma è stata valutata mediante “bootstrapping” con 10000 repliche. (FJG= Faja Grande, BDM= Baia das Mos, FOR= Forcada, MAIA=Maia).

La matrice dei valori a coppia delle distanze genetiche (θ), calcolate con il programma TFPGA, e delle distanze geografiche utilizzate per il test di Mantel sono riportate in Tab. 3.14.

Tab. 3.14 Matrice delle distanze genetiche (θ, sotto la diagonale) e geografiche (chilometri, sopra la diagonale) per ciascuna coppia di campioni.

FJG BDM FOR MAIA

FJG ***** 365 380 620

BDM 0.0366 ***** 30 290

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Il test di Mantel non ha evidenziato la presenza di isolamento da distanza (Z= 90.9935, P= 0.2880).

Anche su C. stellatus l’analisi della varianza molecolare (AMOVA) è stata eseguita considerando tre livelli gerarchici: individui, località, isole. I risultati sono riportati nella Tab. 3.15.

Tab. 3.15 Risultati dell’analisi della varianza molecolare (AMOVA) sui campioni di C. stellatus. Valori di P calcolati con un test di permutazione (10000 repliche); gl= gradi di libertà.

Fonte della varianza gl

Componente della varianza

Percentuale

della varianza Φ-statistica P Tra isole 2 0.20396 1.94 ΦCT = 0.01944 0.5022 Tra località

all’interno delle isole 1 0.36426 3.47 ΦSC = 0.03541 <0.0001** Tra individui all’interno

delle località 111 9.92178 94.58 ΦST = 0.05417 <0.0001**

L’analisi ha attribuito il 94.58% della varianza al livello intralocalità, il 3.47% al livello interlocalità, il 1.94% tra le isole.